Misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi

Summary

Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans in un sistema cellulare eterologo utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Abstract

Le interazioni proteiche alle interfacce cellulari impongono una moltitudine di risultati biologici che vanno dallo sviluppo dei tessuti e dalla progressione del cancro alla formazione e al mantenimento della sinapsi. Molte di queste interazioni fondamentali si verificano in trans e sono tipicamente indotte da interazioni eterofile o omofile tra cellule che esprimono coppie di legame ancorate a membrana. Chiarire come le mutazioni rilevanti della malattia interrompano queste interazioni proteiche fondamentali può fornire informazioni su una miriade di campi della biologia cellulare. Molti test di interazione proteina-proteina in genere non disambiguano tra cis e interazioni trans, il che potenzialmente porta a una sopravvalutazione dell'estensione di legame che si sta verificando in vivo e comporta una purificazione intensiva del lavoro delle proteine e / o apparecchiature di monitoraggio specializzate. Qui presentiamo un semplice protocollo ottimizzato che consente l'osservazione e la quantificazione di solo interazioni trans senza la necessità di lunghe purificazione proteica o attrezzature specializzate. Il saggio di aggregazione cellulare HEK prevede la miscelazione di due popolazioni indipendenti di cellule HEK, ognuna delle quali esprime ligandi affini legati alla membrana. Dopo un breve periodo di incubazione, i campioni vengono immagine e gli aggregati risultanti vengono quantificati.

Introduction

Le interazioni sinaptiche facilitate dalle molecole di adesione sinaptica sono fondamentali per lo sviluppo, l'organizzazione, le specifiche, il mantenimento e la funzione delle sinapsi e la generazione di reti neurali. L'identificazione di queste molecole di adesione delle cellule transsinaptiche è in rapido aumento; pertanto, è fondamentale identificare partner vincolanti e capire come queste nuove molecole di adesione interagiscono tra loro. Inoltre, il sequenziamento del genoma ha identificato mutazioni in molte di queste molecole di adesione che sono comunemente collegate a una moltitudine di disturbi del neurosviluppo, neuropsichiatrici e della dipendenza

Protocol

1. Coltura cellulare e trasfezione

1. Rendere i supporti cellulari HEK con DMEM, 1x (Modifica del mezzo dell'aquila di Dulbecco) integrati con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio e FBS al 10%. Filtro sterile.
2. Predeterminare ligandi e recettori adatti per il test di aggregazione.
   NOTA: Neurexin3α SS4+/- e uno dei suoi ligandi noti, LRRTM2, sono stati utilizzati in questo studio. Ligandi e recettori di interesse sono stati espressi da cDNA in pcDNA3.1. Un assieme Gibson è stato utilizzato per inserire Neurexin3α in pcDNA3.1¹². Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGG....

Results

La mutazione A687T aumenta Neurexin3α SS4- legando a LRRTM2⁷
Per indagare come le interazioni intercellulari di due proteine sinaptiche note siano influenzate dall'introduzione di una mutazione puntile riscontrata in un paziente con disabilità intellettiva ed epilessia, abbiamo usato il suddetto saggio di aggregazione cellulare HEK (Figura 1). Le cellule sono state trasfette secondo la sezione 1 e preparate per l'imaging secondo le sezioni 1 e 2 del protocollo........

Discussion

Sezionare le interazioni proteina-proteina che si verificano in trans durante l'adesione cellulare può portare a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base dei processi cellulari di base tra cui la formazione, la funzione e il mantenimento delle sinapsi durante la maturazione e il rimodellamento. Le implicazioni delle interazioni cellula-cellula si espandono oltre la neurobiologia e hanno ruoli più ampi nella trasduzione del segnale, nella migrazione cellulare e nello sviluppo dei^tess.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microprovette monouso da 1,5 mL con tappi a scatto VWR		89000-028	Incubazione di una popolazione mista di cellule HEK
1000 mL Rapid— Unità di filtraggio del flusso, membrana aPES da 0,2 um	Thermo Fisher	567-0020	Sterilizzazione di terreni HEK
Provette per centrifuga SpectraTube da 15 mL	Ward' s Science	470224-998	Raccolta di cellule HEK
Piastre di coltura tissutale sterili a 6 pozzetti	VWR	100062-892	Coltura di cellule HEK
Cloruro di calcio	Sigma	223506-500G	Trasfezione di fosfato di calcio, risospensione cellulare HEK
Centrifuga - Sorvall Legend RT	Kendro Laboratory Products	75004377	Raccolta di cellule HEK
Incubatore	di cellule CO2Thermo Scientific	HERACELL 150i	Incubazione di cellule HEK durante la crescita
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio	Corning	10-013-CV	HEK cell maintenance
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato PBS (1X)	Gibco	14190-144	Passaging/raccolta di cellule HEK
Acido etilendiamminotetraacetico	Sigma	ED-500G	Raccolta di cellule HEK
Falcon Fiasche di coltura ventilate, area di crescita di 75cm2	Corning	9381M26	Coltura di cellule HEK
Siero fetale bovino	Sigma	17L184	Mantenimento
HEK293T cellule	ATCC		Sistema modello
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Analisi delle immagini
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma	M9272-500G	Risospensione cellulare HEK
Fosfato di sodio bibasico anidro	BioReagents	BP332-500	Trasfezione del fosfato di calcio
Tripsina 0,25% (1X) Soluzione	GE Healthcare Life Scienze	SH30042.01	Cellule HEK passanti
Rotatore			del tubo Incubazione di una popolazione mista di cellule HEK
Vetrini per microscopio UltraClear. Bianco Smerigliato, Carica Positiva	Denville Scientific Inc.	M1021	Acquisizione immagini
Microscopio a campo largo	Zeiss	Axio Vert 200M	Acquisizione immagini