Questa pubblicazione descrive un protocollo per l'isolamento dei nuclei dagli adipociti maturi, la purificazione mediante lo smistamento attivato dalla fluorescenza e la trascrittomica a livello di cellula.
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Articolo metodologico
Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula
In questo articolo
Sommario
Abstract
I grassi marroni e beige sono tessuti adipose specializzati che dissipano l'energia per la termogenesi da vie indipendenti e dipendenti da UCP1 (Uncoupling Protein-1). Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici erano considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che ci sono più sottotipi o sottopopolazioni che sono distinti nell'origine dello sviluppo, nell'uso di substrati e nel trascrittoma. Nonostante i progressi nella genomica a singola cellula, la decomposizione imparziale dei tessuti adiposi in sottotipi cellulari è stata difficile a causa della natura fragile degli adipociti pieni di lipidi. Il protocollo presentato è stato sviluppato per aggirare questi ostacoli isolando efficacemente i singoli nuclei dal tessuto adiposo per applicazioni a valle, incluso il sequenziamento dell'RNA. L'eterogeneità cellulare può quindi essere analizzata mediante sequenziamento dell'RNA e analisi bioinformatiche.
Introduzione
Gli studi hanno dimostrato che il tessuto adiposo marrone (BAT) ha una notevole capacità di dissipare energia. Esistono due tipi di adipociti termogenici con caratteristiche dello sviluppo distinte che esistono sia nei roditori che negli esseri umani: adipociti beige e adipociti bruni classici. Mentre gli adipociti bruni classici si trovano per lo più in depositi BAT interscapitolare, gli adipociti beige emergono sporadicamente nel tessuto adiposo bianco (WAT) in risposta ad alcuni segnali fisiologici, come l'esposizione cronica al freddo, un processo chiamato "marrone" o "sbiancamento". Attraverso l'uso di immagini avanzate, è ormai chiaro che gli esseri umani adulti....
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Protocollo
La cura e la sperimentazione degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dal Comitato istituzionale per la cura degli animali e l'uso presso l'Albert Einstein College of Medicine.
1. Preparazione di digestione tissutale e buffer di lisi
- Preparare il buffer di digestione dei tessuti.
- Preparare 1 mL di tampone di digestione per ogni grammo di tessuto adiposo.
- Pesare 1.5 U/mL collagenae D e 2.4 U/mL dispase II e aggiungere fosfato buffersa salina (PBS).
- Preparare il buffer di preparazione dei nuclei (NPB).
- Preparare 10 m HEPES, 1,5 mm di cloruro di magnesio, 10 mM di....
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Risultati
I nuclei di adipociti non ordinati contengono detriti e doppietti che creano rumore e un elevato background nel sequenziamento a valle dell'RNA a cellule singole. La strategia rappresentativa del gate FACS è illustrata nella Figura 1. I nuclei sono stati selezionati per la prima volta in base alla dispersione in avanti (FSC) e alla dispersione laterale (SSC)(A),quindi sono stati selezionati solo i singlet in base alla combinazione di larghezz.......
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Discussione
Viene presentato un metodo semplice e robusto per isolare i singoli nuclei e studiare l'eterogeneità del tessuto adiposo. Rispetto al sequenziamento dell'RNA di tessuto intero, questo flusso di lavoro offre una visione imparziale dell'eterogeneità cellulare e dei marcatori specifici della popolazione. Questo è significativo e innovativo per il progresso della biologia adipocite, metabolismo molecolare, e la ricerca sull'obesità.
Questo protocollo è particolarmente ottimizzato per l'applicazion.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo David Reynolds, del nucleo di Albert Einstein Genomics, e Jinghang shang dal Flow Cytometry Core per il supporto tecnico. Riconosciamo il sostegno dei National Institutes of Health (NIH) (DK110426) e dei Pilot and Feasibility Grants dell'Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) e del New York Obesity Research Center (DK026687) (tutti a K.S.). Vorremmo anche ringraziare Albert Einstein Cancer Center (CA013330) per il supporto di base.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| autoMACS Soluzione di risciacquo | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS con EDTA; filtrato sterile |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Filtro cellulare 100 μ m | Corning | 431752 | |
| Filtro cellulare 40μ m | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μ m) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Contatore di celle automatizzato | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Filtri intelligenti MACS (30 &; micro; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Filtri impilabili |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protettore Inibitore della RNasi | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
Riferimenti
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in....
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Ristampe e permessi
