L'attuale protocollo genera tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di maglia contenenti cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per consentire lo studio della terapia dell'impianto cellulare per le malattie cardiache.
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Articolo metodologico
Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attuale protocollo descrive i metodi per generare tessuti cardiaci ingegnerizzati scalabili a forma di mesh (ET) composti da cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC), che vengono sviluppate verso l'obiettivo dell'uso clinico. I cardiomiociti derivati dall'HiPSC, le cellule endoteliali e le cellule murali vascolari vengono mescolati con la matrice gel e poi versati in uno stampo di tessuto polidimetlsiloxane (PDMS) con post interni rettangolari sfalsati. Entro il giorno della coltura 14 ET maturano in una struttura a maglia di 1,5 cm x 1,5 cm con fasci di miofibera di 0,5 mm di diametro. I cardiomiociti si allineano all'asse lungo di ogni fascio e battono spontaneamente in modo sincrono. Questo approccio può essere scalato fino a una mesh più grande (3,0 cm x 3,0 cm) ECT, preservando la maturazione e la funzione del costrutto. Pertanto, le ECT a forma di mesh generate da cellule cardiache derivate da hiPSC possono essere fattibili per i paradigmi di rigenerazione cardiaca.
Introduzione
Numerosi studi preclinici e studi clinici hanno confermato l'efficienza delle terapie cardiogenerative a base cellulare per i cuoriche hanno mancato di cuore 1,2,3. Tra i vari tipi di cellule, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono promettenti fonti cellulari in virtù della loro capacità prolifertiva, potenziale per generare varie linee cardiovascolari4,5e allogenicità. Inoltre, le tecnologie di ingegneria tissu/tessuto hanno reso possibile il trasferimento di milioni di cellule su un cuore
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Protocollo
1. Manutenzione di hiPSC e differenziazione cardiovascolare
- Espandere e mantenere iPSC sulla matrice di membrana seminterrato thin-coat (fattore di crescita ridotto, diluizione 1:60) in mezzo condizionato estratto da fibroblasti embrionali di topo (MEF-CM) con fattore di crescita fibroblasta di base umano (hbFGF)4.
NOTA: Abbiamo usato una linea hiPSCs (4 fattori (oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc): 201B6). Aggiungere hbFGF alla concentrazione appropriata per ogni linea cellulare. Il frammento laminin-511 può essere utilizzato anche per il rivestimento del piatto di coltura al posto della matrice della membrana seminterrato. Il mezzo dispo....
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Risultati
Figura 1A,B mostra gli schemi del protocollo CM-EC e MC. Dopo aver indotto cMs e ECs dal protocollo CM-EC e MCs dal protocollo MC, le cellule sono mescolate regolando le concentrazioni mc finali per rappresentare il 10-20% delle cellule totali. Lo stampo vessu su tessuto largo 2 cm viene fabbricato secondo il disegno di progettazione da un foglio PDMS di 0,5 mm di spessore(Figura 2A,B). Sei milioni di cellule CM-EC-MC sono combi.......
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Discussione
Dopo il completamento della nostra indagine su un formato lineare, derivato da hiPSC ECT5, abbiamo adattato il protocollo per mescolare CIC, EC e MC derivati da hiPSC per facilitare l'espansione in vitro delle cellule vascolari all'interno delle ECT e il successivo accoppiamento vascolare in vivo tra ECT e miocardio ricevente.
Per facilitare la generazione di geometrie ECT mesh più grandi e impiantabili abbiamo usato sottili fogli PDMS per progettare gli stampi 3D con p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti finanziari o scientifici da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Kosair Charities Pediatric Heart Research Program presso l'Università di Louisville e dal Progetto Organoid presso il RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Gli HiPSC utilizzati nei nostri protocolli pubblicati sono stati forniti dal Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Giappone.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali | |||
| colture cellulari 100x20 mm stile | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Piastre multipozzetto per colture cellulari 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Kit elastomero siliconico Sylgard 184 | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, ricombinante (10µ g) | R& D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagene, soluzione di tipo I da coda di ratto | Sigma | C3867 | |
| Fattore di crescita ridotto Matrigel | Corning | 356231 | |
| VEGF umano (165) IS, grado premium | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0,2 e micro; m filtrato (soluzione al 10% in acqua) | Sonde molecolari | P-6866 | |
| Umano ricombinante bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Activina umana/topo/ratto ricombinante (50µ g) | R& D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µ g) | R& D | 5036-WN | |
| Soluzione di Versene | Gibco | 15040066 | |
| Terreno di coltura e integratori | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Etanolo | SIGMA | M6250 | |
| B27 integratore meno insulina | Gibco | ||
| DMEM, | Siero fetale bovino | 11965084 | |
| (500ml) | Qualsiasi | ||
| siero fetale bovino (500ml) | Qualsiasi | ||
| L-glutammina | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Qualsiasi | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillina-Streptomicina (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| α MEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Citometria a flusso | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-troponina T, Isoforma cardiaca Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Soluzione | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Confezione da 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Qualsiasi | ||
| LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte Aqua fissabile, per eccitazione a 405 nm | Sonde molecolari | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Kit di etichettatura | Sonde molecolari | Z25002 |
Riferimenti
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E.
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Ristampe e permessi
