Articolo metodologico

Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

DOI:

10.3791/61230

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12 giugno 2020

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1Departments of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Departments of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Fleischer Institute of Diabetes and Metabolism

In questo articolo

Sommario

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Questa pubblicazione descrive un protocollo per l'isolamento dei nuclei dagli adipociti maturi, la purificazione mediante lo smistamento attivato dalla fluorescenza e la trascrittomica a livello di cellula.

Abstract

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I grassi marroni e beige sono tessuti adipose specializzati che dissipano l'energia per la termogenesi da vie indipendenti e dipendenti da UCP1 (Uncoupling Protein-1). Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici erano considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che ci sono più sottotipi o sottopopolazioni che sono distinti nell'origine dello sviluppo, nell'uso di substrati e nel trascrittoma. Nonostante i progressi nella genomica a singola cellula, la decomposizione imparziale dei tessuti adiposi in sottotipi cellulari è stata difficile a causa della natura fragile degli adipociti pieni di lipidi. Il protocollo presentato è stato sviluppato per aggirare questi ostacoli isolando efficacemente i singoli nuclei dal tessuto adiposo per applicazioni a valle, incluso il sequenziamento dell'RNA. L'eterogeneità cellulare può quindi essere analizzata mediante sequenziamento dell'RNA e analisi bioinformatiche.

Introduzione

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Gli studi hanno dimostrato che il tessuto adiposo marrone (BAT) ha una notevole capacità di dissipare energia. Esistono due tipi di adipociti termogenici con caratteristiche dello sviluppo distinte che esistono sia nei roditori che negli esseri umani: adipociti beige e adipociti bruni classici. Mentre gli adipociti bruni classici si trovano per lo più in depositi BAT interscapitolare, gli adipociti beige emergono sporadicamente nel tessuto adiposo bianco (WAT) in risposta ad alcuni segnali fisiologici, come l'esposizione cronica al freddo, un processo chiamato "marrone" o "sbiancamento". Attraverso l'uso di immagini avanzate, è ormai chiaro che gli esseri umani adulti....

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Protocollo

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La cura e la sperimentazione degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dal Comitato istituzionale per la cura degli animali e l'uso presso l'Albert Einstein College of Medicine.

1. Preparazione di digestione tissutale e buffer di lisi

  1. Preparare il buffer di digestione dei tessuti.
    1. Preparare 1 mL di tampone di digestione per ogni grammo di tessuto adiposo.
    2. Pesare 1.5 U/mL collagenae D e 2.4 U/mL dispase II e aggiungere fosfato buffersa salina (PBS).
  2. Preparare il buffer di preparazione dei nuclei (NPB).
    1. Preparare 10 m HEPES, 1,5 mm di cloruro di magnesio, 10 mM di....

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Risultati

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I nuclei di adipociti non ordinati contengono detriti e doppietti che creano rumore e un elevato background nel sequenziamento a valle dell'RNA a cellule singole. La strategia rappresentativa del gate FACS è illustrata nella Figura 1. I nuclei sono stati selezionati per la prima volta in base alla dispersione in avanti (FSC) e alla dispersione laterale (SSC)(A),quindi sono stati selezionati solo i singlet in base alla combinazione di larghezz.......

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Discussione

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Viene presentato un metodo semplice e robusto per isolare i singoli nuclei e studiare l'eterogeneità del tessuto adiposo. Rispetto al sequenziamento dell'RNA di tessuto intero, questo flusso di lavoro offre una visione imparziale dell'eterogeneità cellulare e dei marcatori specifici della popolazione. Questo è significativo e innovativo per il progresso della biologia adipocite, metabolismo molecolare, e la ricerca sull'obesità.

Questo protocollo è particolarmente ottimizzato per l'applicazion.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo David Reynolds, del nucleo di Albert Einstein Genomics, e Jinghang shang dal Flow Cytometry Core per il supporto tecnico. Riconosciamo il sostegno dei National Institutes of Health (NIH) (DK110426) e dei Pilot and Feasibility Grants dell'Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) e del New York Obesity Research Center (DK026687) (tutti a K.S.). Vorremmo anche ringraziare Albert Einstein Cancer Center (CA013330) per il supporto di base.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
autoMACS Soluzione di risciacquoMiltenyi Biotec130-091-222PBS con EDTA; filtrato sterile
BSASigmaA1595
CaCl2Sigma21115
Filtro cellulare 100 μ mCorning431752
Filtro cellulare 40μ mCorning431750
CellTrics (30 μ m)Sysmex04-004-2326
Collagenase DRoche11088866001
Countess II FL Contatore di celle automatizzatoInvitrogenAMQAF1000
DAPISigmaD9542
Dispase IIRoche4942078001
HEPESSigmaH4034
KClFisherP217-3
Filtri intelligenti MACS (30 &; micro; m)Miltenyi Biotec130-098-458Filtri impilabili
MgCl2SigmaM1028
MoFloXDP Cell SorterBeckman CoulterML99030
NP-40Sigma74385
Protettore Inibitore della RNasiRoche3335402001
SucroseFisherS5-3

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  2. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in....

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