Valutazione dell'ossidazione cellulare utilizzando una proteina fluorescente verde sensibile al comparto subcellulare

Sommario

Questo protocollo descrive la valutazione dello stato di redox subcellulare specifico del compartimento all'interno della cella. Una sonda fluorescente redox-sensibile consente una comoda analisi ratiometrica nelle cellule intatte.

Abstract

Misurare l'equilibrio di ossidazione/riduzione intracellulare fornisce una panoramica dello stato di redox fisiologico e/o patofisiologico di un organismo. I thiol sono particolarmente importanti per illuminare lo stato di ripetizione delle cellule attraverso i loro rapporti dithiol ridotti e disulfide ossidati. Le proteine fluorescenti contenenti cisteina ingegnerizzate aprono una nuova era per i biosensori sensibili ai redox. Una di queste, la proteina fluorescente verde sensibile alla redox (roGFP), può essere facilmente introdotta nelle cellule con trasduzione adenovirale, consentendo di valutare lo stato di ripetizione dei compartimenti subcellulari senza interrompere i processi cellulari. Cistein e cistino ossidati di roGFP hanno massimali di eccitazione a 488 nm e 405 nm, rispettivamente, con emissione a 525 nm. La valutazione dei rapporti di queste forme ridotte e ossidati consente il comodo calcolo dell'equilibrio redox all'interno della cella. In questo articolo di metodo, le cellule umane di cancro al seno tripla-negativa (MDA-MB-231) sono state utilizzate per valutare lo stato di redox all'interno della cellula vivente. I passaggi del protocollo includono la trasduzione della linea cellulare MDA-MB-231 con adenovirus per esprimere il citosolico roGFP, il trattamento con H₂O₂e la valutazione del rapporto di cisteina e cistina con la citometria del flusso e la microscopia a fluorescenza.

Introduzione

Lo stress ossidativo è stato definito nel 1985 da Helmut Sies come "un disturbo nell'equilibrio proossidante-antiossidante a favore del primo"¹, ed è stata condotta una pletora di ricerca per ottenere lo stato di ridonazione della malattia^1,2,3. Da allora, la comprensione dello stress ossidativo è diventata più ampia. Testare le ipotesi di utilizzare antiossidanti contro malattie e/o invecchiamento ha dimostrato che lo stress ossidativo non solo provoca danni, ma ha anche altri ruoli nelle cellule. Inoltre, gli scienziati hanno dimostrato che i radical....

Protocollo

NOTA: questo protocollo è stato ottimizzato per le celle MDA-MB-231 confluenti 70%-80%. Per altre linee cellulari, il numero di cellule e la molteplicità di infezione (MOI) dovrebbero essere ottimizzati nuovamente.

1. Preparazione delle cellule (giorno 1)

1. Mantenere la linea cellulare MDA-MB-231 in flaconi da 75 cm² con 10 mL del mezzo Eagle (DMEM) modificato di Dulbecco, integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS) a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidificata di CO₂ del 5%.
   NOTA: per tutte le incubazioni di attacco e trattamento vengono utilizzati DMEM integrati con 10% di FBS, 37 gradi centigradi e....

Risultati

Lo stato di redox di CyS/CySS è facilmente divformato con roGP trasdotti. La sonda fluorescente quantifica il rapporto tra le forme ridotte e ossidate (lunghezze d'onda di eccitazione rispettivamente 488 e 405 nm). I dati di fluorescenza possono essere ottenuti sia dalla citometria del flusso che dalla microscopia.

Un gran numero di cellule può essere acquisita in modo coerente e conveniente utilizzando la citometria di flusso. L'analisi è costituita da 3 passaggi principali: 1) selezionare la.......

Discussione

L'equilibrio tiol/disulfide in un organismo riflette lo stato di ripetizione delle cellule. Gli organismi viventi hanno glutathione, cisteina, tiol proteici e tioli a basso peso molecolare, tutti influenzati dal livello di ossidazione e riecheggiano lo stato di redox delle cellule⁴. I roGFP ingegnerizzati consentono la quantificazione non dirompente dell'equilibrio tiolo/disulfide attraverso i loro residui di CyS⁷. La proprietà ratiometrica di roGFP fornisce misurazioni aff.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco di Life Sciences	25200-056	Vetrino per colture cellulari
4 pozzetti	Thermo Scientific	154526	Materiale di semina cellulare per imaging fluorescente
Provette da 5 ml con tappo per filtro cellulare	Falcon	352235	Provetta di sospensione a cellula singola per analisi di citometria a flusso
Piastra a 6 pozzetti	Corning	353046	Materiale di semina cellulare per l'analisi della citometria a flusso
Provette coniche da 15 ml	MidSci	C15B	Coltura cellulare
75 cm2 fiasche ventilate per colture tissutali	Corning	4306414	Coltura cellulare
RoGFP specifico per citosol adenovirale	ViraQuest	VQAd roGFP	costrutto roGFP gentilmente fornito dal Dr. Schumaker
Classe II, Tipo A2 Armadio	con cappa di sicurezzaThermo Scientific	Serie 1300 A2	Colture cellulari
Contatore cellulare automatizzato Countess	Invitrogen	C10227	Conteggio cellulare
Contacellule Countess Vetrini per camera	Contacellule Invitrogen	C10283	Conteggio cellulare
DMEM	Gibco di Life Sciences	11995-065	Coltura cellulare
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Coltura cellulare
Puntali per pipette filtrati, sterili, 20 &; micro; l	Fisherbrand	02-717-161
Puntali per pipette filtrati per colture cellulari, sterili, 1000 &; l	Fisherbrand	02-717-166	Citometro
flusso	BD Biosciences	LSRFortessa	Strumento dotato di filtri passa-banda FITC e BV510 per analisi di citometria a flusso
Microscopio a fluorescenza Gruppo	di microscopia avanzata (AMG)	Evos FL	Imaging fluorescente
Perossido di idrogeno 30%	Fisher Scientific	H325-100	Controllo positivo
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Imaging fluorescente di cellule che esprimono roGFP (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Imaging fluorescente di cellule che esprimono roGFP (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Linea cellulare per carcinoma mammario epiteliale umano
Provette per microcentrifuga, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Pipetta
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	Pipetta per colture cellulari
	Drummond	Hood Mate Model 360	per colture cellulari
, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Pipetta
sierologica per colture cellulari, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Pipetta
sierologica per colture cellulari, 10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Incubatore
colture cellulari Incubatore per colture tissutali	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 per colture cellulari
Colorazione blu di tripano 0,4%	Invitrogen	T10282	Conteggio delle cellule

a a per colture cellulari sierologica per colture cellulari Pipetta sierologica per