Uno screening genetico in avanti basato sull'elevazione di Ca2 o più come lettura porta all'identificazione dei componenti genetici coinvolti nei percorsi di segnalazione dipendenti dal calcio nelle piante.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Schermo genetico in avanti utilizzando Transgenic Calcium Reporter Aequorin per identificare nuovi obiettivi nella segnalazione di calcio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli screening genetici in avanti sono stati strumenti importanti nell'identificazione imparziale dei componenti genetici coinvolti in diversi percorsi biologici. La base dello schermo è quello di generare una popolazione mutante che può essere vagliata con un fenotipo di interesse. L'EMS (ethyl eilfonato di metano) è un agente alchilante comunemente usato per indurre mutazioni casuali in uno screening genetico classico in avanti per identificare più geni coinvolti in un dato processo. L'elevazione del calcio citosolico (Ca2)è una via di segnalazione precoce chiave che si attiva sulla percezione dello stress. Tuttavia, l'identità di recettori, canali, pompe e trasportatori di Ca2 è ancora sfuggente in molti sistemi di studio. Aequorin è una proteina reporter di calcio cellulare isolata da Aequorea victoria e stabilmente espressa in Arabidopsis. Sfruttando questo, abbiamo progettato uno schermo genetico in avanti in cui abbiamo EMS-mutagenizzato l'aequorin transgenico. I semi delle piante mutanti sono stati raccolti (M1)e lo screening per il fenotipo di interesse è stato effettuato nella popolazione segregazione (M2). Utilizzando un protocollo di misurazione Ca2o, con 96 pozzedi ad alto rendimento, è possibile identificare diversi nuovi mutanti che hanno una risposta di calcio variabile e vengono misurati in tempo reale. I mutanti con il fenotipo di interesse vengono salvati e propagati fino a ottenere una popolazione di piante mutanti omozice. Questo protocollo fornisce un metodo per gli schermi genetici in avanti in secondo piano per i giornalisti ca2 e per identificare i nuovi obiettivi regolamentati ca2.
Introduzione
Un cambiamento nella concentrazione di calcio citosolico (Ca2)dopo la percezione dello stimolo biotico o abiotico è un evento di segnalazione precoce ben studiato che attiva molte vie di segnalazione1,2,3,4.4 Una cellula nel suo stato di riposo basale mantiene una minore concentrazione di Ca2 o nel citosol e sequestri in eccesso Ca2 , in vari organelli intracellulari e apoplasta extracellulare che porta ad un ripido Ca2o gradiente5,6. Dopo ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Mutagenesi ems e raccolta di semi a base di un singolo albero genealogico (1-3 mesi)
- Pesare 150 mg di semi (7500 dollari) di aequorina per la mutagenesi EMS (M0 semi). Pesare altri 150 mg di semi da utilizzare come controllo.
- Trasferire i semi in un tubo da 50 mL e aggiungere 25 mL di 0,2% EMS (v/v) (CAUTION) (per il trattamento) o 25 mL di acqua autoclaved (per il controllo).
NOTA: il solfonato di metano etilico è un agente chimico per la mutagenizzazione del materiale vegetale. - Sigillare il tubo con parafilm e avvolgerlo in un foglio di alluminio. Ruotare l'estremità finale del tubo per 18 h a temperatura ambiente. ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La popolazione di EMS è stata sottoposta a screening per l'elevazione di H2O2 indotta da Ca2. Come discusso in precedenza, 12 singole piantine M2 sono state schermate da ogni linea M1. Nella Figura 3, una di queste linee M1 viene tracciata con ogni pannello che mostra 12 singole piantine M2. Un aequorin wild-type viene utilizzato come controllo per confrontare e valutare la risposta mutante. Un mutante recessivo seg.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La mutagenesi EMS è un potente strumento per generare mutazioni nella popolazione. Gli schermi genetici classici che utilizzano lo SME sono stati uno strumento efficace per identificare nuovi geni per due motivi principali: in primo luogo, non richiedono alcuna ipotesi preliminare sull'identità genica e, in secondo luogo, non introducono alcuna distorsione. Ci sono diversi metodi per generare una popolazione di screening come EMS, inserimenti T-DNA, radiazioni ecc. Tra tutti i metodi, la mutagenesi basata su EMS ha pochi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha alcun conflitto di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'Istituto Nazionale di Ricerca sul Genoma Vegetale - Phytotron Facility per la crescita delle piante, Bombay Locale per le riprese video e il Consorzio Department of Biotechnology- eLibrary per aver fornito l'accesso alle risorse e-resources. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Biotecnologia, India attraverso il National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group programma; e CSIR-Junior Research Fellowship (a D.M e S.M) e Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (a R.P).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti | Jetbiofil | 11024 | per piantine in crescita |
| cliniplate bianca a 96 pozzetti | Thermo Scientific | 9502887 | per misurazioni luminometriche |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | per la crescita delle piante | |
| Cloruro di calcio | Fisher Scientific | 12135 | per scarico soluzione |
| Celenterazina | PJK | 55779-48-1 | gruppo protesico per equorina |
| Etilmetano solfonato | Sigma Aldrich | M0880-5G | per mutagenesi dei semi |
| Etanolo | Reagente analitico | 1170 | per soluzione di scarica |
| Acido cloridrico | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | soluzione di sterilizzazione |
| Perossido di idrogeno | Fisher Scientific | 15465 | come stimolo per l'elevazione del calcio |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | misurazione della luminescenza dell'equorina | |
| tampone MES Himedia | RM1128-100G | di | |
| Murashige e skoog Himedia | PT021-25L | crescita delle piante | |
| Idrossido di sodio | Fisher Scientific | 27805 | per neutralizzare EMS |
| Ipoclorito di sodio | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | soluzione di sterilizzazione |
| Tiosolfato di sodio | Fisher Scientific | 28005 | per il lavaggio delle sementi nella fase 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | per la crescita delle piante | |
| Vasi quadrati | Lab Chem India | per la crescita delle piante | |
| Saccarosio | Sigma Aldrich | S0389 | crescita delle piante |
| Taxim | Alkem | 7180720 | per il salvataggio delle piantine |
Riferimenti
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
