Tracciamento di particelle 3D per l'analisi non invasiva in vivo della dinamica dei microtubuli sinaptici nei dendriti e nelle giunzioni neuromuscolari di Drosophila

Vivian  T. Chou; Hunkar  Gizem Yesilyurt; Hoyin Lai; Jennifer B. Long; Mercedes Arnes; Kamal Obbad; Michael Jones; Hideki Sasaki; Luciano  A.G. Lucas; Sam Alworth; James  Shih-Jong Lee; David Van Vactor

doi:10.3791/61159

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Articolo metodologico

Tracciamento di particelle 3D per l'analisi non invasiva in vivo della dinamica dei microtubuli sinaptici nei dendriti e nelle giunzioni neuromuscolari di Drosophila

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DOI:

10.3791/61159

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12 maggio 2020

Vivian T. Chou^*¹ , Hunkar Gizem Yesilyurt^*¹ , Hoyin Lai^*² , Jennifer B. Long¹ , Mercedes Arnes¹ , Kamal Obbad¹ , Michael Jones² , Hideki Sasaki² , Luciano A.G. Lucas² , Sam Alworth² , James Shih-Jong Lee² , David Van Vactor¹

¹Blavatnik Institute of Cell Biology and Program in Neuroscience, Harvard Medical School, ²DRVision Technologies LLC

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio presenta una strategia di imaging neuronale intravitale non invasiva combinata con una nuova strategia software per ottenere un tracciamento e un'analisi automatizzati e imparziali delle dinamiche plus-end dei microtubuli (MT) in vivo nei dendriti sensoriali e nelle giunzioni neuromuscolari di Drosophila.

Abstract

I microtubuli (MT) svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo neuronale, ma rimangono molte domande sui meccanismi molecolari della loro regolazione e funzione. Inoltre, nonostante i progressi nella comprensione delle MT postsinaptiche, si sa molto meno sui contributi delle MT presinaptiche alla morfogenesi neuronale. In particolare, gli studi sulle dinamiche MT in vivo nei dendriti sensoriali di Drosophila hanno prodotto informazioni significative sul comportamento a livello di polimero. Tuttavia, le sfide tecniche e analitiche associate all'imaging dal vivo della giunzione neuromuscolare del moscerino (NMJ) hanno limitato studi comparabili sulla dinamica della MT presinaptica. Inoltre, mentre esistono molte strategie software altamente efficaci per l'analisi automatizzata delle dinamiche MT in vitro ed ex vivo, i dati in vivo spesso richiedono un input significativo da parte dell'operatore o un'analisi completamente manuale a causa del rapporto segnale/rumore intrinsecamente inferiore nelle immagini e della complessa morfologia cellulare. Per risolvere questo problema, questo studio ha ottimizzato una nuova piattaforma software per il rilevamento automatizzato e imparziale di particelle in vivo. L'analisi multiparametrica di immagini confocali time-lapse dal vivo di MT marcate con EB1-GFP è stata eseguita sia nei dendriti che nell'NMJ di larve di Drosophila e ha riscontrato notevoli differenze nei comportamenti MT. La dinamica della MT è stata inoltre analizzata in seguito al knockdown della proteina MT-associated (MAP) dTACC, un regolatore chiave dello sviluppo delle sinapsi di Drosophila, e ha identificato cambiamenti statisticamente significativi nella dinamica della MT rispetto al tipo selvatico. Questi risultati dimostrano che questa nuova strategia per l'analisi multiparametrica automatizzata delle dinamiche MT pre e postsinaptiche a livello di polimero riduce significativamente i criteri human-in-the-loop. Lo studio mostra inoltre l'utilità di questo metodo nel rilevare comportamenti distinti della MT dopo dTACC-knockdown, indicando una possibile applicazione futura per gli screening funzionali dei fattori che regolano la dinamica della MT in vivo. Le future applicazioni di questo metodo potrebbero anche concentrarsi sul chiarimento dei comportamenti MT specifici del tipo cellulare e/o del compartimento e sull'imaging correlativo multicolore di EB1-GFP con altri marcatori cellulari e subcellulari di interesse.

Introduzione

Le cellule si organizzano per formare strutture funzionali attraverso il coordinamento dei cambiamenti intra e intercellulari attraverso la morfogenesi. Un notevole esempio di morfogenesi è lo sviluppo della struttura neuronale altamente specializzata. I neuroni mostrano una notevole polarizzazione, in cui estendono due tipi di processi strutturalmente e funzionalmente distinti, i dendriti e gli assoni¹, che possono raggiungere lunghezze immense. La complessità dello sviluppo neuronale deriva non solo dalle dimensioni dei dendriti e degli assoni, ma anche dalla difficoltà di formare le loro geometrie intricate<....