L'obiettivo del protocollo è confrontare diverse condizioni di rivestimento della matrice extracellulare (ECM) per valutare in che modo il rivestimento differenziale influisce sul tasso di crescita delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). In particolare, miriamo a creare le condizioni per ottenere una crescita ottimale delle colture iPSC.
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Articolo metodologico
Misurazione della confluenza di iPSC utilizzando un sistema di imaging automatizzato.
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo studio si concentra sulla comprensione di come la crescita di iPSC su diversi substrati di rivestimento ECM può influenzare la confluenza cellulare. È stato stabilito un protocollo per valutare la confluenza di iPSC in tempo reale senza la necessità di contare le cellule in sospensione monocellulare per evitare qualsiasi perturbazione della crescita. Un sistema di analisi delle immagini ad alto contenuto è stato utilizzato per valutare la confluenza di iPCS su 4 diversi ECM nel tempo in modo automatizzato. Sono state utilizzate diverse impostazioni di analisi per valutare la confluenza cellulare di iPSC aderenti e solo una leggera differenza (a 24 e 48 ore con laminina) è stata osservata se è stata applicata una maschera al 60, 80 o 100%. Mostriamo anche che la laminina porta alla migliore confluenza rispetto a Matrigel, vitronectin e fibronectina.
Introduzione
Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono ottenute da cellule somatiche e possono essere differenziate in diversi tipi di cellule. Sono spesso utilizzati come sistema per modellare la patogenesi della malattia o eseguire lo screening dei farmaci e offrono anche il potenziale per essere utilizzati nel contesto della medicina personalizzata. Poiché le iPSC hanno un grande potenziale, è importante caratterizzarle completamente per l'uso come sistema modello affidabile. In precedenza abbiamo dimostrato l'importanza della crescita di iPSC in un ambiente ipossico poiché queste cellule si basano sulla glicolisi e un ambiente aerobico può causare uno squilibrio re....
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Protocollo
1. Rivestimento di 96 piastre di pozzetto
NOTA: Diversi rivestimenti sono stati testati nella stessa piastra ma pozzetti separati (vedere File supplementare).
- Diluire il Matrigel 1:100 in DMEM. Aggiungere 100 μL per pozzetto alle piastre da 96 pozzetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la soluzione e lavare i pozzetti con 100 μL di DMEM due volte.
- Laminina diluita (20 μg/mL, LN-521) in PBS (con calcio e magnesio). Aggiungere 100 μL nel pozzetto e incubare a 4 °C durante la notte. Il giorno seguente eseguire due lavaggi con DMEM prima di seminare le cellule.
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Risultati
In questo studio, abbiamo studiato la confluenza delle iPSC quando coltivate in diverse condizioni di rivestimento. Utilizzando un citometro, siamo stati in grado di ottenere risultati prontamente informativi in triplice copia in 5 giorni. Poiché le iPSC difficilmente si attaccano ai vasi di plastica ed è necessario un rivestimento per supportare la loro proliferazione, abbiamo deciso di monitorare la confluenza delle iPSC umane in quanto è indicativa della salute della coltura cellulare e potrebbe riflettersi sul loro p.......
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Discussione
L'utilizzo delle iPSC per la modellizzazione delle malattie e il futuro screening farmacologico insieme alla loro possibile applicazione in medicina di precisione la rende una tecnologia di grande rilevanza e per questo motivo riteniamo che sia necessario comprendere chiaramente la condizione di coltura in vitro che meglio assomiglia alla situazione fisiologica delle cellule staminali embrionali. In questo contesto, abbiamo testato diversi rivestimenti ECM utilizzando iPSC wild type al fine di comprendere le condizioni c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione Bambino Gesù e Ricerca Corrente a C.C. Si ringraziano il Dott. Enrico Bertini (Dipartimento di Neuroscienze, Unità di Malattie Neuromuscolari e Neurodegenerative, Laboratorio di Medicina Molecolare, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù), la Dott.ssa Stefania Petrini (Centro di Microscopia Confocale, Laboratori di Ricerca, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Dipartimento di Oncoematologia, Terapia Genica e Cellulare, Ospedale di Ricerca Pediatrica Bambino Gesù) e Roberta Ferretti (Dipartimento di Oncoematologia, Terapia Genica e Cellulare, Ospedale P....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pipette sierologiche Stripette da 10 mL, polistirene, incartate singolarmente in carta/plastica, sterili | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL di provette da centrifuga coniche in polipropilene (PP) ad alta trasparenza | Strumento Falcon | 352097 | |
| 1x PBS (con Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (senza Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Pipette sierologiche, polistirene, incartate singolarmente in carta/plastica, sterili | Corning | 4487 | Tool |
| Micropiastra per colture cellulari, 96 pozzetti, PS, supporto F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | |
| Piastra per colture cellulari, | supporto | ||
| Costar 3516 a 6 pozzettiDMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glycise) | Sigma | D5671 | |
| Medium EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagente |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming | Invitrogen | A15960 | Reagente |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectina | Merck | FC010 | Rivestimento |
| Glicerolo | Sigma | G5516 | Reagente |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagente |
| Laminina 521 | Tecnologie delle cellule staminali | 77003 | Rivestimento |
| L-glutammina (200 mM) | Gibco | LS25030081 Reagente | |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC Certified Matrix | 354277 | Coating |
| Fibroblasti embrionali di topo (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | |
| Medium MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | |
| Medium Penicillina-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagente |
| Falloidina | Sigma | P1951 | Reagente |
| Vitronectina | Stem Cell Technologies | 7180 | Rivestimento |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagente |
Riferimenti
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated hu....
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Ristampe e permessi
