Questo protocollo descrive un saggio nonradioattivo per misurare l'attività della chinasi delle chinasi polinucleotide (PNKs) su piccoli substrati di DNA e RNA.
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Articolo metodologico
Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le chinasi polinucleotide (PNK) sono enzimi che catalizzare la fosforilazione dell'estremità idrossile 5' del DNA e dell'RNA oligonucleotidi. L'attività dei PNK può essere quantificata utilizzando approcci diretti o indiretti. Qui è presentato un approccio diretto in vitro per misurare l'attività PNK che si basa su un substrato oligonucleotide etichettato fluorescente e elettroforesi gel poliacrilammide. Questo approccio fornisce la risoluzione dei prodotti fosforilati evitando l'uso di substrati con etichettatura radio. Il protocollo descrive in dettaglio come impostare la reazione di fosforilazione, preparare ed eseguire grandi gel di poliacrilammide e quantificare i prodotti di reazione. La parte più tecnicamente impegnativa di questo saggio è versare ed eseguire i grandi gel di poliacrilammide; vengono quindi forniti dettagli importanti per superare le difficoltà comuni. Questo protocollo è stato ottimizzato per Grc3, un PNK che si assembla in un complesso di elaborazione dell'RNA pre-ribosomico obbligatorio con il suo partner vincolante, il nucleasi Las1. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per misurare l'attività di altri enzimi PNK. Inoltre, questo saggio può anche essere modificato per determinare gli effetti di diversi componenti della reazione, come il triphosfato nucleoside, gli ioni metallici e gli oligonucleotidi.
Introduzione
Le chinasi polinucleotide (PNK) svolgono un ruolo fondamentale in molti percorsi di elaborazione del DNA e dell'RNA, come la riparazione del DNA e l'assemblaggio delribosoide 1,2,3,4,5. Questi enzimi fondamentali catalizzano il trasferimento del monofosfato terminale (gamma) da un triphosfato nucleoside (NTP, il più delle volte ATP) all'estremità idrossile da 5' di un substrato nucleotide. Uno dei PNK più caratterizzati è il batteriofago T4 PNK, che ha un'ampia specificità del substrato ed è fortemente util....
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Protocollo
1. Preparazione
- Preparare buffer e reagenti.
- Fare 1x Buffer di reazione combinando 20 L di 1 M Tris (pH - 8,0), 40 L di cloruro di sodio 5 M, 2,5 L di 2 M di cloruro di magnesio, 100 L del 50% (v/v) glicerolo e acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 1 mL.
- Fare il colorante di carico dell'urea combinando 4,8 g di urea, 200 L di 1 M Tris (pH - 8,0), 20 L di 0,5 M EDTA (pH - 8,0), 0,5 mL dell'1% (w/v) di blu bromofenolo e acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 10 mL.
- Fare 10x TBE buffer combinando 108 g di base Tris, 55 g di acido borico, 40 mL di 0,5 M EDTA (pH - 8,0) e acqua libera da RNase per raggi....
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Risultati
Nella Figura 1è illustrato un gel rappresentativo di successo di una titolazione di ATP con una quantità fissa di complesso Las1-Grc3 . L'aggiunta dell'enzima ha portato alla scissione dell'RNA mediata da Las1 del substrato di RNA SC-ITS2, portando a un frammento di RNA definito (5-OH C2 RNA). Dopo l'aggiunta di ATP, il frammento di RNA C2 è stato fosforilato da Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Nei gel denaturing l'RNA fosforilato migra più velocemente della sua contro.......
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Discussione
Descritto è un saggio per misurare l'attività della chinasi di Grc3 PNK su substrati nucleotidi etichettati fluorescentemente. Questo protocollo può essere applicato per caratterizzare altri enzimi PNK adattando il buffer di reazione e il substrato di oligonucleotide. Ad esempio, il protocollo richiede una quantità di traccia di EDTA. L'aggiunta di EDTA è vantaggiosa per due motivi: in primo luogo, questo approccio favorisce Grc3 legato al magnesio impedendo all'enzima di legarsi alla traccia di tracce di metalli contami.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Andrew Sikkema e Andrea Kaminski per la loro lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health Intramural Research Program degli Stati Uniti; Istituto Nazionale delle Scienze della Salute Ambientale degli Stati Uniti (NIEHS; ES103247 a R.E.S) e i Canadian Institutes of Health Research (CIHR; da 146626 a M.C.P).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pettine a 34 pozzetti da 0,4 mm | BioRad | 1653848 | |
| Distanziatore da 0,4 mm | BioRad | 1653812 | |
| 0,5 M EDTA ph 8,0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Cloruro di magnesio | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8,0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| Soluzione di acrilammide/Bis al 40% 29:1 | BioRad | ||
| 5M Cloruro di sodio | KD Medical | RGF-3720 | |
| persolfato di ammonio (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| acido borico | Sigma | B0394 | |
| bromofenolo sale sodico blu | Sigma | B5525-5G | |
| Lastre di vetro | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Immagine J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Marcato RNA oligonucleotidi | IDT | Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Alimentatore | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filtro | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Acqua DEPC ultra pura | Invitrogen | 750023 | |
| Glicerolo ultra puro | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
Riferimenti
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E.
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Ristampe e permessi
Tag
Saggio della polinuclotide chinasisubstrato di oligonucleotidi fluorescentielettroforesi su gel di poliacrilammidepreparazione del gel denaturanteesperimento di titolazione dell'ATPfosforilazione del substrato di RNAcomplesso Grc3 Las1colorante di caricamento con ureapolimerizzazione TEMED APSimaging mediante scanner laser
