Tracciamento di particelle 3D per l'analisi non invasiva in vivo della dinamica dei microtubuli sinaptici nei dendriti e nelle giunzioni neuromuscolari di Drosophila

Sommario

Questo studio presenta una strategia di imaging neuronale intravitale non invasiva combinata con una nuova strategia software per ottenere un tracciamento e un'analisi automatizzati e imparziali delle dinamiche plus-end dei microtubuli (MT) in vivo nei dendriti sensoriali e nelle giunzioni neuromuscolari di Drosophila.

Abstract

I microtubuli (MT) svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo neuronale, ma rimangono molte domande sui meccanismi molecolari della loro regolazione e funzione. Inoltre, nonostante i progressi nella comprensione delle MT postsinaptiche, si sa molto meno sui contributi delle MT presinaptiche alla morfogenesi neuronale. In particolare, gli studi sulle dinamiche MT in vivo nei dendriti sensoriali di Drosophila hanno prodotto informazioni significative sul comportamento a livello di polimero. Tuttavia, le sfide tecniche e analitiche associate all'imaging dal vivo della giunzione neuromuscolare del moscerino (NMJ) hanno limitato studi comparabili sulla dinamica della MT presinaptica. Inoltre, mentre esistono molte strategie software altamente efficaci per l'analisi automatizzata delle dinamiche MT in vitro ed ex vivo, i dati in vivo spesso richiedono un input significativo da parte dell'operatore o un'analisi completamente manuale a causa del rapporto segnale/rumore intrinsecamente inferiore nelle immagini e della complessa morfologia cellulare.  Per risolvere questo problema, questo studio ha ottimizzato una nuova piattaforma software per il rilevamento automatizzato e imparziale di particelle in vivo. L'analisi multiparametrica di immagini confocali time-lapse dal vivo di MT marcate con EB1-GFP è stata eseguita sia nei dendriti che nell'NMJ di larve di Drosophila e ha riscontrato notevoli differenze nei comportamenti MT. La dinamica della MT è stata inoltre analizzata in seguito al knockdown della proteina MT-associated (MAP) dTACC, un regolatore chiave dello sviluppo delle sinapsi di Drosophila, e ha identificato cambiamenti statisticamente significativi nella dinamica della MT rispetto al tipo selvatico. Questi risultati dimostrano che questa nuova strategia per l'analisi multiparametrica automatizzata delle dinamiche MT pre e postsinaptiche a livello di polimero riduce significativamente i criteri human-in-the-loop. Lo studio mostra inoltre l'utilità di questo metodo nel rilevare comportamenti distinti della MT dopo dTACC-knockdown, indicando una possibile applicazione futura per gli screening funzionali dei fattori che regolano la dinamica della MT in vivo. Le future applicazioni di questo metodo potrebbero anche concentrarsi sul chiarimento dei comportamenti MT specifici del tipo cellulare e/o del compartimento e sull'imaging correlativo multicolore di EB1-GFP con altri marcatori cellulari e subcellulari di interesse.

Introduzione

Le cellule si organizzano per formare strutture funzionali attraverso il coordinamento dei cambiamenti intra e intercellulari attraverso la morfogenesi. Un notevole esempio di morfogenesi è lo sviluppo della struttura neuronale altamente specializzata. I neuroni mostrano una notevole polarizzazione, in cui estendono due tipi di processi strutturalmente e funzionalmente distinti, i dendriti e gli assoni¹, che possono raggiungere lunghezze immense. La complessità dello sviluppo neuronale deriva non solo dalle dimensioni dei dendriti e degli assoni, ma anche dalla difficoltà di formare le loro geometrie intricate ^2,3. La morfogenesi neuronale e le sue conseguenze nell'apprendimento e nella memoria⁴ motivano l'indagine in corso sia del suo controllo genetico che dei meccanismi biologici cellulari sottostanti. Tali meccanismi includono, ma non sono limitati a, il trasporto intracellulare della membrana e i numerosi riarrangiamenti citoscheletrici necessari per i cambiamenti nella morfologia neuronale ^1,2,3.

Gli studi sulla morfogenesi neuronale hanno prodotto una varietà di tecniche di visualizzazione avanzate. I metodi statici, come la microscopia elettronica o la microscopia a fluorescenza di sonde fisse, sono ampiamente utilizzati per eseguire analisi morfologiche e strutturali ad alta risoluzione. Tuttavia, oltre agli artefatti che sono inevitabili per qualsiasi metodo di conservazione, la visualizzazione statica non può catturare i cambiamenti dinamici che sono alla base della morfogenesi. Pertanto, molte intuizioni fondamentali hanno avuto origine dalla microscopia a fluorescenza time-lapse di tessuti viventi. I primi lavori di Lichtman e colleghi ^5,6,7 hanno utilizzato l'imaging in vivo del sistema nervoso dei mammiferi per studiare la rigenerazione/degenerazione degli assoni, l'organizzazione dei componenti sinaptici e il trasporto assonale a lungo raggio. Inoltre, gli studi seminali sugli espianti neuronali primari sono stati fondamentali per stabilire l'importanza della dinamica dei microtubuli (MT) per l'allungamento e la motilità assonale ^8,9. Fondamentalmente, i primi studi di espianti neuronali hanno stabilito l'uso di proteine della famiglia legante le estremità (EB) marcate in fluorescenza per ottenere informazioni preziose sulle dinamiche più-estremità della MT nello sviluppo dei neuroni a livello dei singoli polimeri MT¹⁰. Questi studi sono nati dall'osservazione che il membro della famiglia EB EB1 si localizza preferenzialmente in MT più estremit๹ in S. cerevisiae¹² e in cellule in coltura¹³. Da allora, EB1 e altre proteine di tracciamento della punta (+TIP)^14,15 sono state ampiamente utilizzate in studi in vivo sull'instabilità dinamica della MT¹⁶, anche nel contesto dello sviluppo neuronale¹⁷.

Drosophila è un potente modello per studi di imaging in vivo della dinamica MT durante lo sviluppo neuronale grazie ai vasti strumenti genetici e di imaging disponibili per gli studi sui moscerini^18,19 e alle somiglianze nella struttura e nella funzione tra Drosophila e i neuroni dei vertebrati¹. Uno studio precoce chiave della giunzione neuromuscolare (NMJ) delle larve di Drosophila ha eseguito l'imaging ripetuto non invasivo di un marcatore di membrana fluorescente attraverso la cuticola traslucida di animali intatti per documentare la morfogenesi terminale presinaptica²⁰. Utilizzando un metodo simile per l'imaging di larve di Drosophila intere e vive, è stata fornita una dimostrazione iniziale dell'analisi subcellulare a livello di particelle del movimento processivo dei carichi motori negli assoni²¹. Più recentemente, studi meticolosi di Rolls e colleghi sui dendriti sensoriali delle larve intatte di Drosophila 22,23,24,25,26,27 hanno caratterizzato la dinamica postsinaptica MT plus-end eseguendo il tracciamento delle particelle e l'analisi di EB1 marcata con proteina fluorescente verde (GFP). Tali studi su Drosophila 22,23,24,25,26,27 e altri sistemi 28,29,30,31,32 hanno fatto progredire significativamente la comprensione del comportamento del singolo polimero della MT più le estremità nei dendriti dei neuroni in via di sviluppo 33.

Nonostante gli impressionanti studi in vivo sulla dinamica postsinaptica della MT 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, ci sono stati molti meno studi comparabili sulla dinamica presinaptica della MT al terminale dell'assone in via di sviluppo. La dinamica della MT presso la larva di Drosophila NMJ è stata studiata utilizzando la microscopia a macchie fluorescenti (FSM) e il recupero della fluorescenza dopo fotosbiancamento (FRAP)³⁴. Queste tecniche valutano la cinetica complessiva della tubulina, ma non il comportamento delle singole estremità più MT. Al momento della stesura di questo articolo, c'è stata un'unica indagine sulle singole MT plus ends presso il NMJ di Drosophila: questo studio ha combinato l'imaging time-lapse dal vivo con l'analisi manuale dei chimografi per caratterizzare una popolazione di MT dinamici, etichettati EB1-GFP come "pionieristici" che apparivano distinti da una popolazione più ampia di MT stabilizzati³⁵. Questa mancanza di ricerca sulla dinamica della MT presinaptica può essere dovuta almeno in parte all'anatomia: mentre è relativamente semplice ottenere immagini di dendriti a causa della loro vicinanza alla cuticola larvale, le NMJ sono ostruite da altri tessuti, rendendo difficile l'acquisizione di immagini con un rapporto segnale/rumore sufficiente per l'analisi a livello di particelle. Tuttavia, data l'importanza ben consolidata delle MT presinaptiche per la morfogenesi e la stabilizzazione sinaptica³⁶, nonché i loro legami con i disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativi³⁷, è probabile che colmare questo divario tra la comprensione delle MT pre- e postsinaptiche produca intuizioni preziose.

Un'ulteriore sfida per l'analisi delle dinamiche MT in vivo in generale, a differenza dell'analisi in vitro o ex vivo, è rappresentata dai limitati strumenti software automatizzati in grado di estrarre parametri dinamici da dati in vivo. Attualmente, una delle tecniche più popolari e potenti per l'analisi delle estremità positive MT marcate +TIP è plusTipTracker^38,39, un software basato su MATLAB che consente il tracciamento e l'analisi automatizzati di più parametri dinamici. In particolare, plusTipTracker misura non solo la crescita della traduzione automatica, ma anche il restringimento e i salvataggi: mentre le etichette +TIP come EB1-GFP si associano solo a fini positivi crescenti, plusTipTracker può dedurre algoritmicamente i tassi di contrazione e gli eventi di salvataggio. Tuttavia, mentre plusTripTracker è stato applicato con successo a molti contesti, tra cui la precedente analisi multiparametrica delle dinamiche MT ex vivo nelle cellule S2 di Drosophila⁴⁰, plusTipTracker non è ottimale per l'analisi di dati in vivo a causa del loro rapporto segnale/rumore inferiore. Di conseguenza, gli studi in vivo sulla dinamica plus-end ai dendriti 22,23,24,25,26,27 e all'NMJ³⁵ di Drosophila si sono basati sulla generazione manuale e sull'analisi dei chimografi utilizzando software come ImageJ⁴¹, o su strategie semiautomatizzate che coinvolgono numerosi componenti human-in-the-loop.

Questo studio presenta un flusso di lavoro sperimentale e analitico che riduce il sovraccarico sperimentale e analitico necessario per eseguire analisi non invasive a livello di polimero delle dinamiche MT presinaptiche sia nei dendriti sensoriali che nel terminale dell'assone motorio delle larve di terzo stadio di Drosophila. Il protocollo utilizza larve immobilizzate e intatte e quindi evita lesioni note per innescare risposte allo stress, nonché altre condizioni non fisiologiche che potrebbero perturbare la dinamica della MT in vivo. Per marcare i plus-end MT dinamici, EB1-GFP è espresso a livello pan-neuronale utilizzando il sistema Gal4/UAS ⁴², consentendo la visualizzazione di MT sia ai dendriti che all'NMJ con un singolo driver. Mentre alcune fasi iniziali sono inevitabilmente soggette al processo decisionale umano, come la selezione di esemplari animali e l'identificazione delle regioni da visualizzare, le fasi successive all'acquisizione dei dati sono in gran parte automatizzate. Fondamentalmente, l'ottimizzazione di un nuovo software ha consentito un'analisi automatizzata e imparziale che richiede un intervento umano minimo. Mentre altri metodi di tracciamento delle particelle sono disponibili 43,44,45, questo studio utilizza un software proprietario perché era algoritmicamente adatto ad affrontare le sfide particolari di questo particolare set di dati. Il software è ora disponibile per gli utenti per una varietà di applicazioni. In particolare, l'uso del filtraggio della diffusione che migliora la coerenza⁴⁶ è parte integrante della segmentazione automatizzata e della rimozione dello sfondo, e algoritmi personalizzati sono implementati specificamente per automatizzare il rilevamento e il tracciamento delle particelle. Questa strategia potrebbe gestire efficacemente il basso rapporto segnale/rumore inerente ai dati di questo studio, così come altre sfide, come il movimento delle comete EB1-GFP attraverso diversi piani focali. Sebbene non sia possibile testare in modo esaustivo le prestazioni di questo software rispetto a tutti gli altri software di analisi delle particelle, le prestazioni della presente strategia hanno eguagliato o si sono avvicinate alle prestazioni umane standard. Inoltre, per quanto ne sanno gli autori, non è stato addestrato nessun altro software specificamente addestrato su dati in vivo provenienti da dendriti sensoriali e dal terminale presinaptico. Dato che le prestazioni degli algoritmi di analisi delle immagini sono spesso altamente specifiche per i dati per cui sono stati progettati e che la visione artificiale generalizzata non è ancora possibile, ci si aspetta che l'addestramento del software descritto ai dati in vivo specifici di interesse sia l'approccio più valido dal punto di vista algoritmico.

Dato l'ampio lavoro sui dendritici MT 22,23,24,25,26,27 e la qualità costante dei dati che possono essere acquisiti da questo sistema, la strategia di acquisizione delle immagini e di analisi del software è stata convalidata per la prima volta nei dendriti sensoriali di Drosophila. È importante sottolineare che è stato riscontrato nei dendriti che l'uso di diversi driver Gal4 neuronali, anche in background di tipo selvatico altrimenti identici, si traduce in differenze significative nella dinamica EB1-GFP a causa di differenze nel background genetico, sottolineando l'importanza di utilizzare un singolo driver Gal4 per risultati coerenti. Questa strategia è stata successivamente utilizzata per l'analisi multiparametrica della dinamica EB1-GFP al terminale presinaptico del NMJ. Per illustrare ulteriormente il valore investigativo di questo metodo, questa strategia di imaging e software è stata utilizzata per valutare la dinamica pre- e postsinaptica di EB1-GFP a seguito di knockdown di dTACC, l'omologo di Drosophila della famiglia TACC (transforming acidic coiled coil) altamente conservata^47,48. Precedenti lavori sulle cellule^{S2 40} di Drosophila, così come il lavoro di Lowery e colleghi sul cono di crescita^{Xenopus 49,50,51}, hanno dimostrato che i membri della famiglia TACC regolano le dinamiche più o meno MT. Inoltre, le prove recentemente riportate dall'imaging confocale e in immunofluorescenza a super-risoluzione hanno dimostrato che il dTACC è un regolatore chiave delle MT presinaptiche durante la morfogenesi neuronale⁵², sollevando la questione se dTACC regoli la dinamica della MT in tempo reale. Questo rapporto dimostra un metodo in grado di rilevare le differenze nei comportamenti di traduzione automatica in tempo reale al momento dell'abbattimento di dTACC. Pertanto, questo studio presenta un metodo in vivo in grado di identificare e caratterizzare efficacemente i regolatori chiave della dinamica della MT all'interno del neurone in via di sviluppo, in particolare nel compartimento presinaptico.

Protocollo

1. Generazione di esemplari di Drosophila

1. Selezionare un marcatore MT plus-end adatto. Questo studio ha utilizzato EB1 marcato con GFP, un marcatore di estremità positiva ben caratterizzato con un segnale forte e chiaro^11,12. Le alternative includono altri +TIP come EB3^10,13, CLASP/Orbit⁵³ e CLIP-170⁵⁴.
2. Ottenere o generare mosche con il marcatore MT sotto il controllo di un promotore UAS (ad esempio, UAS-EB1-GFP).
3. Scegliere il driver Gal4 tessuto-specifico appropriato. Questo studio ha utilizzato il driver pan-neuronale elaV-Gal4^58,59 per guidare l'espressione sia nei dendriti sensoriali che all'NMJ e 221-Gal4^60,61 per l'espressione specifica dei dendriti.
4. Alleva mosche usando tecniche standard di allevamento delle mosche ^55,56. Si raccomanda di conservare le mosche in incubatrici umidificate a 25 °C per un'espressione ottimale di Gal4/UAS.
5. Utilizzando tecniche genetiche standard di mosca^55,56, eseguire incroci per generare mosche per esprimere il marcatore MT plus-end nelle cellule/tessuti desiderati.
   NOTA: Per qualsiasi combinazione Gal4-driver e -transgene, il disegno sperimentale dovrebbe includere esperimenti di proof-of-concept e validazione per caratterizzare il sistema ed evitare artefatti da sovraespressione.

2. Configurazione dell'attrezzatura

1. Allestire una postazione di lavoro, comprendente le mosche, i reagenti anestetici, i materiali di costruzione dei vetrini, lo stereomicroscopio e la sorgente di illuminazione, vicino al microscopio confocale (cioè nella stessa stanza) per ridurre al minimo il tempo trascorso tra la preparazione del campione e l'imaging per prolungare la salute e la vitalità delle larve.
2. Preparare l'anestetico mescolando una miscela di cloroformio al 9% (0,1 mL di cloroformio e 1,0 mL di olio di alocarburi) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Per evitare la separazione, mescolare bene capovolgendo il tubo prima di preparare ogni nuovo vetrino.
3. Preparare il vetrino: Tagliare quattro strisce di nastro biadesivo (~15 mm di larghezza). Allinea due dei pezzi sul vetrino, lasciando uno spazio di ~5 mm tra le strisce. Sovrapporre i due pezzi rimanenti sopra i primi due per raddoppiare lo spessore del nastro (Figura 1C).
4. Aggiungere una grossa goccia (~100 μL) di miscela di cloroformio/olio sul vetrino nello spazio di 5 mm tra i pezzi di nastro (Figura 1C).

3. Preparazione di campioni larvali per l'imaging

1. Riempire un contenitore (ad es. una piastra a 6 pozzetti) con 1x PBS.
2. Raccogli le larve del 3^° stadio dalla fiala di mosca usando una pinza o uno strumento simile. Identifica le larve allo stadio corretto dal loro comportamento strisciante e dalla presenza di 9-12 ganci a bocca seghettati prominenti. Utilizzare uno stereomicroscopio per assistere nella stadiazione delle larve (Figura 1D).
3. Metti una larva nel PBS e muovila delicatamente per lavare via eventuali resti di cibo o altri detriti. Asciugare delicatamente la larva su un fazzoletto delicato.
4. Anestetizzare la larva mettendola in una goccia di cloroformio/olio sul vetrino della sezione 2 (Figura 1C).
   NOTA: L'orientamento dorsale/ventrale della larva non è critico perché sia i neuroni sensoriali che quelli motori possono essere rilevati attraverso la cuticola traslucida impostando il tavolino del microscopio sul piano focale corretto, indipendentemente dall'orientamento del campione.
5. Metti un vetrino coprioggetti #1.5 sopra. Far aderire il vetrino coprioggetti al nastro esercitando una leggera pressione, immobilizzando così la larva senza danneggiarla (Figura 1C).
6. Sigillare la camera con vaselina o smalto per unghie.

4. Imaging confocale time-lapse di campioni vivi

1. Preparare il microscopio confocale e l'obiettivo 60x con immersione in olio. Posizionare il campione sul tavolino (Figura 1A, B).
2. Utilizzare il software di acquisizione per configurare gli esperimenti.
   NOTA: Per questo studio, ogni serie di immagini è stata acquisita su un singolo piano focale anziché su uno z-stack.
   1. Impostare la durata del time-lapse su 30 s a un intervallo di 2 s, per un totale di 16 fotogrammi.
   2. Imposta l'esposizione e l'intensità del laser per garantire un segnale sufficiente evitando la saturazione e il fotosbiancamento.
   3. Per l'imaging EB1-GFP, il laser a 488 nm è stato impostato su un tempo di esposizione di 100 ms e un'intensità del 30%. Questi valori possono variare a seconda dei diversi usi di questo protocollo e devono essere modificati empiricamente.
3. Utilizzare gli oculari del microscopio per trovare la larva in un'illuminazione verde a campo largo. Trova i dendriti o NMJ regolando lentamente lo stadio. Non esporre la larva all'illuminazione (a campo largo o confocale) più a lungo del necessario.
   1. I dendriti appaiono come sottili ragnatele nervose di colore verde brillante facilmente distinguibili da spessi fasci di assoni lunghi (Figura 1E).
   2. Gli NMJ appaiono come gruppi di singoli bottoni verde brillante, di circa 5 μm di diametro, alle estremità di spessi fasci di assoni lunghi che divergono dal cordone nervoso (Figura 1F).
4. Utilizzando il feed live della telecamera, è possibile mettere a fuoco rapidamente la regione di interesse utilizzando l'illuminazione a 488 nm. Interrompere immediatamente l'illuminazione una volta trovata la messa a fuoco corretta per evitare fototossicità.
5. Avviare l'acquisizione dell'immagine. Le comete EB1 sono riconoscibili come punti luminosi e mobili.
6. Fare riferimento ai protocolli pubblicati in precedenza per ulteriori dettagli e linee guida sull'imaging live a fluorescenza⁵⁷.

5. Elaborazione e analisi delle immagini basate su software

1. Analizza ogni file video individualmente. All'interno del software (interfaccia utente mostrata nella Figura 2), selezionare File | Importazione | Sequenza di immagini e trascina i file TIF nella casella che appare. Visualizza l'anteprima del video.
2. Nel menu Parametri di rilevamento , regolare i parametri del software per garantire il rilevamento solo di punti chiaramente visibili ed evitare il rilevamento di oggetti spuri. Ad esempio, la riduzione dell'intensità delle particelle comporta una maggiore sensibilità del software ai punti, ma aumenta i potenziali falsi positivi. I valori precisi dei parametri variano empiricamente. Le descrizioni dei parametri di rilevamento e tracciamento sono disponibili presso gli autori su richiesta.
3. Applicare la ricetta Tracciamento particelle Neuron per analizzare l'immagine utilizzando il pulsante Dall'inizio (freccia blu, Figura 2B). Il software emetterà i risultati per i parametri di tracciamento elencati nella Tabella 1 nel foglio di calcolo dei risultati (riquadro verde, Figura 2B). Per facilitare l'analisi e l'interpretazione successive, i risultati possono essere memorizzati in un software per fogli di calcolo utilizzando la funzione di esportazione che si trova nella sezione Foglio di calcolo dei risultati .
4. Sposta il cursore fino al punto rilevato nel passaggio precedente e fai clic con il pulsante sinistro del mouse per selezionare o deselezionare. È possibile selezionare più punti contemporaneamente utilizzando Ctrl + clic sinistro.
   NOTA: A seconda degli obiettivi e delle applicazioni del progetto, possono essere utilizzate euristiche aggiuntive per filtrare i punctae. Ad esempio, i punctae con una durata inferiore a 8-10 s (4-5 fotogrammi) potrebbero essere omessi perché non presentano informazioni sufficienti sull'intero evento di crescita. La necessità di tali euristiche varierà empiricamente. Ulteriori dettagli sulle funzionalità del software sono disponibili presso gli autori su richiesta.

Risultati

I moscerini sono stati allevati da stock stabili che esprimono costitutivamente il transgene UAS-EB1-GFP sia a livello panneuronale (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)^58,59 o nei neuroni sensoriali (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)^60,61. EB1 è stato scelto per questo studio perché si localizza specificamente alle estremità in crescita e si dissocia immediatamente dopo la pausa e il re...

Discussione

Questo articolo discute un protocollo per eseguire l'imaging intravitale non invasivo della dinamica MT nei dendriti e all'NMJ durante lo sviluppo. L'input umano è richiesto durante le fasi sperimentali, ad esempio nella selezione degli animali da riprodurre, e può introdurre distorsioni nel processo di raccolta dei dati che non possono essere ragionevolmente rimosse. Pertanto, un obiettivo chiave del protocollo è quello di ridurre al minimo le distorsioni, ove possibile, eseguendo anali...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL	Eppendorf	21008-959	Preparazione del campione
1000 & micro; L TipOne puntali per pipette	USA Scientific	1111-2721	Preparazione del campione
200 &; L TipOne puntali per pipette	USA Scientific	1120-8710	Preparazione del campione
221-Gal4 mosche	Bloomington Drosophila Stock Center (US)	26259	Drosophila genetica/incroci
60x Obiettivo Lente	Nikon	Plan Apo 60x Olio	Acquisizione di immagini
Piastra a 6 pozzetti	BD Falcon	353224	Preparazione del campione
Agar	MoorAgar	41084	Cibo per Drosophila
Aivia	DRVision LLC		Ottimizzato nell'ambito di questo studio
Cloroformio (stabilizzato con amilene)	Sigma-Aldrich	C2432	Preparazione del campione
Pistola ad aria compressa CO2 (per la selezione di mosche per incroci)	Genesee	54-104	Genetica di Drosophila/incroci
Bubbler CO2 (per la selezione di mosche per incroci)	Genesee	59-180	Genetica/incroci di Drosophila
Telecamera CCD raffreddata	Hamamatsu	ORCA-R2	Acquisizione immagini
Farina di mais	Genesee	62-101	Cibo per Drosophila
Acqua			Cibo per Drosophila
Nastro biadesivo	Scotch		Preparazione del campione
Fiale di Drosophila	Genesee	32-109	Cibo per Drosophila
Tappi per drosophila (tappi in schiuma per fiale)	Genesee	59-200	Drosophila cibo
Dumont #5 Biologie Inox Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Preparazione del campione
elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 mosche	Dono di Melissa Rolls (Penn State University)	N/A	Drosophila genetica/incroci
Etanolo (95%)	VWR	75811-022	Drosophila food
Illuminatore/sorgente luminosa in fibra ottica per stereomicroscopio	Nikon	NI-150	Preparazione del campione
Flypad (per la selezione di mosche per incroci)	Genesee	59-172	Drosophila genetica/incroci
Forma Camera Ambientale/Incubatore	ThermoFisher	3940	Drosophila genetica/croci
Olio di alocarburi 700	Sigma-Aldrich	H8898	Preparazione del campione
Olio da immersione	Nikon	MXA22168	Acquisizione di immagini
Kimwipe Delicate Wipes	Fisher Scientific	34120	Preparazione del campione
Modulo di fusione laser Spectral	Ricerca applicata	LMM-5	Acquisizione di immagini
Sorgente luminosa per confocale	Lumencor	SOLA 54-10021	Acquisizione di immagini
Microscopia MetaMorph Automazione e Software di analisi delle immagini	Dispositivi molecolari Acquisizione		delle immagini
Occhiali Micro Cover, quadrati, n. 1 1/2 (#1.5)	VWR	48366-205	Preparazione dei campioni
Microscopio invertito motorizzato con sistema di messa a fuoco perfetta	Nikon	TI-ND6-PFS-S	Acquisizione delle immagini
Tavolino e otturatori motorizzati	Acquisizione delle	immagini
precedente al Proscan IIIForbici multiuso	Scotch	MMM1428	Preparazione del campione
Smalto per unghie	Sally Hansen	784179032016 074170382839	Preparazione del campione
Filtro ottico	Chroma	ET480/40m	Acquisizione immagini
P1000 Pipetman	Gilson	F123602	Preparazione del campione
P200 Pipetman	Gilson F123601		Preparazione del campione
PBS (10X) ph 7.4	ThermoFisher	70011044	Preparazione del campione
Acido propionico	Fisher	A258-500	Drosophila food
Unità scanner confocale a disco rotante	Yokagawa	CSU-X1	Acquisizione immagini
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ800N	Preparazione del campione
Zucchero (Saccarosio)	Genesee	62-112	Drosophila food
Superfrost Slide	VWR	48311-600	Preparazione del campione
Tegosept	Genesee	20-258	Drosophila
food UAS-dtacc-RNAi mosche	Vienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria)	VDRC-101439	Drosophila genetics/incroci
Vaselina vaselina	WB Mason	DVOCB311003	Preparazione
del campioneWinsor & Newton Brush Regency Gold 520, Misura 0	Graffe	5012000	Drosophila genetica/incroci
Lievito	VWR	Torula Lievito IC90308580	Drosophila food
Yokogawa dicroico beamsplitter	Semrock	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Acquisizione immagini