Articolo metodologico

Blocco del flusso linfatico mediante la sutura di vasi linfatici afferenti nei topi

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DOI:

10.3791/61178

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14 maggio 2020

 ,  , 
1Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin Medical University, 2Inflammation Research Network, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Snyder Institute for Chronic Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un protocollo per bloccare il flusso linfatico mediante sutura chirurgica di vasi linfatici afferenti.

Abstract

I vasi linfatici sono fondamentali per mantenere l'equilibrio dei fluidi tissutali e ottimizzare la protezione immunitaria trasportando antigeni, citochine e cellule ai linfonodi drenante (LN). L'interruzione del flusso linfatico è un metodo importante quando si studia la funzione dei vasi linfatici. I vasi linfatici afferenti dal pedana murina ai linfonodi poplitei (PLN) sono ben definiti come le uniche vie per il drenaggio linfatico nei PLN. Suturare questi vasi linfatici afferenti può prevenire selettivamente il flusso linfatico verso i PLAN. Questo metodo consente l'interferenza nel flusso linfatico con danni minimi alle cellule endoteliali linfatiche nel pLN drenante, nei vasi linfatici afferenti e in altri vasi linfatici intorno all'area. Questo metodo è stato utilizzato per studiare come la linfa influisce sulle alte venule endoteliali (HEV) e sull'espressione della chemiochina nella LN e su come la linfa fluisce attraverso il tessuto adiposo che circonda la LN in assenza di vasi linfatici funzionali. Con il crescente riconoscimento dell'importanza della funzione linfatica, questo metodo avrà applicazioni più ampie per svelare ulteriormente la funzione dei vasi linfatici nella regolazione del microambiente LN e delle risposte immunitarie.

Introduzione

L'organizzazione spaziale del sistema linfatico fornisce supporto strutturale e funzionale per rimuovere in modo efficiente il fluido extracellulare e trasportare antigeni e cellule che presentano antigeni (APC) nelle LN drenante. I vasi linfatici iniziali (chiamati anche capillari linfatici) sono altamente permeabili a causa delle loro giunzioni intercellulari discontinue, che facilitano l'efficace raccolta di fluidi, cellule e altri materiali dagli spazi extracellularicircostanti 1. I vasi linfatici iniziali si fondono nella raccolta di vasi linfatici, che hanno strette giunzioni intercellulari, una membrana basale continua e una copertura muscolare linfatica. La raccolta dei vasi linfatici è responsabile del trasporto della linfa raccolta nelle LN drenante e, infine, del ritorno della linfa allacircolazione 2,3. I vasi linfatici di raccolta che spingono la linfa nella LN drenante sono i vasi linfatici afferenti4,5,6,7. L'ostruzione dei vasi linfatici afferenti può bloccare il flusso linfatico nelle LN, che è una tecnica utile quando si studia la funzione del flusso linfatico.

Studi precedenti hanno dimostrato che il flusso linfatico svolge un ruolo significativo nel trasporto di antigeni e APC, oltre a mantenere l'omeostasi LN. È ben noto che le APC derivate dai tessuti, tipicamente attivate dalle cellule dendritiche migratorie (IC), viaggiano attraverso i vasi linfatici afferenti fino alla LN per attivare le cellule T8. L'idea che gli antigeni in forma libera, come microbi o antigeni solubili, fluiranno passivamente con la linfa verso l'LN per attivare gli APC residenti in LN ha ottenuto l'accettazione nell'ultimo decennio9,10,11,12. Gli antigeni in forma libera che viaggiano con la linfa prendono minuti dopo l'infezione per viaggiare verso l'LN e l'attivazione cellulare residente in LN può verificarsi entro 20 minuti dopo la stimolazione. Questo è molto più veloce dell'attivazione dei PC di migrazione, che richiede più di 8 ore per entrare nell'LN9 drenante. Oltre a trasportare antigeni per avviare la protezione immunitaria, la linfa trasporta anche citochine e TC nella LN per mantenere il suo microambiente e sostenere l'omeostasi delle celluleimmunitarie 13,14. In precedenza, il blocco del flusso linfatico suturando i vasi linfatici afferenti ha dimostrato che la linfa è necessaria per mantenere il fenotipo HEV necessario per sostenere la cellula T omeostatica e l'homing cellulare B all'LN15,16,17. CCL21 è una chemiochina critica che dirige il posizionamento delle celle DC e T nell'LN8,18. Il blocco del flusso linfatico interrompe l'espressione CCL21 nell'LN e potenzialmente interrompe il posizionamento e/o l'interazione delle cellule DC e T nell'LN19. Pertanto, il blocco del flusso linfatico può abrogare direttamente o indirettamente l'accesso all'antigene /DC all'LN drenante interrompendo il microambiente LN che regola le risposte immunitarie nella LN. Per studiare meglio la funzione del flusso linfatico, viene presentato un protocollo sperimentale (figura 1) per bloccare il flusso linfatico nei topi suturando i vasi linfatici afferenti dal pLN al pLN. Questo metodo può essere una tecnica importante per futuri studi sulla funzione linfatica in condizioni sane e masticate.

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Protocollo

Tutto il lavoro sugli animali deve essere approvato dal comitato istituzionale e governativo per l'etica e la gestione degli animali.  Questo è un intervento di non sopravvivenza.

1. Preparazione dei materiali

  1. Preparare 100 mL di etanolo al 70% mescolando 70 mL di etanolo al 100% con 30 mL di acqua sterile. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico e mantenere gli strumenti in etanolo al 70% prima e durante l'intervento chirurgico per mantenere la sterilizzazione.
  2. Preparare un apparato di iniezione.
    1. Tagliare ~30 cm di tubi in polietilene (0,28 mm di diametro). Collegare la punta di un ago 30 G x 1/2 (ago A) a un'estremità del tubo di polietilene. Rimuovere con cura un altro ago da 30 G x 1/2 (ago B) e collegare il lato rotto all'altra estremità dei tubi in polietilene.
    2. Attaccare l'ago A a una siringa tubercocina da 1 ml.
      NOTA: Per questo tubo di polietilene, 1,6 cm di fluido nel tubo corrispondono a 1 μL20.
  3. Preparare una miscela 10:1 chetamina/xiazina (10 mg/mL di ketamina e 1 mg/mL di xiazina) in salina (batteriostatica 0,9% [w/v] cloruro di sodio). Preparare la soluzione appena prima dell'uso.

2. Preparazione dell'animale per l'intervento chirurgico

NOTA: Utilizzare topi di età compresa tra 6 e 10 settimane. Possono essere utilizzati topi sia femmine che maschi. In questo studio sono stati usati topi femmine di 6−10 settimane, C57BL/6. Questo metodo può essere adattato per altri ceppi di topi.

  1. Anestetizzare il topo iniettando 250 μL della miscela chetamina/xiazina per via intraperitoneale. Attendere che il mouse sia completamente addormentato. Assicurarsi che il mouse non reagisca a un dito del dito per rilevare l'anestesia completa.
  2. Radere la pelliccia intorno alle gambe con le tosaerba.
  3. Applicare la crema depilatoria intorno alla gamba e attendere 5 minuti. Pulire la pelliccia residua e la crema depilatoria utilizzando un tessuto umido e pulire la gamba con acqua sterile. Spruzzare il 70% di etanolo intorno alla gamba per sterilizzare l'area operativa. L'etanolo è limitato al sito di incisione.

3. Sutura chirurgica di vasi linfatici afferenti

NOTA: La gamba destra è suturata e la gamba sinistra viene utilizzata come controllo fittizio. Il protocollo di sutura linfatica (passaggi 3.1−3.8) richiede 20−30 min.

  1. Mantenere il mouse in una posizione soggetta a protezione e fissarlo con nastro chirurgico per esporre l'area operativa sulla gamba destra.
  2. Iniettare intradermally 5 μL di 1% di colorante blu Evans o 9 cm del fluido dell'apparato di iniezione tubando nel pedane. Massaggiare delicatamente il pedana per aiutare Evans blu ad entrare nei vasi linfatici.
    NOTA: La siringa per insulina non è facile da controllare per l'iniezione di piccolo volume. Il volume può essere controllato in modo più accurato utilizzando l'apparato di iniezione. I vasi linfatici sono visualizzati da colorante blu sotto la pelle. Con un ampio addestramento, entrambi i vasi linfatici afferenti possono essere visti ad occhio nudo come vasi trasparenti nel tessuto adiposo, parallelamente all'arteria safenosa. Con un ampio addestramento, è possibile suturare i vasi senza iniettare colorante Evans Blue nei casi in cui ci siano preoccupazioni di potenziali disturbi dal colorante.
  3. Al microscopio sezionato, scegliere un sito di incisione a 5 mm dal bordo inferiore della fossa poplitea. Fai una piccola incisione (~ 5 mm) nella pelle con le forbici. Utilizzando forcep di funzionamento fine, allungare l'incisione ed esporre i vasi linfatici di raccolta (Figura 1A).
    NOTA: Se necessario, un piccolo frammento di pelle può essere rimosso per esporre i vasi linfatici.
  4. Identificare entrambi i recipienti linfatici afferenti che portano ai pLN al microscopio di sezionazione (figura 1B).
    NOTA: Ci sono due vasi linfatici afferenti dal footpad al pLN. Entrambi devono essere suturati per bloccare completamente il flusso linfatico.
  5. Utilizzando un portaaghi, inserire con cautela l'ago da sutura (0,7 metrico o più piccolo) tra il vaso linfaticofferente e l'arteria safenosa ed estrarre delicatamente l'ago intorno al vaso linfaticofferente. Tirare delicatamente la corda di sutura e lasciare circa 2 cm della corda di sutura alle spalle. Utilizzare il supporto dell'ago per legare saldamente la corda per suturare un vaso linfatico con un nodo del chirurgo (Figura 1C).
    NOTA: Il tessuto sotto l'incisione può asciugarsi con esposizione prolungata all'aria. Rendere l'incisione il più piccola possibile ed eseguire rapidamente la sutura (cioè entro 5 minuti) impedirà al tessuto di asciugarsi. Mantenere l'umidità del tessuto applicando un piccolo volume di soluzione salina con un batuffolo di cotone.
  6. Massaggiare delicatamente il footpad per assicurarsi che nessuna tintura Evans Blue passi il sito di sutura e quindi tagliare la corda in eccesso con le forbici.
  7. Eseguire gli stessi passaggi di sutura (cioè i passaggi 3.5 e 3.6) sull'altro vaso linfaticofferente(Figura 1D). Chiudere l'incisione cutanea con la stessa sutura utilizzata per suturare i vasi nel passaggio 3.5 (Figura 1E).
  8. Per il controllo fittizio, iniettare intradermally 5 μL di 1% di colorante blu Evans sul pedana sinistro e massaggiare il footpad per visualizzare i vasi linfatici. Aprire la pelle con un'escissione e quindi chiudere la ferita senza suturare il vaso (Figura 1F).
  9. Opzionalmente, monitorare i topi azionati per 2−4 h. Il lato sutura della gamba dovrebbe mostrare edema con Evans Blue diffuso alla coscia, mentre la gamba di controllo mostrerà una tinta blu Evans limitata nel footpad. Se i topi si risvegliano, verrà iniettato un ulteriore mix di ketamina/xiazina per mantenere l'anestesia fino all'eutanasia.

4. Tracciamento del flusso linfatico

  1. Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, iniettare intradermally 10 μL di isotiocianato di fluoresceina al 2% (FITC) nel footpad sia del controllo che della gamba suturata linfatica.
  2. Eutanasia i topi con 400 μL di miscela ketamina/xiazina ed eseguire la lussazione cervicale quando i topi sono completamente anestetizzati.
  3. Raccogliere i pLN dalla fossa poplitea e rimuovere con cura il tessuto adiposo perinodale attorno ai pLAN sotto il microscopio a dissezione a 2, 6 e 12 ore dopo l'iniezione FITC.
  4. Incorporare i pLAN con l'area del seno midollare rivolta verso il lato del criomoldo in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT)(Figura 1G,H).
  5. Preparare sezioni congelate da 20 μm usando un criotomo.
  6. Immagini le criosezioni al microscopio confocale per determinare la distribuzione FITC.

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Risultati

La sutura linfatica dei vasi è stata utilizzata neglistudi precedenti 15,16,17,19, dove è servita come strumento importante per studiare la funzione del flusso linfatico prima che la biologia molecolare dei vasi linfatici fosse meglio compresa. Il blocco del flusso linfatico interrompe l'omeostasi LN, che porta gli HEV a perdere l'espressione genica critica necessaria per l'homing dei linfociti...

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Discussione

Il blocco del flusso linfatico avrà ampie applicazioni nella manipolazione della somministrazione di antigeni alla LN in condizioni sane e mase. È possibile utilizzare questo metodo per controllare i tempi di erogazione dell'antigene al fine di studiare come il flusso linfatico continuo regola la risposta immunitaria nelle LN drenante. Questo metodo di interruzione del flusso linfatico può anche essere utilizzato per studiare come la linfa influisce sulla compartimentazione cellulare, l'attivazione cellulare, la migrazio...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Ava Zardynezhad per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è supportato dal Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) e dalla Canada Foundation for Innovation for SL (32930), e dalla National Natural Science Foundation of China per Yujia Lin (81901576).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,9% di cloruro di sodio soluzione salinaBaxterJB1323
100% etanoloGreenfield Servizi di distribuzione della GlobalUniversity of Calgary UN1170.
Crema depilatoriaNairNair Sensitive Formula Depilazione Crè me con Olio di Mandorle Dolci e Olio per Bambini, 200 ml. O prodotto simile.
Colorante blu EvansSigma Life ScienceE2129-10GPer 1 ml di colorante blu Evans, aggiungere 0,1 g di blu Evans a 10 ml di PBS. La soluzione Evens Blue sarà filtrata attraverso filtri da 0,22 mm e mantenuta sterile in aliquote da 1 ml.
Isotiocianato di fluoresceina isotiocianato I (FITC)Sigma Life ScienceF7250-1G
Forcipe Dumont #3WPI500337
Forcipe Dumont #5WPI500233
Apparecchio per iniezioneCollegare un'estremità del tubo in polietilene a 30G & volte; ½ ago. Collegare una siringa da 1 ml di TB all'ago. Sganciare l'asta dell'ago da un altro 30G & ½ ago. Inserire l'estremità smussata del 30G &volte; ½ l'albero dell'ago nell'altra estremità del tubo. Il diametro interno di questo tubo è di 0,28 mm. Pertanto, 1,6 cm di fluido nel tubo sono 1 μl.
Siringa per insulinaBecton Dickinson and Company (BD)329461
IRIS Forcep straightWPI15914
IRIS scissorsWPI14218-G
KetamineNarketanDIN 02374994I fornitori di ketamina e xilazina sono solitamente soggetti a regolamentazione istituzionale e governativa.
Aghi (26Gx3/8)Becton Dickinson and Company (BD)305110
Needles (30Gx1/2)Becton Dickinson and Company (BD)305106
Porta aghi PatonROBOZRS6403Dritto, senza serratura; Soluzione
salina tamponata con fosfato (PBS)><Sigma Life ScienceP4417-100TAB
Tubo in polietileneBecton Dickinson and Company (BD)427401
Nastro chirurgico (1,25 cm x 9,1 m)Transpore1527-0
Nastro chirurgico (2,5 cm x 9,1 m)Transpore1527-1
SutureDavis and Geck CYANAMID Canada11/040.7 monofilamento metrico polipropilene
Siringa (1ml)Becton Dickinson and Company (BD)309659
VANNAS forbiciWorld Precision Instruments (WPI)14122-G
XilazinaRompunDIN02169606I fornitori di ketamina e xilazina sono solitamente soggetti a regolamentazione istituzionale e governativa.
Equipment
Microscopio da dissezioneOlympusOlympus S261 (522-STS OH141791) con sorgente luminosa: Olympus Highlight 3100
Microscopio confocaleLeicaSP8

Riferimenti

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