Articolo metodologico

Screening diretto in coltura liquida per la valutazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando un mutante auxotrofico di Aspergillus oryzae

DOI:

10.3791/61219

⸱

12 maggio 2020

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È stato sviluppato un metodo di screening in coltura liquida diretta (DLC) che riduce significativamente il tempo necessario per la trasformazione del fungo filamentoso, Aspergillus oryzae, mediata da protoplasti con glicole polietilenico (PEG), quando impiegata per la valutazione della produzione secretoria di proteine eterologhe. Questo metodo aumenta notevolmente la produttività del protocollo di valutazione.

Abstract

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L'Aspergillus oryzae, un fungo filamentoso, è uno degli ospiti più utilizzati per applicazioni industriali, tra cui la produzione su larga scala di proteine. Un metodo di trasformazione dei protoplasti mediato da polietilenglicole (PEG) è generalmente utilizzato per l'introduzione di geni eterologhi in A. oryzae. Il metodo convenzionale richiede in genere tre settimane per lo screening di trasformanti favorevoli. Qui viene introdotta una nuova tecnica, il metodo di screening con coltura liquida diretta (DLC), che riduce il tempo di screening a sei giorni in un formato di fiaschetta da 200 ml o a 10 giorni in un formato di micropiastra da 24 pozzetti. Il metodo di screening DLC garantisce l'acquisizione di trasformanti positivi e la valutazione della produzione secretoria di proteine eterologhe in un unico passaggio, a differenza del metodo di screening convenzionale in cui sono necessari due passaggi separati per lo stesso. Viene descritto il protocollo per la trasformazione dei protoplasti mediata da PEG di A. oryzae , che consiste in cinque fasi: preparazione della sospensione di spore fresche, precoltura, preparazione dei protoplasti, introduzione del DNA e screening dei DLC. Per ottenere risultati positivi nello screening dei DLC, è fondamentale utilizzare un terreno ricco di sostanze nutritive con una pressione osmotica ottimizzata. Il protocollo dovrebbe rendere ulteriormente popolare l'uso di A. oryzae come ospite di scelta nella produzione industriale di proteine.

Introduzione

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L'Aspergillus oryzae è un microrganismo importante nell'industria alimentare giapponese che è stato utilizzato per oltre 1.000 anni nella produzione di alimenti fermentati, come il sake (vino di riso), lo shoyu (salsa di soia) e il miso (pasta di soia)1,2. Ha la capacità di secernere una grande quantità di proteine, come le proteasi e le amilasi3. Sono disponibili anche informazioni sulla sequenza del genoma per A. oryzae 4. Inoltre, per questofungo sono state messe a punto tecniche di ingegneria genetica potenti e praticamente utili 5,6,7,8,9,10. Trasformanti favorevoli sono stati utilizzati come ospiti per la produzione secretoria di proteine eterologhe 11,12,13,14.

L'elettroporazione, la trasformazione mediata da Agrobacterium e la trasformazione di protoplasti mediata da polietilenglicole (PEG) sono le tecniche utilizzate per introdurre geni eterologhi in A. oryzae 15,16,17. Il metodo di trasformazione dei protoplasti mediato da PEG è stato ampiamente utilizzato da quando è stato riportato per la prima volta per Neurospora crassa nel 197918. In questo metodo, i protoplasti vengono preparati e mescolati con PEG e il gene eterologo che deve essere introdotto nelle cellule. Le pareti dei protoplasti sono enzimaticamente compromesse, il che rende le cellule vulnerabili allo stress fisico e ai cambiamenti della pressione osmotica19,20. Il metodo di screening convenzionale impiegato nella produzione secretoria di proteine eterologhe comprende tre fasi: acquisizione di trasformanti positivi (su piastra di agar morbido), selezione di trasformanti veri e falsi (su piastra di agar) e valutazione della produzione secretoria di proteine eterologhe (in coltura liquida); ciascuno di questi passaggi richiede sette giorni (Figura 1). Pertanto, il metodo convenzionale richiede in genere circa tre settimane.

Il tempo necessario per lo screening delle cellule trasformate di A. oryzae è molto più lungo di quello richiesto per altri microrganismi comunemente utilizzati nella ricerca biotecnologica, rendendo il processo più macchinoso. Ad esempio, quando si utilizza l'Escherichia coli come ospite, sono necessari circa due giorni dall'introduzione del DNA alla conferma del suo effetto21.

Per aggirare le limitazioni associate all'uso di A. oryzae , come menzionato in precedenza, viene introdotto un nuovo metodo di screening diretto in coltura liquida (DLC), che consente uno screening più rapido e semplice per la valutazione della produzione secretoria di proteine eterologhe (Figura 1). Nel metodo DLC, vengono utilizzati un mutante auxotrofico dell'uridina e un mezzo liquido ricco di sostanze nutritive. Utilizzando questo metodo, la fase di screening può essere completata entro sei giorni dall'introduzione del DNA nei protoplasti in un formato di fiaschetta da 200 ml o entro 10 giorni in un formato di micropiastra da 24 pozzetti. Inoltre, in questo metodo non è necessaria la preparazione laboriosa e dispendiosa in termini di tempo dei terreni per piastre di agar. L'utilizzo del metodo appena descritto presenta un enorme vantaggio, soprattutto considerando il fatto che il metodo convenzionale richiede due mezzi diversi: la piastra di agar morbida per l'acquisizione di trasformanti positivi, che richiede un'attenta manipolazione e controllo della temperatura, e la piastra di agar solida per la selezione di trasformanti reali.

figure-introduction-1
Figura 1: Schema della trasformazione del fungo filamentoso Aspergillus oryzae mediata da protoplasti mediata da polietilenglicole (PEG).
(Pannello superiore) Metodo di screening convenzionale. (Pannello inferiore) Metodo di screening con coltura liquida diretta (DLC). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

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1. Preparazione della sospensione di spore fresche

  1. Inoculare 20 μL di una sospensione di spore madre (1 x 107 spore/mL) al centro di una piastra di coltura contenente terreno Czapek-Dox (CD) con 20 mM di uridina (sterilizzata in autoclave a 121 °C per 20 min, Tabella 1).
  2. Incubare a 30 °C per 7 giorni per favorire la formazione di spore.
  3. Aggiungere 1,5 mL di soluzione Tween 20 allo 0,01 % (sterilizzata in autoclave a 121 °C per 20 minuti) alla piastra di coltura contenente le spore e sospendere le spore raschiando con un divaricatore cellulare.
  4. Raccogliere la sospensione di spore in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando una pipetta.
  5. Conservare la sospensione a 4 °C fino al momento dell'uso.
    NOTA: Utilizzare la sospensione di spore nella seguente procedura entro 2 settimane. Per creare una scorta per la conservazione a lungo termine, aggiungere glicerolo alla sospensione di spore a una concentrazione finale del 15% e conservare a -80 °C.

2. Precultura

  1. Aggiungere 100 mL di terreno di polipeptone-destrina (PD) (Tabella 2) in un matraccio di Erlenmeyer da 500 mL e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 20 min.
  2. Dopo aver confermato che la temperatura del mezzo è ridotta, aggiungere la soluzione di uridina, sterilizzata passando attraverso un filtro con una dimensione dei pori di 0,22 μm, a una concentrazione finale di 20 mM.
  3. Aggiungere 200 μl della sospensione di spore (1 x 107 spore/mL) preparata al punto 1.4 e incubare a 30 °C con agitazione a 120 giri/min per 36 ore.

3. Preparazione dei protoplasti

  1. Raccogliere la biomassa fungina preparata al punto 2.3 su un filtro di vetro con pori di 30 μm (sterilizzato in autoclave a 121 °C per 20 minuti).
  2. Versare 100 mL di acqua distillata (DW) (sterilizzata in autoclave a 121 °C per 20 min) sul filtro di vetro e mescolare più volte con una spatola (sterilizzata in autoclave a 121 °C per 20 min).
  3. Dopo il lavaggio con DW, versare 100 mL di tampone cloruro di sodio (NaCl) (autoclavato a 121 °C per 20 min, Tabella 3) sul filtro di vetro e mescolare più volte con una spatola.
  4. Trasferire circa 1-2 mL (volume umido) delle cellule in una provetta conica da 50 mL utilizzando una spatola (sterilizzata in autoclave a 121 °C per 20 min).
  5. Dopo aver aggiunto 15 mL di soluzione enzimatica (sterilizzata passando attraverso un filtro poroso da 0,22 μm, Tabella 4) a una provetta conica da 50 mL, aggiungere il tampone NaCl fino a quando il volume totale raggiunge i 30 mL.
  6. Chiudere il coperchio e sigillare con pellicola di paraffina. Incubare a 30 °C agitando a 60 rpm per 2 h.
  7. Far fluire la soluzione risultante attraverso un filtro cellulare da 70 μm collegato alla provetta conica da 50 mL per rimuovere i miceli non reagiti.
  8. Centrifugare la soluzione di protoplasto in una provetta conica da 50 mL a 2.150 x g e 4 °C per 20 minuti.
  9. Scartare delicatamente il surnatante per evitare che il pellet si stacchi. Aggiungere 1 mL di soluzione sterilizzata a freddo B (sterilizzata in autoclave a 121 °C per 20 minuti, Tabella 5) e sospendere delicatamente i protoplasti precipitati mediante pipettaggio.
  10. Trasferire i protoplasti sospesi in una provetta sterile da 1,5 mL.
  11. Centrifugare a 2,220 x g e 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Quindi, aggiungere 1 mL di soluzione ghiacciata B e sospendere delicatamente il pellet mediante pipettaggio.
  12. Ripetere il passaggio 3.9.
  13. Utilizzando un emocitometro, misurare il numero di protoplasti al microscopio.
  14. Preparare una sospensione di protoplasti (1-3 x 107 protoplasti/mL) nella soluzione B e conservarla in ghiaccio fino al momento dell'uso.
    NOTA: Utilizzare immediatamente la sospensione protoplast nella procedura seguente.

4. Introduzione del DNA per la produzione secretoria di proteine

  1. Utilizzando un plasmide contenente una cassetta di DNA per la produzione secretoria di proteine come stampo, amplificare il frammento di DNA necessario per la produzione secretoria mediante PCR.
  2. Preparare il campione di DNA da utilizzare per la trasformazione elaborando il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione PCR.
  3. Aggiungere 1 mL della soluzione di protoplasto, 200 μL di soluzione C (sterilizzata in autoclave a 121 °C per 20 min, Tabella 6) e 50 μL del campione di DNA (0,5-1 μg/μL) in una provetta conica sterile da 15 mL preraffreddata e miscelare delicatamente la soluzione mediante pipettaggio.
    NOTA: La soluzione C è altamente viscosa e può essere difficile da maneggiare; Garantire una miscelazione accurata mediante pipettaggio.
  4. Incubare la provetta con ghiaccio per 30 minuti.
  5. Aggiungere 1,5 mL di soluzione C, mescolare delicatamente pipettando e lasciare la soluzione a temperatura ambiente per 20-30 minuti.

5. Screening diretto delle colture liquide

NOTA: Selezionare il sistema di coltura utilizzando le matracci di Erlenmeyer (sezione 5.1) o le micropiastre (sezione 5.2).

  1. Sistema di coltura con matraccio di Erlenmeyer da 200 mL
    1. Aggiungere 50 mL di terreno PD contenente 0,8 M di sorbitolo a un pallone di Erlenmeyer da 200 mL e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 20 min.
    2. Dopo aver verificato che la temperatura del mezzo è ridotta, aggiungere la sospensione di protoplasto preparata al punto 4.5 a una concentrazione finale di 1 x 105 protoplasti/mL.
    3. Incubare la coltura per 6 giorni a 30 °C con agitazione a 120 giri/min.
    4. Raccogliere 1 mL di terreno e conservarlo in una provetta da 1,5 mL a 4 °C. Conservare il campione di coltura a -20°C, se non analizzato immediatamente.
    5. Mescolare 20 μL di campione di coltura e 20 μL di tampone per campioni di dodecil solfato di sodio (SDS) (Tabella 7) in una provetta da 1,5 mL e far bollire a 95 °C per 5 minuti.
    6. Dopo il raffreddamento su ghiaccio, caricare 20 μl del campione bollito e 5 μl di proteina prestained standard su un gel prefabbricato e analizzare la produzione secretoria della proteina eterologa bersaglio mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE)10.
  2. Sistema di coltura con micropiastra a 24 pozzetti
    1. Aggiungere la sospensione di protoplasti preparata nella fase 4.5 a un terreno PD sterilizzato contenente sorbitolo 0,8 M fino a una concentrazione finale di 1 x 105 protoplasti/mL e mescolare delicatamente mediante pipettaggio.
    2. Aggiungere 1 mL della soluzione preparata al punto 5.2.1 in tre pozzetti in una micropiastra da 24 pozzetti.
    3. Applicare il coperchio e incubare a 30 °C agitando a 175 giri/min per 10 giorni.
    4. Raccogliere 1 mL di terreno e conservare in una provetta da 1,5 mL a 4°C. Conservare il campione di coltura a -20°C, se non analizzato immediatamente.
    5. Mescolare 20 μL del campione di coltura e 20 μL di tampone per campioni SDS in una provetta da 1,5 mL e far bollire a 95 °C per 5 min.
    6. Dopo il raffreddamento su ghiaccio, caricare 20 μL del campione bollito e 5 μL di proteina standard prestained su un gel prefabbricato e analizzare la produzione secretoria della proteina eterologa bersaglio mediante SDS-PAGE10.

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Risultati

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Di seguito sono descritti i risultati per l'introduzione della cassetta di espressione del DNA che codifica per Talaromyces cellulolyticus cellobioidrolasi (CBH: GenBank Accession Number E39854) in un auxotropo uridina del ceppo HO422 di A. oryzae e lo screening per la produzione secretoria della proteina eterologa.

Preparazione della sospensione di spore fresche

La resa finale della sospensione di spore da ...

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Discussione

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Abbiamo sviluppato un sistema che consente lo screening dei trasformanti di A. oryzae più rapidamente rispetto al metodo convenzionale, conducendo la coltura liquida dei protoplasti. L'aspetto più critico di questo metodo è la pressione osmotica del mezzo liquido. La pressione osmotica adatta alla coltura liquida è stata ottimizzata utilizzando il sorbitolo. La crescita del ceppo HO4 di A. oryzae era più attiva in presenza di 0,8 M di sorbitolo (Fig...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Rinkei Okano per l'aiuto con gli esperimenti. Gli autori ringraziano il professor Katsuya Gomi dell'Università di Tohoku e il professor Masayuki Machida del Kanazawa Institute of Technology per le preziose discussioni. Questo lavoro è stato finanziato da Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 M NaOHNACALAI TESQUE, INC.37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7,5)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6,8)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation2106-100
1,5 mL Provetta per microcentrifugaAS ONE Corporation1-1600-03
15 mL Provetta per centrifuga conicaBecton, Dickinson and Company352196
2- mercaptoetanoloBio-Rad Laboratories, Inc.
Micropiastra a 24 pozzettiAGC TECHNO GLASS CO., LTD.3820-024
Provetta da centrifuga conica da 50 mLBecton, Dickinson and Company352070
70-µ m Filtro cellulareBecton, Dickinson and Company352350
AgarFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation010-15815
AutoclaveTOMY SEIKO CO., LTD.LSX-700
Blu bromofenoloFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation021-02911
CaCl2FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation038-24985
Acido casaminoFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation393-02145
Cellulasi R-10Cosmo Bio Co., Ltd.16419
Destrina idratoFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation044-00585
D-SorbitoloFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T/R1020LUtilizzato per gel prefabbricato nel dispositivo di elettroforesi SDS-PAGE
ATTO CORPORATIONWSE-1150Utilizzato per SDS-PAGE
FeSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation098-01085
Filtro in vetro 17G3Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.
GliceroloFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation070-04941
EmocitometroFunakoshi Co., Ltd.521-10
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàKUBOTA CORPORATION7780Utilizzata per la centrifugazione di campioni in provette da centrifuga coniche da 50 ml
IncubatoreTAITEC CORPORATION.G· BR-200Utilizzato per la coltura di liquidi in pallone e la preparazione di protoplasti Incubatore
TAITEC CORPORATION.BR-43FLUtilizzato per la coltura di liquidi per micropiastre e la coltura su piastre
KClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-03545
KH2PO4NACALAI TESQUE, INC.28721-55
Enzima lisinganteSigma-AldrichL1412-10G
MgSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation131-00405
Micro centrifuga refrigerataKUBOTA CORPORATION3740Utilizzata per la centrifugazione di campioni in provette da microcentrifuga da 1,5 mL
MicroscopioLeica MicrosystemsDMI6000 B
NaClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation190-13921
NaH2PO4· 2H2ONACALAI TESQUE, INC.31718-15
NaNO3FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation195-02545
Parafilm MBemis Company, IncPM-996
Kit di purificazione PCRQIAGEN K.K28104
Piastra di PetriSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-11900Utilizzato come piastra di coltura
PolietilenglicoleSigma-AldrichP3640-500G
Polipeptone peptoneBecton, Dickinson and Company211910
Scale proteicheBio-Rad Laboratories, Inc.161-0377Utilizzato come marcatore di peso molecolare in SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfateBio-Rad Laboratories, Inc.
Filtro sterileMerck KGaASLGP033RB
SaccarosioNACALAI TESQUE, INC.30404-45
Tween 20Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0543
UridinaSigma-AldrichU3750-25G
YatalaseTakara Bio Inc.T017
161071000000941471610301

Riferimenti

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