Articolo metodologico

Analisi cinetica ad alta velocità ad alto rendimento parallela per cleavage del DNA specifico del sito

DOI:

10.3791/61236

⸱

6 maggio 2020

 ,  , 
1Department of Biology, Emmanuel College, 2Department of Chemistry and Physics, Emmanuel College

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viene descritto un metodo altamente parallelo per misurare la scissione specifica del sito del DNA a livello di singola molecola. Questo protocollo illustra la tecnica utilizzando la restrizione endonuclease NdeI. Il metodo può essere facilmente modificato per studiare qualsiasi processo che si traduce in scissione del DNA specifica del sito.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La scissione del DNA specifica del sito (SSDC) è un passo chiave in molti processi cellulari ed è fondamentale per l'editing genico. Questo lavoro descrive un saggio cinetico in grado di misurare SSDC in molte singole molecole di DNA contemporaneamente. I DNA del substrato con legato al tallone, ciascuno contenente una singola copia della sequenza di destinazione, vengono preparati in un canale di flusso microfluidico. Un magnete esterno applica una forza debole alle perline paramagnetiche. L'integrità di un massimo di 1.000 singoli DN può essere monitorata visualizzando le microsfere sotto l'imaging darkfield utilizzando un obiettivo di ingrandimento ampio e basso campo. L'iniezione di una restrizione endonucleasi, NdeI, avvia la reazione scissione. La microscopia video viene utilizzata per registrare il momento esatto di ogni scissione del DNA osservando il fotogramma in cui il tallone associato si muove verso l'alto e verso l'alto dal piano focale dell'obiettivo. Il conteggio del tallone fotogramma per fotogramma quantifica la reazione e una adattamento esponenziale determina il tasso di reazione. Questo metodo consente la raccolta di dati quantitativi e statisticamente significativi sulle reazioni SSDC a singola molecola in un singolo esperimento.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La scissione del DNA specifica del sito (SSDC) è un passo chiave in molte transazioni genomiche. Ad esempio, i sistemi di restrizione batterica (RM)1 e CRISPR2 proteggono le cellule dagli attacchi di fagi e plasmi, riconoscendo e fendendo il DNA estraneo in sequenze specifiche. Nel tipo II RM, le endonucleasi di restrizione (RSI) riconoscono brevi sequenze di coppie di base (bp) 4-8 tramite interazioni proteina-nucleicodell'acido 3. Le endonucleasi associate a CRISPR, come Cas9, si legano ai siti tramite ibridazione del sito di destinazione con crRNA associati alle endonucleasi4<....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fare la cella di flusso

  1. Lavaggio delle coperture
    1. Mettere i coverlips in vasetti di colorazione e sonicare con etanolo (EtOH), quindi con 1 M KOH (per 30 min ciascuno). Per evitare precipitazioni KOH in EtOH, risciacquare accuratamente con ddH2O tra lavaggi.
    2. Ripetere entrambi i passaggi di lavaggio EtOH e KOH 1x per un numero totale di quattro lavaggi (due EtOH e due KOH). Conservare i coperture pulite in ddH2O in vasetti di colorazione.
  2. Tagliare i tubi di carico e di uscita (8 cm di lunghezza) utilizzando un rasoio pulito e inserire nei fori in un vetrerà di vetro pulito. Utilizzare PE-20 per....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizzando questa tecnica, i tassi SSDC di NdeI sono stati misurati per una gamma di concentrazioni proteiche (0,25–4,00 U/mL) a due diverse concentrazioni di magnesio (2 mM e 4 mM). Ognuna di queste condizioni è stata replicata almeno due volte, con poche centinaia di 1.000 DNA con tethering per esperimento. Figura 2 descrive la progettazione sperimentale. Nella figura 3 sono illustrati esempi di dettagli di raccolta e analisi dei dati. La.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo può essere utilizzato per misurare la cinetica di qualsiasi sistema SSDC, a condizione che la separazione del filo sia osservata durante l'esperimento. La rilevazione della scissione è influenzata osservando il distacco del tallone legato e quindi segna l'istante di separazione del filo. Tutti i passaggi precedenti si verificano prima del rilevamento della scissione; pertanto, viene registrato solo il tempo di transito totale.

Il cosorpecco cellulare di flusso è funzionalizzato t.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Science Foundation MCB-1715317.

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5 minuti EpoxyDevcon14250
anti-digossigenina FAB frammenti RocheDiagnostics11214667001
fotocamera e softwareJenoptikGRYPHAX SUBRA
software di analisi datiVernier Inc.
Nastro biadesivoGrace BiolabsSA-S-1L
Dulbeccos Soluzione salina tamponata con fosfatoCorning21-031-CV
etanolo 95%VWR89370-082
primer diretto: digoxigenina-CCAACTTAATCGCCTTGCIntegrated DNA Technologiesn/a
software di analisi delle immaginiNational Institutes of HealthImageJ
microscopio invertitoNikonTE2000
coltello stampanteSilhouette
M13mp18 DNANew England BiolabsN4040S
MyOne perline di streptavidinaThermo Fisher Scientific65601
NdeI enzimaNew England BiolabsR0111S
PCR cleanup kitQiagen28104
pluronic F-127AnatraceP305
tubo in polietilene PE-20BD Intramedic427406
tubo in polietilene PE-60BD Intramedic427416
Q5 MastermixNew England BiolabsM0492S magnete
terre rare 0,5 "OD 0,25" IDImportazioni nazionaliNSN0814
magnete in terre rare 0,75" OD 0,5" IDImportazioni nazionaliNSN0615
primer inverso: biotina-TGACCATTAGATACATTTCGCIntegrated DNA Technologiesn/a
pompa a siringaKent ScientificGenie Plus
β-Caseina da latte bovinoSigma-AldrichC6905
LP in

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tock, M. R., Dryden, D. T. The biology of restriction and anti-restriction. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

DNA ancorato a sferettecanale a flusso microfluidicoimaging a campo oscurovideo microscopiaendonucleasi di restrizione NdeIanalisi di fitting esponenzialeancoraggio a sferette magnetichepreparazione della cella a flusso

Articoli correlati