Un'installazione su piccola scala per il test della tossicità delle alghe di nanomateriali e altre sostanze difficili

Sommario

Dimostriamo test di tossicità delle alghe per sostanze difficili (ad esempio, sostanze colorate o nanomateriali) utilizzando un setup illuminato verticalmente con un LED.

Abstract

I dati sull'ecotossicità sono un requisito per la registrazione pre e post-mercato delle sostanze chimiche da parte delle normative europee e internazionali (ad esempio, REACH). Il test di tossicità delle alghe è spesso utilizzato nella valutazione del rischio normativo delle sostanze chimiche. Al fine di ottenere un'elevata affidabilità e riproducibilità, lo sviluppo di linee guida standardizzate è di vitale importanza. Per i test di tossicità delle alghe, le linee guida richiedono condizioni stabili e uniformi di parametri come pH, temperatura, livelli di anidride carbonica e intensità della luce. I nanomateriali e altre cosiddette sostanze difficili possono interferire con la luce causando una grande variazione nei risultati ottenuti ostacolando la loro accettazione normativa. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). L'installazione utilizza l'illuminazione a LED dal basso, consentendo una distribuzione omogenea della luce e il controllo della temperatura, riducendo al minimo l'ombreggiatura intra-campione. L'installazione ottimizza il volume del campione per la quantificazione della biomassa e allo stesso tempo garantisce un afflusso sufficiente di CO_{2 per} supportare la crescita esponenziale delle alghe. Inoltre, il materiale dei contenitori di prova può essere adattato per ridurre al minimo l'assorbimento e la volatilizzazione. Durante la sperimentazione di sostanze colorate o sospensioni di particelle, l'uso di luci a LED consente anche di aumentare l'intensità della luce senza ulteriore generazione di calore. Il design compatto e i requisiti minimi di equipaggiamento aumentano le possibilità di implementazione del LEVITATT in una vasta gamma di laboratori. Pur essendo conforme alle linee guida standardizzate ISO e OCSE per i test di tossicità delle alghe, LEVITATT ha anche mostrato una minore variabilità tra campioni per due sostanze di riferimento (3,5-Dicholorophenol e K₂Cr₂O₇) e tre nanomateriali (nO, CeO₂e BaSO₄) rispetto ai flaconi di Erlenmeyer e alle piastre microtitero.

Introduzione

Il test di tossicità delle alghe è uno dei soli tre test obbligatori utilizzati per generare i dati di ecotossicità necessari per la registrazione pre e post-mercato di sostanze chimiche da parte delle normative europee e internazionali (ad esempio, REACH¹ e TSCA (USA)). A tale scopo, le organizzazioni internazionali hanno sviluppato linee guida standardizzate per i test delle alghe (ad esempio, ISO e OCSE). Questi standard di test e linee guida prescrivono condizioni di prova ideali in termini di pH, temperatura, livelli di anidride carbonica e intensità della luce. Tuttavia, mantenere condizioni di prova stabili durante i test delle alghe è in pratica difficile e i risultati soffrono di problemi di riproducibilità e affidabilità per una serie di sostanze chimiche e nanomateriali (spesso indicati come "sostanze difficili")². La maggior parte delle configurazioni di test di tossicità delle alghe esistenti operano con volumi relativamente grandi (100-250 mL) situati su uno shaker orbitale all'interno di un'incubatrice. Tale impostazione limita il numero di concentrazioni di prova e replica volumi raggiungibili e elevati di coltura algale e materiale di prova. Inoltre, queste configurazioni raramente hanno un campo di luce uniforme e condizioni di illuminazione affidabili sono inoltre difficili da ottenere in grandi flaconi, in parte come l'intensità della luce diminuisce esponenzialmente più la luce viaggia e in parte a causa della geometria del fiasche. Le configurazioni alternative comprendono microtiter di plastica³ piastre contenenti piccoli volumi di campioni che non consentono volumi di campionamento adeguati per misurare il pH, misurazioni aggiuntive della biomassa, estrazione di pigmenti o altre analisi che richiedono un campionamento distruttivo. Una sfida particolare utilizzando le configurazioni esistenti per il test di tossicità algale di nanomateriali e sostanze che formano sospensioni colorate è l'interferenza o il blocco della luce disponibile per le cellule algali, spesso indicato come "ombreggiatura"^4,5. L'ombreggiatura può verificarsi all'interno delle fiale dal materiale di prova e/o dalle interazioni tra il materiale di prova e le cellule algali, o l'ombreggiatura può verificarsi tra le fiale, a causa del loro posizionamento rispetto all'altro e della fonte di luce.

Il metodo si basa sull'impostazione del test di tossicità delle alghe su piccola scala introdotto da Arensberg et al.⁶ che consente di testare in conformità con standard quali OCSE 201⁷e ISO 8692⁸. Il metodo è ulteriormente ottimizzato per affrontare le limitazioni sopra indicate da: 1) utilizzando la tecnologia della luce a LED per garantire condizioni di luce uniformi con una generazione minima di calore, 2) fornendo un volume campione adeguato per l'analisi chimico-biologica mantenendo costante il pH, i livelli di CO₂ e 3) consentendo l'uso di materiale contenitore di prova versatile per la sperimentazione di sostanze volatili o sostanze con un elevato potenziale di assorbimento.

Protocollo

1. Descrizione dell'impostazione LEVITATT

1. Utilizzare fiale di vetro scintillante da 20 mL(Figura 1, inserto 1) che consente la penetrazione della luce. In alternativa, è possibile utilizzare fiale di plastica penetrabili leggere. Quantificare l'intensità della luce utilizzando un fotometro.
2. Utilizzare almeno una sospensione di prova di 4 mL all'inizio del test per consentire la quantificazione della biomassa e per la caratterizzazione/quantificazione dei nanomateriali durante e dopo l'incubazione (Figura 1, inserire 2).
3. Montare le fiale di scintillazione di 20 mL con un tappo(Figura 1, inserto 3) dove viene forato un piccolo foro (circa 1 mm di diametro) per consentire lo scambio di CO₂ con l'atmosfera. Questo scambio è fondamentale per garantire livelli stabili di pH e CO_{2 durante} i test.
4. Per le sostanze volatili, utilizzare un tappo rivestito in Teflon a tenuta d'aria per consentire l'arricchimento di CO₂ dello spazio della testa^{utilizzando una siringa 9} o flaconi completamente chiusi senza fase di gas in cui la CO₂ viene mantenuta in soluzione da un sistema di tampone di sodio arricchito (NaHCO₃)¹⁰.
5. Fissare le fiale con morsetti montati sull'involucro esterno (Figura 1, inserire 4).
6. Utilizzare una sorgente luminosa a LED situata sotto le fiale di prova(Figura 1, inserto 5) che fornisca un'illuminazione fluorescente uniforme di tipo "cool-white" o "daylight" e un'intensità di luce nell'intervallo 60-120^{-E∙m -2}∙s^-1 misurato nell'intervallo di lunghezza d∙ onda fotosinteticamente efficace di 400 nm a 700 nm. L'installazione impiega un'intensità di luce regolabile nell'intervallo 5∙-E∙m^-2∙^-1 montando un dimmer leggero alla sorgente. Ciò consente di testare intensità di luce sempre più elevate.
7. Montare l'installazione su uno shaker orbitale per agitare i campioni per tutta la durata del test. Ciò mantiene le celle in sospensione libera e facilita il trasferimento di massa di CO₂ dall'aria all'acqua(Figura 1, inserto 6).
8. Posizionare l'installazione in una stanza a temperatura controllata o in un armadio termostatico per mantenere temperature stabili durante i test(Figura 1, inserire 7).

Figura 1: Immagine della tabella di illuminazione verticale a LED per i test di tossicità delle alghe (LEVITATT). 1) 20 mL di vetro per l'incubazione, 2) campione da 4 mL per l'analisi, 3) coperchio con foro forato per lo scambio di CO_2, 4) involucro per condizioni di luce definite, 5) sorgente luminosa a LED situata al centro dell'involucro, 6) agitatore orbitale per l'agitazione durante l'esperimento e 7) un armadio termostatico. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione del mezzo di crescita delle alghe

1. Il mezzo di crescita delle alghe ISO 8692 è costituito da quattro diverse soluzioni azionarie. Pesare la quantità appropriata di sali e diluire in acqua ultrapura secondo la tabella 1.

Soluzioni stock	Nutriente	Concentrazione nella soluzione stock	Concentrazione nella soluzione di test
1: Macronutrienti	NH4Cl	1,5 g/L	15 mg/L (N: 3,9 mg/L)
	MgCl2∙6H2O	1,2 g/L	12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L)
	CaCl2∙2H2O	1,8 g/L	18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L)
	MgSO4∙7H2O	1,5 g/L	15 mg/L (S: 1,95 mg/L)
	KH2PO4	0,16 g/L	1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L)
2: Fe-EDTA	FeCl3∙6H2O	64 mg/L	64 g/L (Fe: 13 g/L)
	Na2EDTA∙2H2O	100 mg/L	100 g/L
3: Traccia elementi	H3BO3a	185 mg/L	185 g/L (B: 32 g/L)
	MnCl2∙4H2O	415 mg/L	415 g/L (Mn: 115 g/L)
	Cl2	3 mg/L	3 g/L (n: 1,4 g/L)
	CoCl2∙6H2O	1,5 mg/L	1,5 g/L (Co: 0,37 g/L)
	CuCl2∙2H2O	0,01 mg/L	0,01 g/L (Cu: 3,7 ng/L)
	Na2MoO4∙2H2O	7 mg/L	7 g/L (Mo: 2,8 g/L)
4: NaHCO3	NaHCO3	50 g/L	50 mg/L (C: 7,14 mg/L)

Tabella 1: Concentrazioni di sostanze nutritive nelle soluzioni di stock per il mezzo di crescita delle alghe

NOTA: H₃BO₃ può essere disciolto aggiungendo 0,1 M NaOH. L'EDTA deve essere rimosso durante la prova dei metalli, per evitare la complessità con gli ioni metallici. Sterilizzare le soluzioni di stock per filtrazione a membrana (diametro dei pori medio 0,2 m) o mediante autoclaving (120 gradi centigradi, 15 min). Non fare soluzioni di stock autoclave 2 e 4, ma sterilizzarli mediante filtrazione della membrana. Conservare le soluzioni al buio a 4 gradi centigradi.

2. Per produrre 1 L di mezzo di crescita algale, trasferire 500 mL di acqua ultrapura sterilizzata in una fiaschetta volumetrica sterilizzata da 1 L e aggiungere 10 mL di soluzione di stock 1: Macronutrienti, 1 mL di soluzione di stock 2: Fe-EDTA, 1 mL di soluzione di stock 3: elementi di traccia e 1 mL di soluzione di stock 4: NaHCO₃.
3. Riempire fino a 1 L con acqua ultrapura sterilizzata, fermare il pallone e agitare accuratamente per omogeneizzare il mezzo di crescita delle alghe.
4. Equilibrare la soluzione prima dell'uso lasciandola durante la notte a contatto con l'aria o gorgogliando con aria sterile e filtrata per 30 min. Dopo l'equilibrio, regolare il pH, se necessario, su pH 8,1 ± 0,2, con 1 M HCl o 1 M NaOH.

3. Impostazione del test algale

NOTA: un diagramma di flusso della procedura di test algale è illustrato nella Figura 2.

Figura 2: diagramma di flusso della configurazione di test algale. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparare una soluzione di stock del composto di prova alla concentrazione di prova più elevata desiderata nel mezzo di crescita delle alghe preparato secondo il punto 2. Per la preparazione di soluzioni/sospensioni azionarie, seguire OCSE 201 (per composti solubili) o OCSE 318 (per i nanomateriali).
2. Misurare il pH nella soluzione stock. Se si discosta più di un'unità dal mezzo di crescita delle alghe, regolare il pH a 8 con 1 M HCl o 1 M NaOH.
3. Calcolare il volume di inoculum necessario per raggiungere una concentrazione finale di cellule di 1 x 10⁴ cellule/mL in una soluzione di prova a 25 mL.
   NOTA: L'inoculum dovrebbe provenire da una cultura di Raphidocelis subcapitata in crescita esponenziale incontaminata coltivata utilizzando l'impostazione LEVITATT.
4. Calcolare la quantità di soluzione di stock da aggiungere a ogni pallone volumetrico da 25 mL per ottenere le concentrazioni di prova desiderate. Il fattore tra ciascuna concentrazione non deve superare il 3,2.
5. Contrassegnare una fiaschetta volumetrica da 25 mL per ogni concentrazione scelta e un ulteriore controllo marcato di flacone volumetrico da 25 mL.
6. Aggiungere la quantità di soluzione di stock del composto di prova necessaria per raggiungere le concentrazioni desiderate al pallone volumetrico da 25 mL. Non aggiungere la soluzione stock al controllo.
7. Aggiungere il supporto ad ogni pallone volumetrico da 25 mL per raggiungere un volume di circa 20 mL.
8. Aggiungere il volume di inoculum calcolato al punto 3.3 ad ogni pallone volumetrico da 25 mL. Aggiungere il supporto ad ogni pallone volumetrico da 25 mL ad un volume totale finale di 25 mL.
9. Fermare i flaconi e mescolare accuratamente girando i flaconi due volte verticalmente.
10. Trasferire 0,4 mL da ogni pallone in singole fiale a vite e aggiungere 1,6 mL di acetone (saturato con MgCO_3):un campione per ogni concentrazione di prova e il controllo. Chiudere i coperchi e conservare al buio a temperatura ambiente fino a quando non vengono misurate la fluorescenza (sezione 4).
11. Pipetto 4 mL di ogni soluzione di prova in fiale scintillante 20 mL (3 repliche per concentrazione e 5 repliche per il controllo). Coperchi a vite sulle fiale scintillanti. Ricordate che i coperchi devono avere un foro forato (circa 1 mm di diametro) per consentire lo scambio di CO_2.
12. Dopo 24 h, 48 h e 72 h, pipetto 0,4 mL da ogni fiala in fiale a vite e aggiungere 1,6 mL di acetone (saturo di MgCO₃). Chiudere i coperchi e conservare al buio a temperatura ambiente fino a quando non vengono misurate la fluorescenza (sezione 4).
13. Dopo che l'ultimo campione è stato prelevato a 72 h, mettere in comune delicatamente le tre repliche per una data concentrazione in una fiala e misurare il pH. Ripetere l'operazione per tutte le concentrazioni e il controllo. Il pH non deve deviare più di 1,5 unità dal pH iniziale per uno dei campioni misurati.
14. Scaricare i liquidi rimanenti in un contenitore di rifiuti seguendo le norme e i regolamenti istituzionali.

4. Analisi dei campioni di prova delle alghe

1. Utilizzare uno spettrofotometro a fluorescenza per misurare la biomassa algale (qui espressa come clorofilla A). L'emissione di picco per la clorofilla A è di 420 nm per la lunghezza d'onda di eccitazione e di 671 nm per la lunghezza d'onda delle emissioni.
2. Misurare la fluorescenza di ogni singolo campione tre volte e calcolare il valore medio per ogni campione.
3. Utilizzare l'equazione 1 per calcolare il tasso di crescita. La fluorescenza misurata (unità relative) può essere utilizzata direttamente come parametro della biomassa nell'equazione 1.
   Equazione 1: μ (ln N_t – ln N₀) / t
   dove μ è il tasso di crescita (d^-1), N_{0 è} la biomassa iniziale, N_t è la biomassa al tempo t e t è la lunghezza del periodo di prova (d). Si noti che N₀ e N_t devono essere espressi nella stessa unità.
4. Utilizzare un software statistico per adattare una curva di regressione non lineare (ad esempio, una funzione log-logistica o Weibull) ai dati del tasso di crescita per ottenere valori di concentrazione effettivi al 10%, 20% e 50% di inibizione. Nelle informazioni supplementari è fornito un esempio di codice per l'adattamento del software statistico R utilizzando il pacchetto DRC^11.

Risultati

Viene effettuata una prova iniziale con una sostanza di riferimento per determinare la sensibilità del ceppo algale. Le sostanze di riferimento regolarmente utilizzate per R. subcapitata sono dicromate di potassio e 3,5-Dichlorphenol^7,8. La figura 3 e la tabella 2 mostrano un risultato rappresentativo di una prova algale che include il raccordo a curva e i risultati statistici quando il pacchetto RDC in R vi...

Discussione

Il fitoplancton converte l'energia solare e l'anidride carbonica in materia organica e detiene quindi un ruolo fondamentale nell'ecosistema acquatico. Per questo motivo, i test di inibizione del tasso di crescita delle alghe sono inclusi come uno dei tre test obbligatori di tossicità acquatica necessari per la valutazione del rischio regolamentare delle sostanze chimiche. La capacità di eseguire un test di tossicità algale affidabile e riproducibile è fondamentale a questo proposito. Le configurazioni di prova con flacon...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetone	Sigma-Aldrich	V179124
Cloruro di ammonio	Sigma-Aldrich	254134
Flaconi BlueCap (1L)	Buch & Holm A/S
Acido borico	Sigma-Aldrich	B0394
Cloruro di calcio diidrato	Sigma-Aldrich	208290
Lastra acrilica trasparente (40x40 cm)
Cloruro di cobalto(II) esaidrato	Sigma-Aldrich	255599
Cloruro di rame(II) diidrato	Sigma-Aldrich	307483
Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato	Sigma-Aldrich	E5134
Spettrofotometro a fluorescenza F-7000	Hitachi
Acido cloridrico	Sigma-Aldrich	258148
Cloruro di ferro (III) esaidrato	Sigma-Aldrich	236489
Sorgente luminosa a LED	Helmholt Elektronik A/S	H35161	Bianco neutro, 6500K
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	M9272
Solfato di magnesio eptaidrato	Sigma-Aldrich	230391
Cloruro di manganese (II) tetraidrato	Sigma-Aldrich	221279
Agitatore orbitale	IKA	2980200
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1 ceppo
Fiale di scintillazione (20 mL)	Fisherscientific	11526325
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S6014
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	415413
Molibdato di sodio diidrato	Sigma-Aldrich	331058
Morsetto a molla	Frederiksen Scientific A/S	472002
Armadio termostatico	VWR	WTWA208450	Alternativa: ambiente a temperatura controllata
Tubo di ventilazione (Ø 125 mm)
(25 mL)	DWK Life Sciences	246781455
Cloruro di zinco	Sigma-Aldrich	208086