Una piattaforma tecnologica open source per la produzione di modelli di cultura 3D basati su idrogel in modo automatizzato e standardizzato

Sommario

Questo protocollo funge da tutorial completo per la miscelazione standardizzata e riproducibile di materiali viscosi con una nuova tecnologia di automazione open source. Vengono fornite istruzioni dettagliate sul funzionamento di una workstation open source di nuova concezione, sull'utilizzo di un progettista di protocolli open source e sulla convalida e verifica per identificare miscele riproducibili.

Abstract

Le attuali fasi di miscelazione di materiali viscosi si basano su attività ripetitive e dispendiose in termini di tempo che vengono eseguite principalmente manualmente in una modalità a bassa produttività. Questi problemi rappresentano svantaggi nei flussi di lavoro che possono alla fine comportare l'irriproducibilità dei risultati della ricerca. I flussi di lavoro manuali stanno ulteriormente limitando il progresso e l'adozione diffusa di materiali viscosi, come gli idrogel utilizzati per applicazioni biomediche. Queste sfide possono essere superate utilizzando flussi di lavoro automatizzati con processi di miscelazione standardizzati per aumentare la riproducibilità. In questo studio, presentiamo istruzioni dettagliate per utilizzare un progettista di protocolli open source, per gestire una workstation open source e per identificare miscele riproducibili. In particolare, il progettista di protocollo open source guida l'utente attraverso la selezione dei parametri sperimentali e genera un codice di protocollo pronto all'uso per far funzionare la workstation. Questa workstation è ottimizzata per il pipettaggio di materiali viscosi per consentire una gestione automatizzata e altamente affidabile mediante l'integrazione di banchine di temperatura per materiali termoresponsivi, pipette a spostamento positivo per materiali viscosi e un dock touch a punta opzionale per rimuovere il materiale in eccesso dalla punta della pipetta. La validazione e la verifica delle miscele vengono eseguite mediante una misurazione dell'assorbanza rapida ed economica di Orange G. Questo protocollo presenta i risultati per ottenere miscele di glicerolo all'80% (v/v), una serie di diluizione per gelatina metacriloil (GelMA) e idrogel a doppia rete del 5% (p/v) gelMA e 2% (p/v) alginato. È inclusa una guida alla risoluzione dei problemi per supportare gli utenti con l'adozione del protocollo. Il flusso di lavoro descritto può essere ampiamente applicato a una serie di materiali viscosi per generare concentrazioni definite dall'utente in modo automatizzato.

Introduzione

La riproducibilità e la replicabilità sono di fondamentale importanza nel lavoro ^{scientifico1,2,3,4}. Tuttavia, prove recenti hanno evidenziato sfide significative nel ripetere studi biomedici ad alto impatto nella scienza fondamentale e nella ricerca traslazionale4,5,6,7. I fattori che contribuiscono a risultati irriproducibili sono complessi e molteplici, come la progettazione di studi scadente o ^distorta6,8, una potenza statistica ^{insufficiente3,9}, la mancata conformità agli standard di ^{segnalazione7,10,11}, ^la pressione per la ^{pubblicazione6} o metodi non disponibili o codice ^software6,9 . Tra questi, sottili cambiamenti nel protocollo ed errori umani nell'esecuzione degli esperimenti sono stati identificati come ulteriori elementi che spiegano l'irriproducibilità4. Ad esempio, le attività di pipettaggio manuale introducono imprecisione intra e interindividuale12,13 e aumentano la probabilità di errori ^umani14. Mentre i robot commerciali per la movimentazione dei liquidi sono in grado di superare questi inconvenienti e hanno dimostrato una maggiore affidabilità per i liquidi15,16,17, la movimentazione automatizzata di materiali con proprietà viscose significative è ancora impegnativa.

I robot commerciali per la movimentazione dei liquidi utilizzano comunemente pipette a cuscino d'aria, note anche come pipette a pistone d'aria o a spostamento d'aria. Il reagente e il pistone sono separati da un cuscino d'aria che si restringe durante le fasi di erogazione e si espande durante le fasi di aspirazione. Utilizzando pipette a cuscino d'aria, i materiali viscosi "fluiscono" solo lentamente dentro e fuori dalla punta e il ritiro anticipato della pipetta dal serbatoio può comportare l'aspirazione di bolle d'aria. Durante le attività di erogazione, il materiale viscoso lascia un film sulla parete interna della punta che "scorre" solo lentamente o per niente quando viene forzato dall'aria. Per ovviare a questi problemi, sono state introdotte commercialmente pipette a spostamento positivo per estrudere attivamente il materiale viscoso dalla punta utilizzando un pistone solido. Sebbene queste pipette a spostamento positivo consentano una gestione accurata e affidabile di materiali viscosi, le soluzioni automatizzate con pipette a spostamento positivo sono ancora troppo costose per le impostazioni di laboratorio accademiche e, pertanto, la maggior parte dei flussi di lavoro con materiali viscosi si basa esclusivamente su attività di pipettaggio ^manuale18.

In generale, la viscosità è definita come la resistenza di un fluido al flusso e i materiali viscosi vengono ulteriormente definiti come materiali con una maggiore viscosità dell'acqua (0,89 mPa·s s a 25 °C). Nel campo delle applicazioni biomediche, le configurazioni sperimentali contengono spesso più materiali con una viscosità maggiore dell'acqua, come il dimetilsolfossido (DMSO; 1,99 mPa·s a 25 °C), il glicerolo (208,1 mPa·s a 25 °C per il 90% di glicerolo [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s a 25 °C) e polimeri gonfi d'acqua, denominati ^{idrogel19, 20}. Gli idrogel sono reti polimeriche idrofile disposte in modalità fisica e / e chimica utilizzate per varie applicazioni, tra cui l'incapsulamento cellulare, la somministrazione di farmaci e attuatori morbidi19,20,21,22. La viscosità degli idrogel dipende dalla concentrazione del polimero e dal peso ^molecolare19. Gli idrogel utilizzati di routine per applicazioni biomediche presentano valori di viscosità compresi tra 1 e 1000 mPa·s, mentre sono stati riportati sistemi idrogel specifici con valori fino a 6 x ¹⁰⁷ mPa·s19,23,24. Tuttavia, le misurazioni della viscosità degli idrogel non sono standardizzate in termini di protocollo di misurazione e preparazione del campione e, pertanto, i valori di viscosità tra diversi studi sono difficili da confrontare.

Poiché le soluzioni automatizzate disponibili in commercio specificamente progettate per gli idrogel sono mancanti o troppo costose, gli attuali flussi di lavoro per l'idrogel dipendono dalla movimentazione ^manuale18. Per comprendere i limiti dell'attuale flusso di lavoro manuale per il pipettaggio degli idrogel, è importante comprendere le attività di gestione ^essenziali18. Ad esempio, una volta che un nuovo materiale idrogel è stato sintetizzato, viene generata una concentrazione desiderata o una serie di diluizione con concentrazioni variabili per identificare protocolli di sintesi affidabili e caratteristiche di reticolazione con successiva analisi delle proprietà meccaniche25,26,27,28 . In generale, una soluzione madre viene preparata o acquistata e successivamente miscelata con un diluente e/o altri reagenti per ottenere una miscela. Le attività di miscelazione non vengono per lo più eseguite direttamente in una piastra di pozzo (o in qualsiasi formato di output) e vengono piuttosto eseguite in un tubo di reazione separato, che viene comunemente indicato come mix master. Durante queste attività di preparazione, sono necessarie varie fasi di aspirazione ed erogazione per trasferire il materiale viscoso, mescolare i reagenti e trasferire la miscela in un formato di uscita (ad esempio, una piastra da 96 pozzetti). Questi compiti richiedono un'elevata quantità di lavoro ^umano18, lunghe ore sperimentali e aumentano la probabilità di errori umani che potrebbero potenzialmente manifestarsi come risultati imprecisi. Inoltre, la movimentazione manuale impedisce la preparazione efficiente di numeri di campioni elevati per lo screening di varie combinazioni di parametri per una caratterizzazione dettagliata. L'elaborazione manuale impedisce anche l'uso di idrogel per applicazioni di screening ad alto rendimento, come l'identificazione di composti promettenti durante lo sviluppo di farmaci. Le attuali fasi di preparazione basate su manuale non sono fattibili per lo screening di librerie di farmaci costituite da migliaia di farmaci. Per questi motivi, sono necessarie soluzioni automatizzate per fornire un processo di sviluppo efficiente e consentire la traduzione di successo di idrogel per applicazioni di screening dei farmaci.

Per passare da flussi di lavoro manuali a processi automatizzati, abbiamo ottimizzato un robot di pipettaggio open source commerciale per la movimentazione di materiali viscosi mediante l'integrazione di banchine di temperatura per materiali termoresponsivi, l'utilizzo di pipette a spostamento positivo pronte all'uso utilizzando punte a pistone capillare e un dock touch a punta opzionale per la pulizia della punta della pipetta. Questo robot di pipettaggio è stato ulteriormente integrato come modulo di pipettaggio in una workstation open source di nuova concezione, composta da moduli pronti per l'installazione e ^{personalizzabili18,29}. Le istruzioni di montaggio dettagliate per la workstation sviluppata, inclusi i file hardware e software, sono liberamente accessibili da GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) e dal repository Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Oltre allo sviluppo hardware, è stata programmata e rilasciata un'applicazione di progettazione di protocolli open source per guidare l'utente attraverso il processo di selezione dei parametri e generare un codice di protocollo pronto all'uso (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Questo codice viene eseguito sul robot di pipettaggio open source commerciale e sulla workstation open source sviluppata.

Qui viene fornito un tutorial completo sul funzionamento della workstation open source per automatizzare le attività di miscelazione per materiali viscosi (Figura 1). I passaggi del protocollo specifici del tutorial possono essere eseguiti con la workstation open source sviluppata e il robot di pipettaggio open source commerciale. Supportato da un'applicazione di progettazione del protocollo open source sviluppata internamente, viene dimostrata la miscelazione e la preparazione automatizzate delle concentrazioni richieste per glicerolo, gelatina metacriloil (GelMA) e alginato. Il glicerolo è stato selezionato in questo tutorial, poiché è ben ^{caratterizzato30,31}, è economico e prontamente disponibile e, pertanto, è comunemente usato come materiale di riferimento viscoso per attività di pipettaggio automatizzate. Come esempi per gli idrogel utilizzati in applicazioni biomediche, le soluzioni precursori di GelMA e alginato idrogel sono state applicate per esperimenti di miscelazione automatizzati. GelMA presenta uno degli idrogel più comunemente usati per gli studi di incapsulamento ^{cellulare32,33} e l'alginato è stato selezionato in questo studio per dimostrare la capacità di produrre idrogel a doppia ^rete34,35. Utilizzando Orange G come colorante, è stata implementata una procedura rapida ed economica per convalidare e verificare i risultati della miscelazione con uno spettrofotometro16.

Un robot di pipettaggio open source commerciale è stato integrato come modulo di pipettaggio nella workstation open source sviluppata (Figura 2a) e, pertanto, il nome "modulo di pipettaggio" viene ulteriormente utilizzato per descrivere il robot di pipettaggio. Una descrizione dettagliata dell'hardware installato esula dallo scopo di questo protocollo ed è disponibile tramite i repository forniti che includono anche istruzioni dettagliate per l'assemblaggio generale della piattaforma open source. Il modulo di pipettaggio può essere dotato di due pipette (pipetta a singolo o 8 canali) che sono installate sull'asse A (a destra) e sull'asse B (a sinistra) (Figura 2b). Il modulo di pipettaggio offre una capacità di 10 ponti secondo gli standard ANSI/SLAS (American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening) e sul ponte sono definite le seguenti posizioni di posizione: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Figura 2c). Per avviare la polimerizzazione fotoindotta di soluzioni di idrogel, è necessario un modulo reticolante separato che è stato aggiunto alla workstation. Il modulo reticolante è dotato di LED con una lunghezza d'onda di 400 nm e, quindi, sostanze che eccitano a una lunghezza d'onda della luce visibile possono essere utilizzate con i sistemi attuali, come il litio fenil-2,4,6 trimetilboilfosfinato (LAP)^36,37. L'intensità (in mW/^cm2) dei LED può essere affrontata dall'utente nell'applicazione di progettazione del protocollo per studiare il comportamento di reticolazione38. La workstation include anche un modulo di archiviazione per consentire studi di maggiore produttività; tuttavia, questo modulo non viene utilizzato all'interno di questo studio e, pertanto, non ulteriormente descritto. In generale, si consiglia di utilizzare il modulo di pipettaggio in un armadio di sicurezza biologica per evitare la contaminazione del campione. Il circuito di alimentazione principale per far funzionare il modulo di pipettaggio è un circuito a 12 V, che è considerato un'applicazione a bassa tensione nella maggior parte dei paesi. Tutti i componenti elettrici sono basati su una scatola di controllo dedicata che impedisce agli utenti di entrare in contatto con la fonte di un pericolo elettrico.

Seguendo questi protocolli di miscelazione standardizzati, i ricercatori sono in grado di ottenere miscele affidabili per materiali viscosi e non viscosi in modo automatizzato. L'approccio open source consente agli utenti di ottimizzare le sequenze di mixaggio e condividere i protocolli di nuova concezione con la comunità. In definitiva, questo approccio faciliterà lo screening di più combinazioni di parametri per indagare le interdipendenze tra diversi fattori e, quindi, accelerare l'applicazione affidabile e lo sviluppo di materiali viscosi per applicazioni biomediche.

Protocollo

NOTA: il protocollo inizia con un'introduzione a (1) il software e (2) la configurazione hardware per familiarizzare l'utente con le installazioni richieste e la workstation. Dopo una sezione su (3) la preparazione del materiale e (4) l'utilizzo dell'applicazione di progettazione del protocollo, (5) la calibrazione del modulo di pipettaggio e (6) l'esecuzione del protocollo automatizzato è evidenziata in dettaglio. Infine, (7) vengono descritte le procedure di convalida e verifica, compresa la lettura dell'assorbanza e l'analisi dei dati. Nella Figura 1 viene visualizzato un flusso di lavoro di protocollo generale con singole attività.

1. Configurazione del software

NOTA: questa sezione include istruzioni dettagliate per installare l'API (Application Programming Interface), nonché l'applicazione di progettazione del protocollo richiesta e il terminale di calibrazione. Le seguenti istruzioni sono scritte per un computer a scheda singola Raspberry Pi (RPi); tuttavia anche Windows 8, 10 e macOS 10.13+ sono stati utilizzati con successo con l'API e le applicazioni.

1. Configurare l'ambiente del computer.
   NOTA: avere familiarità con le basi di ^Python39, come configurare e utilizzare un Raspberry ^Pi40,41 e come connettersi a ^Internet42. I seguenti passaggi tutorial si concentrano sui passaggi specifici del protocollo e ulteriori informazioni sull'utilizzo di un Raspberry Pi sono disponibili ^online40.
   1. Apri una finestra del terminale dalla barra delle applicazioni o dal menu dell'applicazione.
   2. Aggiornare l'elenco dei pacchetti del sistema:
      sudo apt-get aggiornamento
   3. Aggiornare tutti i pacchetti installati:
      sudo apt-get dist-upgrade
   4. Riavvia il Raspberry Pi:
      sudo riavvio
   5. Controlla la versione di Python installata:
      python3 --versione
      Assicurarsi che sia installato almeno Python 3.5; in caso contrario, installare la versione più ^recente43.
   6. Installa python pip, che pubblica i pacchetti Python con il Python Package ^Index44:
      sudo apt-get installare python3-pip
   7. Installare le dipendenze:
      pip install numpy
      pip install python-resize-image
      NOTA: se si utilizza Windows, è necessario installare il pacchetto windows-curses tramite: python -m pip install windows-curses
2. Installare l'API (Application Programming Interface).
   NOTA: l'API fornisce un semplice framework Python progettato per scrivere script di protocolli sperimentali e gestire la workstation. Le due API seguenti sono necessarie per eseguire correttamente il codice di protocollo generato.
   1. Installare l'API della workstation:
      pip install openworkstation
   2. Installare Opentrons API per far funzionare il modulo di pipettaggio:
      pip install opentrons==2.5.2
   3. Verificare se l'API è installata correttamente:
      python3
      >>> importazione openworkstation
      >>> importare opentron
      NOTA: la dimensione dell'API e dell'applicazione di progettazione del protocollo è rispettivamente di 2,2 MB e 1,2 MB. Non si sono verificati problemi durante l'installazione se utilizzato con spazio su disco limitato (200 MB). Tuttavia, i requisiti di spazio su disco dipendono dal sistema operativo.
3. Selezionare una directory per il download dei file (terminale di calibrazione, applicazione di progettazione del protocollo, ecc.).
   NOTA: i file possono essere copiati e incollati altrove in seguito.
4. Clona i file dal repository GitHub:
   git clone https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
   NOTA: Il comando 'git clone' clona e successivamente salva tutti i file nella directory, che è aperta nel terminale in questo momento. Poiché il repository include anche i file hardware per l'assembly, non è necessario l'intero repository per eseguire i protocolli presentati. Tutti i file necessari per replicare gli esperimenti sono disponibili come file supplementare e nel repository GitHub sotto "/examples/publication-JoVE".
5. Aprire la cartella scaricata. Se l'intero repository è stato scaricato, passare alla cartella 'publication-JoVE' tramite
   cd openworkstation/esempi/pubblicazione-JoVE
   NOTA: questa cartella include i file necessari per il funzionamento della workstation e l'utilizzo dell'applicazione di progettazione del protocollo e del terminale di calibrazione.

2. Configurazione hardware

1. Posizionare la postazione di lavoro in un armadio di sicurezza biologica per evitare la contaminazione del campione.
2. Installare le pipette sulla workstation.
   1. Selezionare la dimensione della pipetta in base alla configurazione sperimentale. In generale, prendi una dimensione della pipetta il cui volume da aspirare si trova all'estremità superiore della gamma. Se per una configurazione specifica sono necessarie attività di miscelazione con volumi superiori a 1 mL (ad esempio, aspirazione/erogazione di 2 mL), scegliere l'M1000E con un volume massimo di aspirazione/erogazione di 1.000 μL per ridurre al minimo le fasi di pipettaggio e risparmiare tempo.
      NOTA: un'istruzione dettagliata per le pipette a spostamento d'aria è disponibile ^online45. Il modulo di pipettaggio sviluppato è in grado di integrare le seguenti pipette a spostamento positivo pronte all'uso: M10E (1-10 μL), M25E (3-25 μL), M50E (20-50 μL), M100E (10-100 μL), M250E (50-250 μL), M1000E (100-1.000 μL).
   2. Utilizzare una chiave a brugola M4 per allentare e stringere le viti.
   3. Fissare le due piastre di fissaggio della pipetta (piastre acriliche bianche) alla guida in alluminio e stringere liberamente le viti M5.
   4. Inserire la pipetta nelle due piastre di fissaggio della pipetta e assicurarsi che la coda ergonomica della pipetta sia appoggiata sul lato opposto della piastra di montaggio acrilica.
   5. Stringere saldamente le quattro viti delle due piastre di fissaggio della pipetta.
   6. Far scorrere i due dadi di fissaggio quadrati, che sono fissati alla piastra di montaggio acrilica, nella fessura di estrusione dell'asse z e stringere le viti.
      NOTA: Fissare saldamente la pipetta per evitare qualsiasi movimento durante il funzionamento.

3. Preparazione del materiale

NOTA: I materiali viscosi (glicerolo, GelMA, alginato) sono utilizzati per gli esperimenti presentati in questo studio e, pertanto, i volumi preparati e le attività di manipolazione (ad esempio, aggiungere 5 ml di soluzione madre in 5 mL di tubi di reazione) sono specifici per questa configurazione sperimentale.

1. Gelatina metacriloile (GelMA)
   NOTA: La funzionalizzazione, la dialisi e la liofilizzazione di GelMA non sono lo scopo di questo documento e un protocollo passo-passo è disponibile in Loessner et ^al.33. Il protocollo inizia utilizzando GelMA liofilizzato, che può essere preparato internamente o acquistato commercialmente.
   1. Calcola la massa richiesta di GelMA (_mGelMA) in base alla concentrazione finale di stock desiderata (_cGelMA) e al volume (_VGelMA) usando l'equazione:
      _mGelMA = _cGelMA x _VGelMA
      NOTA: VGelMA dipende dalla configurazione sperimentale e si consiglia di preparare il 20-30% di materiale in eccesso. I protocolli presentati iniziano con 5 ml di GelMA al 20% (p/v) come soluzione madre.
   2. Pesare la quantità richiesta di GelMA liofilizzato, aggiungerlo in un tubo di reazione da 50 ml e aggiungere la quantità richiesta di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   3. Mescolare GelMA immergendolo nel solvente a 4 °C durante la notte o riscaldando a 60 °C per 6 ore a bagnomaria.
      NOTA: Le soluzioni sterili di GelMA possono essere conservate al riparo dalla luce a 4 °C per almeno sei mesi.
   4. Riempire 5 mL di GelMA in 5 mL di tubi di reazione.
2. Fotoiniziatore: Litio fenil-2,4,6-trimetilbibenzoilfosfinato (LAP)
   NOTA: evitare un'ulteriore esposizione alla luce della stanza, poiché LAP è sensibile alla luce.
   1. Calcolare la massa richiesta di LAP (_mLAP) in base alla concentrazione finale di stock desiderata (_cLAP) e al volume richiesto (_VLAP) utilizzando l'equazione:
      _mLAP = _cLAP x _VLAP
      NOTA: si consiglia di preparare una soluzione madre al 3% (p/v).
   2. Pesare la quantità richiesta di LAP, aggiungerla in un tubo di reazione da 15 ml e aggiungere PBS.
   3. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per evitare la decomposizione fotoindotta.
   4. Sciogliere LAP ponendo il tubo di reazione a bagnomaria a 37 °C per 2 ore o fino a completa dissoluzione.
   5. Riempire 1 mL di soluzione madre LAP in tubi da 5 mL.
3. Alginato
   1. Calcola la quantità richiesta di alginato (_malginato) in base alla concentrazione finale desiderata (_calginato) e al volume (_Valginato) usando l'equazione:
      _malginato = _calginato x _valginato
      NOTA: Valginate dipende dalla configurazione sperimentale e si consiglia di preparare il 20-30% di materiale in eccesso. I protocolli presentati iniziano con 5 ml di alginato al 4% (p/v) come soluzione madre.
   2. Pesare la massa richiesta di alginato, aggiungerla in tubi di reazione da 50 ml e aggiungere PBS.
   3. Introdurre la miscela di alginato a bagnomaria a 37 °C per 4 ore.
      NOTA: l'uso di un miscelatore a vortice accelererà il processo di dissoluzione, ma genererà anche bolle d'aria. L'alginato disciolto può essere conservato a 4 °C per almeno sei mesi.
   4. Riempire 5 mL di alginato in 5 mL di tubi di reazione.
4. Riempire 5 mL di glicerolo in tubi di reazione da 5 mL.
5. Soluzione Orange G
   1. Preparare una soluzione madre da 10 mg/mL di Orange G in un tubo di reazione da 50 mL.
      NOTA: il volume dipende dal numero di esperimenti. A seconda del tipo di diluente, preparare la soluzione madre in acqua ultrapura, PBS o un reagente diluente adatto. Negli esperimenti presentati, l'acqua ultrapura è stata utilizzata per diluire il glicerolo e PBS per diluire GelMA e alginato. PBS è stato utilizzato come diluente per GelMA e alginato e può essere preparato utilizzando compresse o acquistato immediatamente.
   2. Mescolare per 10 s vorticoso.
   3. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per evitare la decomposizione fotoindotta.
      NOTA: La soluzione madre può essere utilizzata dopo 24 ore per garantire la corretta dissoluzione di Orange G.
   4. Diluire la soluzione madre in una soluzione di lavoro da 1 mg/mL in un tubo di reazione da 50 mL.
   5. Trasferire la soluzione di lavoro su palloni/tubi appropriati per la configurazione sperimentale.
      NOTA: Per gli esperimenti presentati, la soluzione di lavoro è stata riempita in tubi da 5 ml. Il brodo e la soluzione di lavoro Orange G possono essere conservati a 4 °C e utilizzati entro tre mesi dalla preparazione.
   6. Riempire 5 mL della soluzione di lavoro Orange G da 1 mg/mL in tubi di reazione da 5 mL.

4. Generare codice di protocollo con l'applicazione di progettazione del protocollo

NOTA: i parametri specificati nei passaggi 4.2-4.7 sono gli stessi per tutti gli esperimenti condotti, ad eccezione della concentrazione di stock del materiale e della concentrazione finale di output. Questi parametri sono riassunti nella Tabella 1 e, di seguito, i parametri vengono utilizzati per preparare idrogel a doppia rete con 5% (p/v) GelMA, 2% (p/v) alginato, 0,15% (p/v) LAP e PBS come diluente.

1. Aprire l'applicazione di progettazione del protocollo eseguendo 'ProtocolDesignApp.html'.
   NOTA: l'app "ProtocolDesignApp.html" guida l'utente attraverso il processo di selezione dei parametri e genera automaticamente il protocollo pronto all'uso per il funzionamento della workstation. L'interfaccia utente funziona su tutti i browser Internet comunemente usati (ad esempio Chrome, Firefox, Safari, edge, Internet Explorer).
2. Immettere il nome del protocollo (ad esempio, idrogel a doppia rete) nella pagina di configurazione.
3. Fai clic su "Continua" per confermare il nome del protocollo e procedere al passaggio successivo.
4. Definire il vassoio di alimentazione selezionando "Blocco riscaldante 3x4" dal menu a discesa e i seguenti parametri di ingresso:
   1. Seleziona 'Gel 1' dal menu a discesa, inserisci il nome 'GelMA', inserisci la concentrazione di stock '20%', imposta 'Numero di campioni' su '3' per riempire una colonna. Fai clic su "+aggiungi" per salvare le voci.
   2. Seleziona 'Gel 2' dal menu a discesa, inserisci il nome: 'Alginato', inserisci la concentrazione di stock '4%', imposta 'Numero di campioni' su '3' per riempire una colonna. Fai clic su "+aggiungi" per salvare le voci.
   3. Seleziona "Fotoiniziatore" dal menu a discesa, inserisci il nome: "LAP", inserisci la concentrazione di stock "3%", imposta "Numero di campioni" su "3" per riempire una colonna. Fai clic su "+aggiungi" per salvare le voci.
   4. Seleziona 'Diluente 1' dal menu a discesa, inserisci il nome: 'PBS', imposta 'Numero di campioni' su '3' per riempire una colonna. Fai clic su "+aggiungi" per salvare le voci.
      NOTA: la visualizzazione della barra di alimentazione si aggiorna automaticamente, una volta cliccato '+aggiungi'. Se vengono aggiunti più ingressi rispetto alla capacità del vassoio, all'utente verrà visualizzato l'avviso "Troppi campioni per questo vassoio".
5. Definisci i parametri di reticolazione selezionando "Foto reticolazione" e digitando il tempo in secondi, '30', e l'intensità W/^m2 con '2'.
6. Completare la configurazione dell'input facendo clic su "CONTINUA".
7. Definire la configurazione del vassoio di uscita selezionando "Piastra pozzo 96" nel menu a discesa per il tipo di piastra del pozzo.
8. Fare clic su 'Gruppo1' per definire gli output creando un gruppo di campioni.
   1. Specificare la composizione di output inserendo le concentrazioni desiderate e il volume del campione nei campi per ciascun input: GelMA = '5', Alginato = '2', LAP = '0,15', Volume totale = '60'.
   2. Casella di controllo per applicare il protocollo di miscelazione avanzato.
9. Specificare il numero di campioni inserendo il numero di campioni nel campo 'Numero di campioni': '96'.
   NOTA: la visualizzazione del vassoio dei campioni si aggiorna automaticamente, una volta cliccato '+aggiungi gruppo'. Se vengono aggiunti più campioni rispetto alla capacità del vassoio, all'utente verrà visualizzato l'avviso "Troppi campioni per questo vassoio".
10. Completare la configurazione dell'output facendo clic su "CONTINUA".
    1. Seleziona la posizione del vassoio sul layout del ponte e prepara la piattaforma di conseguenza:
    2. Seleziona il segno di spunta nel campo 'SLOT A1' e seleziona 'Empty_Cell' dal menu a discesa.
    3. Seleziona il segno di spunta nel campo 'SLOT A2' e seleziona 'Trash_Cell' dal menu a discesa.
    4. Seleziona il segno di spunta nel campo 'SLOT B1' e seleziona 'Tips_Cell_100 μL' dal menu a discesa.
    5. Seleziona il segno di spunta nel campo 'SLOT B2' e seleziona 'Tips_Cell_1000 μL' dal menu a discesa.
    6. Seleziona il segno di spunta nel campo "SLOT C1" e seleziona "Input_Cell" dal menu a discesa.
    7. Seleziona il segno di spunta nel campo 'SLOT C2' e seleziona 'Empty_Cell' dal menu a discesa.
    8. Seleziona il segno di spunta nel campo "SLOT D1" e seleziona "Mixing_Cell" dal menu a discesa.
    9. Seleziona il segno di spunta nel campo 'SLOT D2' e seleziona 'Output_Cell' dal menu a discesa.
    10. Definire il tipo e le caratteristiche della prima pipetta (M100E) selezionando 'Pipetta sinistra', selezionando '10-100μL di spostamento positivo' dal menu a discesa e impostando la velocità di aspirazione = '600', la velocità di erogazione = '800'.
    11. Definire il tipo e le caratteristiche della seconda pipetta (M1000E) selezionando 'Pipetta destra', selezionando '100-1000μL spostamento positivo' dal menu a discesa e impostando la velocità di aspirazione = '800', la velocità di erogazione = '1200'.
11. Fare clic su "GENERA PROTOCOLLO" per confermare l'installazione e generare lo script del protocollo.
    NOTA: l'app di progettazione del protocollo sviluppata genera automaticamente una nuova cartella ogni volta che viene generato un nuovo protocollo. Tutti i file necessari per questo esperimento e per il funzionamento della workstation vengono salvati in questa cartella che prende il nome dal nome del protocollo. La cartella può essere copiata in directory diverse senza causare problemi.
12. Non chiudere l'interfaccia, poiché verrà utilizzata per eseguire il protocollo (vedere il passaggio 6.6.).

5. Taratura del modulo di pipettaggio

NOTA: i contenitori (ad es. piastre di pozzo, portapunte, cestino) e le pipette (ad esempio, M1000E) devono essere calibrati inizialmente. Se una posizione del contenitore e/o di una pipetta vengono modificate/cambiate, la nuova posizione deve essere calibrata.

1. Passare alla cartella del protocollo e aprire il terminale di calibrazione eseguendo il file 'calibrate.py' in un windox terminale (vedere il passaggio 1.1.1):
   phython.calibrate.py
   NOTA: L'interfaccia 'calibrate.py' guida l'utente attraverso la calibrazione della configurazione del ponte e delle pipette. Assicurarsi che il file si trovi nella stessa cartella del file di protocollo e dei file del modulo. Viene generato automaticamente nel passaggio 4.10.
2. Selezionare gli incrementi di movimento per il movimento plungerx,y,z con il tastierino numerico (1−8): '1' per 0,1 mm, '2' per 0,5 mm, '3' per 1 mm, '4' per 5 mm, '5' per 10, '6' per 20 mm, '7' per 40 mm e '8' per 80 mm.
3. Calibrare la pipetta.
   1. Premere la scorciatoia da tastiera P per selezionare le dimensioni della pipetta.
   2. Premere la scorciatoia da tastiera V per accedere alla modalità di calibrazione dello stantuffo.
      NOTA: si consiglia di iniziare con piccoli incrementi (2, 5 e 10 mm) per acquisire familiarità con le dimensioni dell'incremento e l'azione di movimento della testa della pipetta.
   3. Calibrare le seguenti posizioni dello stantuffo per una pipetta a spostamento positivo: T–Top = posizione di riposo; B–Bottom = lo stantuffo viene spinto fino a quando non viene raggiunta la resistenza; P–Pick-up = lo stantuffo viene spinto in una posizione in cui è possibile fissare una punta del pistone; E–Eject = lo stantuffo viene spinto fino a quando non viene espulsa una punta attaccata. Variare le posizioni dello stantuffo utilizzando le frecce verso l'alto e verso il basso sulla tastiera e salvare la posizione finale utilizzando S sulla tastiera.
   4. Lasciare la modalità di calibrazione dello stantuffo della pipetta premendo la scorciatoia da tastiera V.
4. Calibrare la posizione del contenitore rispetto alla punta della pipetta.
   1. Premere la scorciatoia da tastiera P per selezionare il tipo di pipetta. Assicurarsi che una punta sia collegata al pipetting selezionato.
   2. Premere la scorciatoia da tastiera C per selezionare il tipo di contenitore.
   3. Selezionate un incremento di movimento appropriato e spostate la punta della pipetta nelle seguenti posizioni. Per le piastre dei pozzi, calibrare la posizione del pozzetto 'A1' nella parte inferiore; Per il rack di punta, calibrare in posizione 'A1'; Per il cestino, scegli una posizione (definita come un punto) in cui la punta può essere espulsa nel cestino.
   4. Premere la scorciatoia da tastiera S per salvare la posizione.
   5. Ripetere i passaggi 5.3.1−5.3.3 per tutti i contenitori elencati sotto 'C' per il tipo di pipetta selezionato.
   6. Ripetere 5.3.1−5.3.5 per il secondo tipo di pipetta.
   7. Chiudere lo script di calibrazione.

6. Esecuzione del protocollo con la workstation

NOTA: i file di protocollo sono accessibili tramite il repository e sono disponibili anche come file supplementari.

1. Posizionare il contenitore della spazzatura, i rack di punta, il vassoio di alimentazione, il vassoio di miscelazione e l'uscita sul ponte (definiti nel passaggio 4.3).
2. Calibrare pipette e strumenti come definiti al punto 5.
3. Se necessario, accendere il dock di temperatura e selezionare la temperatura per il vassoio di ingresso e miscelazione.
   NOTA: Gli esperimenti in questo tutorial sono stati condotti senza controllo della temperatura e a 40 °C per il glicerolo e a 37 °C per il pipettaggio di GelMA e alginato.
4. Posizionare i tubi con reagenti in ingresso nei blocchi di alluminio sui dock di temperatura in base alla configurazione selezionata.
5. Attendere che i reagenti in ingresso abbiano raggiunto la temperatura desiderata.
   NOTA: Per garantire una corretta distribuzione della temperatura, si raccomanda un tempo di incubazione di 30 minuti per GelMA e alginato.
6. Esegui il file di protocollo facendo clic su "ESEGUI SCRIPT PYTHON"
   NOTA: il protocollo selezionato viene ora eseguito dalla workstation. Il video di accompagnamento evidenzia la miscelazione automatizzata di GelMA e la distribuzione di 60 μL in una piastra a 96 pozzetti.
7. L'esecuzione è completata, quando viene visualizzato "Finito".

7. Processo di convalida e verifica

1. Rimuovere la piastra del pozzo dalla postazione di lavoro e trasportare la piastra del pozzo con i campioni su uno spettrofotometro.
2. Lettura dell'assorbanza con uno spettrofotometro a 450 nm. Leggere ogni piastra 2 volte per confrontare i risultati e garantire risultati coerenti.
3. Esporta e salva le letture di assorbanza.
4. Analisi dei dati.
   NOTA: i dati sperimentali possono essere elaborati singolarmente o copiati e incollati nel modello fornito per valutare il valore medio, la deviazione standard e il valore del coefficiente di varianza (CV) utilizzando un software per fogli di calcolo.
   1. Apri il file supplementare "supplementary_template-analysis.xlsx", che è anche disponibile all'interno del repository GitHub sotto "openworkstation/examples/publication-JoVE.
   2. Copia le letture di assorbanza nel foglio "dati grezzi", assicurati che tutti i riferimenti alle celle siano definiti correttamente in tutte le tabelle e fai clic sul foglio "analisi" per informazioni sui valori medi, deviazione standard e coefficiente di varianza (CV).
      NOTA: a seconda della distribuzione del campione su una piastra di pozzo, con il modello sono disponibili i seguenti tipi di valutazione preimpostati: il tipo "Uniforme" viene utilizzato quando tutti i campioni hanno la stessa composizione, il tipo "Per righe" viene utilizzato quando campioni in righe diverse hanno composizioni diverse, il tipo "Per colonne" viene utilizzato quando campioni in colonne diverse hanno composizioni diverse, e il tipo "Personalizzato" viene utilizzato quando le posizioni del campione sono specifiche dell'utente.

Risultati

Questo tutorial presenta i risultati per esperimenti con glicerolo (Figura 3) e GelMA con LAP e alginato (Figura 4).

La generazione di una soluzione di glicerolo all'80% (v/v) è stata studiata senza controllo della temperatura (temperatura ambiente, 22 °C) e senza tip touch (definita come setup 1), con controllo della temperatura (40 °C) e senza tip touch (setup 2), o con controllo della temperatura (40 °C) e con tip touch (setup 3) (Figura 3a-i). Queste due impostazioni di temperatura sono state scelte per valutare la differenza di manipolazione, poiché la viscosità del glicerolo diminuisce quasi di un fattore 3 se riscaldata da 22 °C (139,5 mPa·s) a 40 °C (46,6 mPa·s)³⁰. Una soluzione madre all'85% (v/v) di glicerolo è stata diluita ad una concentrazione finale dell'80% e distribuita uniformemente in una piastra da 96 pozzetti (n = 96 per configurazione). Il tempo sperimentale, che include l'erogazione di ciascun materiale nel tubo della miscela, le rispettive attività di miscelazione e la distribuzione del campione in una piastra a 96 pozzetti, è stato di 30 minuti e 42 secondi. Per identificare le differenze tra le miscele di diluizione, l'acqua ultrapura, come diluente per il glicerolo, è stata preparata con 1 mg / mL di arancia G. Le letture di assorbanza evidenziano che l'integrazione del controllo della temperatura e del tocco della punta influisce in modo significativo sulle miscele (p < 0,0001). Oltre all'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) eseguita, sono stati calcolati i valori CV per valutare la deviazione standard relativa. Il coefficiente di variazione descrive un indicatore standardizzato per identificare il grado di deviazione in relazione alla media ed è espresso in percentuale. Se i mezzi del campione non sono particolarmente il punto di interesse, ma la variabilità all'interno delle misurazioni, il coefficiente di variazione fornisce ulteriori informazioni per identificare le miscele ^{riproducibili46}. All'interno di questo esperimento con tre diverse configurazioni, i valori di assorbanza hanno mostrato valori CV decrescenti dal 5,6%, 4,2%, al 2,0% per setup 1, setup 2 e setup 3, rispettivamente, dimostrando l'influenza significativa del dock di temperatura e della funzione tip touch sulla produzione di risultati affidabili (Figura 3a-ii). Il grafico dei valori di assorbanza del campione per l'impostazione 3 (numero di campione da #1 a #96 in una piastra di pozzo 96) non produce valori crescenti o decrescenti durante l'esperimento e, pertanto, non indica alcuna influenza della posizione del campione sui valori di assorbanza (Figura 3a-iii). La visualizzazione dei dati per ogni piastra di pozzo misurata con mappe di calore fornisce ulteriori informazioni per identificare le eterogeneità per una riga o una colonna specifica o valori di assorbanza variabili durante le attività di erogazione. Le mappe di calore visualizzate per la visualizzazione delle tre configurazioni hanno ridotto le eterogeneità tra le piastre dell'intero pozzo dall'impostazione 1 alla configurazione 3 (Figura 3b). Infine, la replicabilità del mixaggio condotto è stata valutata all'interno di otto cicli indipendenti (Figura 3c-i,ii), dove ogni corsa ha richiesto 6 min 57 s. Le singole corse di miscelazione hanno mostrato bassi valori di CV tra l'1,1% e il 2,6%, che indicano attività di miscelazione ed erogazione molto affidabili per le singole corse. I valori di assorbanza di tutte e otto le tirature hanno prodotto un valore CV del 3,3% e hanno dimostrato la riproducibilità del protocollo di miscelazione stabilito.

Le serie di diluizione GelMA sono state preparate diluendo una soluzione madre al 20% (p/v) con PBS a 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 e 0% (p/v) e aggiungendo LAP a una concentrazione costante dello 0,15% (p/v) (Figura 4a-i), che ha richiesto in totale 55 min 12 s. Come specificato nello script del protocollo sperimentale, l'idrogel era reticolazione per 30 s con un'intensità di 2,0 mW/^cm2 a 400 nm. Per valutare le differenze tra le miscele, PBS, come diluente per GelMA e alginato, è stato preparato con 1 mg / mL di Arancia G. Quindi, la differenza di assorbanza tra i campioni all'interno di una miscela e tra le diluizioni seriali è identificata con uno spettrofotometro. I valori di assorbanza misurati di ciascuna fase di concentrazione sono significativamente diversi (p < 0,0001) e hanno valori CV molto bassi tra l'1,2% e il 3,4% durante le fasi di concentrazione (n = 12 per fase di concentrazione). La regressione lineare ha dimostrato un adattamento elevato con un valore R² di 0,9869 (Figura 4a-ii) e una mappa di calore ha confermato la distribuzione omogenea per ciascuna concentrazione e la differenza tra le concentrazioni (Figura 4a-iii). La miscelazione automatizzata di quattro reagenti è stata condotta per la generazione del 5% (p/v) di GelMA, del 2% (p/v) di alginato, dello 0,15% (p/v) di LAP e pbS come diluente senza (setup 2) e con (setup 3) touch tip (n = 96 per ogni setup) con gli stessi parametri di reticolazione (30 s, 2,0 mW/^cm2, 400 nm). L'erogazione dei quattro materiali, la miscelazione e la distribuzione in una piastra da 96 pozzetti hanno richiesto 32 minuti e 22 s. Tutti gli esperimenti con GelMA e alginato sono stati condotti a 37 °C per prevenire la gelificazione termica che impedisce il pipettaggio di GelMA. Con l'opzione tip touch, il valore CV è stato ridotto dal 5,2% al 3,4% e, soprattutto, i valori anomali nella regione inferiore sono stati evitati rimuovendo il materiale in eccesso dalla punta (Figura 4b-i). Sebbene il valore medio di 1,927 e 1,944 per il setup 2 e il setup 3 siano molto vicini, il coefficiente di variazione evidenzia la deviazione decrescente rispetto alla media. Le singole righe della piastra a 96 pozzetti possono essere confrontate tra loro utilizzando una visualizzazione heatmap per rilevare le differenze di riga e/o colonna (Figura 4b-ii).

Figura 1: Flusso di lavoro del protocollo con singole attività. Il flusso di lavoro descritto è suddiviso in sette attività, separate in configurazione, preparazione, esecuzione e analisi. All'inizio, è necessario configurare il software (attività 1) e l'hardware (attività 2). Dopo la preparazione dei materiali (task 3) e la generazione dello script di protocollo (task 4), il modulo di pipettaggio viene calibrato definendo le posizioni della pipetta e del contenitore (task 5). Successivamente, lo script del protocollo viene eseguito sulla workstation (attività 6) e la convalida e la verifica (attività 7) delle miscele vengono eseguite per valutare le miscele. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione della workstation open source e del deck del modulo di pipettaggio. (a) La workstation sviluppata si ispira a un approccio a catena di montaggio, in cui i campioni vengono trasportati attraverso diversi moduli, ed è composta dai seguenti moduli: pipettaggio, reticolante, stoccaggio, trasporto e modulo computazionale. b) Il piano del modulo di pipettaggio è impostato in base al layout sperimentale (ad esempio, tipo di piastra del pozzo, volume del tubo, ecc.). La configurazione del ponte visualizzato è stata utilizzata per gli esperimenti presentati e consiste in pipette a spostamento positivo con un intervallo da 10-100 μL (M100E) e 100-1.000 μL (M1000E), i rack di punta con pistoni capillari (CP) per 100 μL (CP1000) e 1.000 μL (CP1000), un contenitore della spazzatura, un vassoio di miscelazione e un vassoio di alimentazione per i reagenti in ingresso. c) Le posizioni di coperta disponibili sono definite con i numeri visualizzati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati per il pipettaggio automatizzato di miscele di glicerolo. a) La progettazione flessibile della postazione di lavoro consente la valutazione di tre diverse configurazioni (i) per identificare i parametri ottimali per risultati riproducibili. (ii) L'aggiunta di un tocco di punta e il riscaldamento del materiale hanno comportato una diminuzione dei valori del coefficiente di varianza (CV) e miscele altamente riproducibili per l'impostazione 3. Ogni esperimento è stato condotto con 96 campioni. iii) Il tracciato dei valori di un singolo campione non ha mostrato alcuna influenza sulla sequenza di pipettaggio. (b) I risultati sperimentali di ciascuna configurazione sono stati visualizzati con mappe di calore per identificare l'influenza sulle differenze grezze / colonna, sui bordi o sulla miscela principale. (c) La riproducibilità della configurazione 3 è stata analizzata all'interno di otto cicli indipendenti utilizzando (i) mediana, deviazione standard, valore CV e (ii) mappe di calore. I dati nei pannelli a-ii (n = 96) e b-i (n = 12) sono presentati con i mezzi e i singoli punti dati. La significatività statistica è stata definita come ****p < 0,0001 utilizzando l'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati per le attività di miscelazione con idrogel. (a) Da una soluzione madre di metacriloil (GelMA) gelatina al 20% (p/v), è stata generata una diluizione seriale di 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 e 0% (p/v) all'interno di una serie sperimentale utilizzando una piastra da 96 pozzetti (n = 12 per concentrazione). (i) I valori del coefficiente di varianza (CV) variavano tra l'1,2% e il 3,4% durante le concentrazioni preparate, e (ii) la regressione lineare mostrava un adattamento elevato con un valore R² di 0,9869. (iii) Le diluizioni omogenee sono state confermate visivamente con la mappa di calore generata. (b) Gli idrogel a doppia rete sono stati generati con il 5% (p/v) di GelMA, il 2% (p/v) di alginato e lo 0,15% (p/v) di LAP (i) con e senza tip touch (n = 96 per ogni configurazione) e reticolati per 30 s con un'intensità di 2,0 mW/^cm2 a 400 nm. L'integrazione del tip touch ha portato a una diminuzione dei valori CV dal 5,2% al 3,4%. (ii,iii) Le mappe di calore confermano un minor numero di deviazioni quando si utilizza il tocco della punta per rimuovere il materiale in eccesso dalla punta. I dati nei pannelli a-i e b-i sono presentati con i mezzi e i singoli punti dati. La significatività statistica è stata definita come *p < 0,05, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001 utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Riepilogo della differenza di tipo di pipetta e dei problemi con i biomateriali viscosi. a) Il reagente e il pistone sono separati da un cuscino d'aria che si restringe durante le fasi di erogazione e si espande durante le fasi di aspirazione. Durante l'aspirazione e l'erogazione di materiali viscosi, il lento "flusso" introduce problemi come bolle d'aria e comportamento irregolare di pipettaggio. b) Le pipette a spostamento positivo consentono l'aspirazione e l'erogazione affidabili di materiale viscoso mediante l'uso di un pistone all'interno della punta. c) Il pipettaggio di materiali altamente viscosi (ad esempio, il 4% (p/v) di alginato) può comportare l'accumulo di materiale in eccesso sulla punta, il che porta a imprecisioni durante gli esperimenti. d) L'implementazione di un semplice vassoio touch per la punta consente la rimozione del materiale in eccesso sulla punta e si traduce in volumi di aspirazione ed erogazione accurati. Ciò si ottiene utilizzando il lato interno del coperchio della piastra del pozzo posto su un contenitore a cremagliera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materiale #1 (concentrazione di stock)	Concentrazione finale del materiale #1	Materiale #2 (concentrazione di stock)	Concentrazione finale del materiale #2	Materiali #3 (concentrazione di magazzino)	Concentrazione finale del materiale #3	Diluente (soluzione di lavoro Orange G)	Concentrazione finale di Orange G nella miscela	Visualizzato in figura
Glicerolo (85% (p/v))	80% (p/v)					acqua (1 mg/mL Arancia G)	0,059 mg/mL	Figura 3a−c
GelMA (20% (p/v))	0% (p/v)	LAP (3% (p/v))	0,15% (p/v)			PBS (1 mg/mL Arancia G)	1 mg/ml	Figura 4a
GelMA (20% (p/v))	2% (p/v)	LAP (3% (p/v))	0,15% (p/v)			PBS (1 mg/mL Arancia G)	0,85 mg/mL	Figura 4a
GelMA (20% (p/v))	4% (p/v)	LAP (3% (p/v))	0,15% (p/v)			PBS (1 mg/mL Arancia G)	0,75 mg/ml	Figura 4a
GelMA (20% (p/v))	6% (p/v)	LAP (3% (p/v))	0,15% (p/v)			PBS (1 mg/mL Arancia G)	0,65 mg/ml	Figura 4a
GelMA (20% (p/v))	8% (p/v)	LAP (3% (p/v))	0,15% (p/v)			PBS (1 mg/mL Arancia G)	0,55 mg/ml	Figura 4a
GelMA (20% (p/v))	10% (p/v)	LAP (3% (p/v))	0,15% (p/v)			PBS (1 mg/mL Arancia G)	0,45 mg/mL	Figura 4a
GelMA (20% (p/v))	12% (p/v)	LAP (3% (p/v))	0,15% (p/v)			PBS (1 mg/mL Arancia G)	0,35 mg/ml	Figura 4a
GelMA (20% (p/v))	14% (p/v)	LAP (3% (p/v))	0,15% (p/v)			PBS (1 mg/mL Arancia G)	0,25 mg/ml	Figura 4a
GelMA (20% (p/v))	5% (p/v)	Alginato (4% (p/v))	2% (p/v)	LAP (3% (p/v))	0,15% (p/v)	PBS (1 mg/mL Arancia G)	0,2 mg/ml	Figura 4b

Tabella 1: Panoramica dei parametri per gli esperimenti condotti.

Passaggio del protocollo	Problema	Possibile motivo	Soluzione
1.1	Impossibile installare o aggiornare il software	Esaurimento dello spazio su disco sulla scheda SD	Controlla lo spazio su disco sulla scheda SD. Se necessario, rimuovere gli elementi non necessari, svuotare il cestino o utilizzare una scheda SD di dimensioni appropriate
1.2	Impossibile installare l'API	La capacità degli utenti per l'installazione è limitata (nessuna autorizzazione utente root)	Usa il comando 'sudo' davanti ai comandi specificati per ottenere i diritti di amministratore. In Linux, questo tipo di accesso è noto come superutente.
3.1	Problemi con GelMA	Funzionalizzazione, dialisi o liofilizzazione	Protocollo dettagliato passo-passo, incluso l'elenco di risoluzione problemi disponibile in Loessner et al.33.
5.1 e 6.2	La workstation non reagisce ai comandi	Problemi di connessione	Gira tutto e spegni il computer. Spegnere l'alimentatore per 10 s. Riaccendi il computer e la workstation.
5.1 e 6.2	La workstation non reagisce ai comandi	Problemi di connessione	Verificare se il computer riconosce la connessione USB e se la porta USB è definita correttamente. Assicurarsi che il firewall non impedisca il processo di connessione (vedere il collegamento sotto la Tabella 2).
5.1 e 6.2	Impossibile aprire il file	Directory errata	Controllare director (percorso della cartella) per assicurarsi che venga utilizzato il percorso corretto. Se non è possibile trovare un file (ad esempio, interface.py), è probabile che venga utilizzato il percorso errato.
6.6.2	La punta non è attaccata correttamente o cade durante il movimento	Problema di calibrazione	Ripetere le fasi di calibrazione per la pipetta e assicurarsi che il pistone capillare sia collegato correttamente con la pipetta.
6.6.2	La punta non è attaccata correttamente o cade durante il movimento	Problema di allegato	La pipetta non è collegata correttamente all'asse della pipetta e si muove durante le fasi di movimento. Stringere saldamente le viti per evitare questo.
6.6.2	La punta sta aspirando sopra il materiale	Problema di calibrazione	Ripetere la calibrazione di questo tipo di vassoio per definire correttamente l'altezza.
6.6.2	La punta sta aspirando sopra il materiale	Problema di calibrazione	Controllare il volume nel tubo e assicurarsi che il volume sia uguale al volume definito nell'applicazione di progettazione del protocollo.
6.6.2	Il materiale si immerge durante il movimento	Troppo materiale in eccesso sulla punta	Aggiungi l'opzione touch dock della punta; opzionalmente, anche il tempo per il tocco della punta può essere aumentato.
6.6.2	Il materiale è solido o troppo viscoso per il pipettaggio	Comportamento termoresponsivo del materiale	Controllare la caratterizzazione del materiale termoresponsivo e regolare di conseguenza la temperatura di riscaldamento/raffreddamento del dock di temperatura.
https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting

Tabella 2: Tabella dei problemi con problemi identificati, possibili motivi e soluzioni per risolvere i problemi.

File supplementare. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Il pipettaggio di materiali viscosi, in particolare idrogel per applicazioni biomediche19,20,21,33,47, sono compiti di routine in molti laboratori di ricerca per preparare una concentrazione definita dall'utente o una serie di diluizione con concentrazioni variabili. Sebbene sia ripetitivo e l'esecuzione sia piuttosto semplice, viene eseguita principalmente manualmente con un throughput di campionamento ^basso18. Questo tutorial introduce il funzionamento di una workstation open source, che è stata specificamente progettata per materiali viscosi, per consentire la miscelazione automatizzata di materiali viscosi per la generazione riproducibile delle concentrazioni desiderate. Questa workstation è ottimizzata per il pipettaggio di idrogel per consentire una gestione automatizzata e altamente affidabile mediante l'integrazione di banchine di temperatura per materiali termoresponsivi, pipette a spostamento positivo per materiali viscosi e un dock touch a punta opzionale per rimuovere il materiale in eccesso dalla punta. Il modulo di pipettaggio è stato specificamente ottimizzato per consentire la lavorazione di materiale viscoso in modo standardizzato e automatizzato. Rispetto alle pipette a cuscino d'aria (Figura 5a), le pipette a spostamento positivo (Figura 5b) erogano materiali viscosi senza lasciare materiale residuo lasciato nella punta, con conseguente aspirazione e dosaggio accurati. Il touch dock opzionale rimuove il materiale campione in eccesso dalla punta (Figura 5c,d), utile per i materiali incollati (ad esempio, il 4% (p/v) di alginato).

L'applicazione del progettista del protocollo è stata specificamente programmata per gli idrogel e consente la diluizione di un massimo di quattro reagenti con diverse concentrazioni e fino a due diluenti. Il rischio di errori nel calcolo delle diluizioni finali è evitato in questa applicazione, poiché gli utenti scelgono solo la concentrazione desiderata o le fasi di diluizione seriale. I volumi di aspirazione ed erogazione richiesti vengono calcolati automaticamente, salvati in un file di testo di documentazione separato e quindi inseriti nello script di protocollo. Questa applicazione di progettazione del protocollo offre all'utente il pieno controllo di tutti i parametri sperimentali (ad esempio, velocità di pipettaggio) e garantisce la documentazione interna dei parametri importanti. L'app di progettazione del protocollo tiene conto del livello di riempimento del serbatoio (ad esempio, pozzo) e varia l'altezza di aspirazione / erogazione per evitare inutili immersioni nei materiali viscosi. Questa funzione integrata evita l'accumulo di materiale sulla parete esterna della punta e, quindi, garantisce attività di aspirazione ed erogazione affidabili in tutto il protocollo. Sebbene l'applicazione di progettazione del protocollo sia stata sviluppata per le fasi di diluizione dell'idrogel, può essere utilizzata anche per la diluizione di liquidi non viscosi, come i coloranti Orange G. L'applicazione di progettazione del protocollo, accessibile tramite il repository sotto '/examples/publication-JoVE', è la versione spiegata nella sezione protocollo ed evidenziata nel video. Questa versione non verrà aggiornata. Tuttavia, una versione aggiornata dell'applicazione di progettazione del protocollo è disponibile tramite la pagina principale del repository. Il terminale di calibrazione è stato inizialmente sviluppato da ^Sanderson48 ed è stato ottimizzato per la calibrazione di pipette a spostamento positivo.

Come descritto nella sezione 4 del protocollo, le pipette e i contenitori devono essere calibrati inizialmente. Questo processo di calibrazione è fondamentale per definire e salvare le posizioni che vengono poi utilizzate per calcolare gli incrementi di movimento. Pertanto, l'esecuzione corretta del protocollo si basa su posizioni di calibrazione ben definite, poiché punti di calibrazione errati potrebbero causare l'arresto anomalo della punta in un contenitore. Poiché le posizioni dello stantuffo delle pipette devono essere calibrate manualmente, l'accuratezza e la precisione del pipettaggio dipendono in gran parte dalla calibrazione eseguita. Queste procedure di calibrazione dipendono fortemente dall'esperienza dell'utente con il modulo di pipettaggio e, pertanto, si consiglia all'inizio la formazione con personale esperto per garantire procedure di calibrazione adeguate. Oltre alla calibrazione manuale sul modulo di pipettaggio, la pipetta stessa deve essere calibrata per garantire un pipettaggio accurato. Si raccomanda di calibrare le pipette almeno ogni 12 mesi per soddisfare i criteri di accettazione specificati nella norma ISO 8655. Per valutare internamente la calibrazione della pipetta, sono disponibili la convalida e la verifica come descritto da Stangegaard et ^al.16.

Per la generazione di un set di dati affidabile, è fondamentale iniziare con reagenti di alta qualità. Ciò è particolarmente importante per le attività di elaborazione dell'idrogel, poiché le variazioni da lotto a lotto potrebbero influire sui risultati generati all'interno di questo protocollo. Oltre alle variazioni da lotto a lotto, anche sottili cambiamenti nella preparazione di piccoli volumi possono contribuire a differenze di proprietà. Per evitare ciò, si consiglia la preparazione di volumi maggiori, che possono essere utilizzati per l'intero esperimento.

Le procedure di convalida e verifica si basano sull'uso di un colorante per identificare miscele affidabili. Il protocollo presentato descrive l'applicazione di Orange G, ma il protocollo generale e il flusso di lavoro di analisi possono anche essere adattati ai coloranti ^{fluorescenti49,50}. L'uso di Orange G riduce i requisiti tecnici dello spettrofotometro ed elimina le precauzioni prese per prevenire lo sbiancamento dei coloranti fluorescenti dopo l'esposizione alla luce. Problemi nel comportamento di dissoluzione o nella formazione di cluster del colorante non sono stati osservati con i materiali presentati durante gli esperimenti, ma potrebbero apparire con altri materiali. La potenziale formazione di cluster e, quindi, l'interazione tra colorante e materiale potrebbero essere facilmente rilevati con un microscopio.

Le procedure e le tecniche presentate in questo tutorial aggiungono funzionalità di automazione ai flussi di lavoro correnti per materiali viscosi per ottenere attività altamente affidabili con il minimo lavoro umano. La tabella di risoluzione dei problemi fornita (Tabella 2) include i problemi identificati e presenta possibili motivi e soluzioni per risolverli. La postazione di lavoro presentata è stata applicata con successo a materiali polimerici naturali (gelatina, gomma di gellano, matrigel) e sintetici (ad esempio, poli(glicole etilenico) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) per attività di pipettaggio automatizzate. In particolare, la combinazione di una workstation open source e di un'applicazione di progettazione di protocolli open source progettata per materiali viscosi sarà molto utile per i ricercatori che lavorano nei campi dell'ingegneria biomedica, della scienza dei materiali e della microbiologia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
15 provette di reazione	Fisher Scientific, Inc. (USA)	14-959-53A
Provette da 5 mL	Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)	Le dimensioni di SCT-5ML	dipendono dal protocollo sperimentale; possono essere utilizzate anche provette Eppies (0,5, 1, 1,5 mL) o Falcon (15, 50mL); il prodotto è fabbricato da Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name
provette di reazione da 50 mL	Fisher Scientific, Inc. (USA)	14-432-22
70% p/p Ethanol	LabChem, Inc. (USA)	aja726-5Lpl
piastra a 96 pozzetti	Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)		https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055
Alginato	NovaMatrix	4200001	acqua
			demineralizzata o ultrapura (MilliQ)
Gelatina metacriloil (GelMA)	sintetizzato internamente		(inclusi materiali e riferimenti) è disponibile in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037
Litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)	Sigma-Aldrich, Inc. (USA)	900889
Chiave a brugola M4 e M5	OpenBuilds, inc. (USA)	179, 190	disponibile anche in tutti i negozi di ferramenta. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/
OrangeG	Fisher Scientific (USA)	O267-25	https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)	14190-144	alternativamente: Compresse PBS: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)
Equipment
Blocchi in alluminio per dock di temperatura	Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)	SB16	per provette di diverse dimensioni. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html
Bilancia analitica	Sartorius AG (Germania)	ED224S
liquidi: prodotto commerciale	Opentrons Laboratories, Inc. (USA)	OT-One S Pro	https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro
Robot open source per la manipolazione dei liquidi: aperto			file hardware e software sono liberamente accessibili su GitHub e Zenodo (link forniti); vengono fornite le istruzioni per la costruzione. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24
Pipetta a spostamento positivo: MicromanE	Gilson, Inc. (USA	)FD10006	dipende dalle dimensioni richieste. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html
Spettrofotometro	BMG LABTECH GmbH (Germania)	CLARIOstar
Punte: pistoni capillari	Gilson, Inc. (USA)	F148180	dipende dalle dimensioni richieste. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191