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Articolo metodologico

Un protocollo migliorato per purificare e direttamente mono-biotinyare recombinante BDNF in un tubo per gli studi sul traffico cellulare nei neuroni

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DOI:

10.3791/61262

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11 luglio 2020

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1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

In questo articolo

Sommario

Il BDNF ricombinante contenente una sequenza Avi (BDNFAvi) viene prodotto nelle cellule HEK293 in modo conveniente ed è purificato dalla cromatografia di affinità. BDNFavi viene quindi direttamente mono-biotinylated con l'enzima BirA in un tubo. BDNFavi e BDNFavi monobionlate mantengono la loro attività biologica rispetto al BDNF disponibile in commercio.

Abstract

Il BDNF ricombinante contenente una sequenza Avi (BDNFAvi) viene prodotto nelle cellule HEK293 e quindi purificato in modo conveniente dalla cromatografia di affinità. È stato sviluppato un protocollo riproducibile per mono-biotinylate BDNFAvi direttamente monobiolare con l'enzima BirA in un tubo. In questa reazione, BDNFAvi monobiolato mantiene la sua attività biologica.

Le neurotrofie sono fattori di crescita derivati dagli obiettivi che svolgono un ruolo nello sviluppo e nella manutenzione neuronali. Essi richiedono meccanismi di trasporto rapido lungo il percorso endocitico per consentire la segnalazione a lunga distanza tra diversi compartimenti neuronali. Lo sviluppo di strumenti molecolari per studiare il traffico di neurotrofinelle ha permesso il monitoraggio preciso di queste proteine nella cellula utilizzando la registrazione in vivo. In questo protocollo, abbiamo sviluppato una procedura ottimizzata ed economica per la produzione di BDNF monobionlate. Una variante BDNF ricombinante contenente una sequenza avi biotinyilable (BDNFAvi) viene prodotta in cellule HEK293 nell'intervallo di microgrammi e quindi purificata in una procedura facilmente scalabile utilizzando la cromatografia di affinità. Il BDNF purificato può quindi essere omogeneamente mono-biotinylated da una reazione diretta in vitro con l'enzima BirA in un tubo. L'attività biologica del BDNF monobiolato (mbtBDNF) può essere coniugata a streptavidin-conjugated a diversi fluorofori. BDNFAvi e mbtBDNF mantengono la loro attività biologica dimostrata attraverso il rilevamento di bersagli fosforillati a valle utilizzando macchie occidentali e l'attivazione del fattore di trascrizione CREB, rispettivamente. Utilizzando i punti streptavidin-quantum, siamo stati in grado di visualizzare l'internalizzazione mbtBDNF concomitante con l'attivazione del CREB, che è stato rilevato con un anticorpo specifico fosforo-CREB. Inoltre, mbtBDNF coniugato ai punti streptavidin-quantum era adatto per l'analisi del trasporto retrogrado nei neuroni corticali coltivati in camere microfluidiche. Così, in tubo prodotto mbtBDNF è uno strumento affidabile per studiare la dinamica endosomica di segnalazione fisiologica e il traffico di neuroni.

Introduzione

I neuroni sono le unità funzionali del sistema nervoso in possesso di una morfologia complessa e specializzata che consente la comunicazione sinaptica, e quindi la generazione di un comportamento coordinato e complesso in risposta a diversi stimoli. Proiezioni neuronali come dendriti e assoni sono caratteristiche strutturali critiche coinvolte nella comunicazione neuronale, e le neurotrofie sono fattori cruciali per determinare la loro morfologia e funzione1. Le neurotrofie sono una famiglia di fattori di crescita secreti che includono NGF, NT-3, NT-4 e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)2. Nel sistema nervoso centrale (CNS), BDNF partecipa a diversi processi biologici tra cui neurotrasmissione, arborizzazione dendritica, maturazione delle spine dendritiche, potenziamento a lungo termine, tra gli altri3,4. Pertanto, BDNF svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione neuronale.

Diversi processi cellulari regolano le dinamiche e le funzioni del BDNF. Sulla superficie neuronale, BDNF lega il recettore tropomiosina chinasi B (TrkB) e/o il recettore neurotrofiina p75 (p75). I complessi BDNF-TrkB e BDNF-p75 sono endocitosi e ordinati in diversi organelli endocitici5,6,77,8. Il corretto traffico intracellulare del complesso BDNF/TrkB è necessario per una corretta segnalazione BDNF in circuiti neuronali diversi9,10,11. Per questo motivo, una profonda comprensione delle dinamiche del traffico BDNF e delle sue alterazioni nei processi patofisiologici è essenziale per comprendere la segnalazione BDNF in salute e malattia. Lo sviluppo di nuovi e specifici strumenti molecolari per monitorare questo processo contribuirà a portare avanti questo campo e permetterà una migliore comprensione dei meccanismi normativi coinvolti.

Ci sono diversi strumenti disponibili per lo studio del traffico di BDNF nei neuroni. Una metodologia comunemente usata prevede la trasfezione di BDNF ricombinante etichettato con molecole fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP) o la variante fluorescente fluorescente monomerica di GFP mCherry12,13. Tuttavia, una grave carenza di sovraespressione BDNF è che elimina la possibilità di fornire concentrazioni note di questa neurotrofia. Inoltre, può provocare tossicità cellulare, oscurando l'interpretazione dei risultati14. Una strategia alternativa è la trasfezione di un TrkB con etichetta epitope, come Flag-TrkB. Questa metodologia consente lo studio delle dinamiche di internalizzazione TrkB15, ma comporta anche la trasfezione, che potrebbe provocare alterata funzione TrkB e tossicità cellulare. Per superare questi ostacoli metodologici, sono state sviluppate varianti ricombinanti di NGF e BDNF contenenti una sequenza Avi (BDNFAvi), che può essere monobiota dall'enzima biotina-ligase BirA, sono state sviluppate16,17. Il BDNF ricombinante biotinylato può essere accoppiato a diversi strumenti legati alla streptavidina, che includono fluorofori, perline, nanoparticelle paramagnetiche tra gli altri per il rilevamento. In termini di imaging a cellule vive, i punti quantici (QD) sono diventati fluorofori usati di frequente, in quanto hanno caratteristiche desiderabili per il tracciamento di singole particelle, come una maggiore luminosità e resistenza al fotobleaching rispetto ai piccoli fluorofori molecolari18.

La produzione di BDNF monobiotinylata (mbtBDNF) utilizzando BDNFAvi è stata ottenuta mediante co-trasfezione di plasmidi guidando l'espressione di BDNFAvi e BirA, seguito dalla purificazione della proteina ricombinante mediante cromatografia di affinità con una resa di 1-2 g di BDNF per 20 mL di supporti di coltura con condizioni HEK29317. Qui, proponiamo una modifica di questo protocollo che consente la purificazione BDNFAvi da 500 mL di supporti con condizione HEK293, che cerca di massimizzare il recupero delle proteine in un protocollo basato su colonna cromatografia per facilità di manipolazione. L'agente di trasfezione usato, la polietileneimina (PEI), garantisce un metodo conveniente senza sacrificare la resa della trasfezione. La fase di monobiozione è stata adattata a una reazione in vitro per evitare le complicazioni associate alla co-transfections e per garantire un'etichettatura omogenea del BDNF. L'attività biologica del mbtBDNF è stata dimostrata da esperimenti di microscopia a macchia e fluorescenza occidentali, tra cui l'attivazione del pCREB e l'imaging a cellule vive per studiare il trasporto assonale retrogrado del BDNF in camere microfluidiche. L'uso di questo protocollo consente una produzione ottimizzata e ad alto rendimento di BDNF omogeneo monobio-biobiolato e biologicamente attivo.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con le linee guida approvate di CONICYT (Commissione nazionale cilene per la ricerca scientifica e tecnologica). I protocolli utilizzati in questo studio sono stati approvati dai Comitati di Biosicurezza e Bioetica e Benessere Animale della Pontificia Universidad Catalica del Cile. Gli esperimenti riguardanti i vertebrati sono stati approvati dal Comitato per il benessere bioetico e animale della Pontificia Universidad Catalia de Chile.

NOTA: il seguente protocollo è stato progettato per purificare BDNFAvi da un volume totale di 500 mL di mezzo condizionato prodotto nelle celle HEK293. La quantità di mezzo condizionato che viene prodotto e trasformato per purificare BDNFAvi può essere aumentato o ridimensionato in base alle esigenze. Tuttavia, in queste circostanze potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione. La composizione dei mezzi di coltura e dei buffer utilizzati in tutto il protocollo si trova in materiali supplementari.

1. Produzione e purificazione di BDNFAvi da supporti con condizioni HEK293

  1. Trasfezione di cellule HEK293
    1. Coltivare le cellule HEK293 al 70% di confluenza nel mezzo DMEM integrato (10% di siero fetale bovino, 1x integratore di glutammato, 1x antibiotico/antimicotico) in 15 cm piatti di coltura a 37 oC.
    2. Modificare il buffer medio in disfezione.
    3. Preparare la miscela PEI-DNA per la trasfezione. Utilizzare due diversi tubi conici da 15 mL per diluire rispettivamente il DNA e il PEI 25 K. Diluire 20 g di DNA plasmico in un volume finale di 500 gradi in un tubo. Diluire 60 g di PEI 25K lineare in un volume finale di 500 l nell'altro tubo. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Pipette con attenzione la soluzione del DNA nel tubo PEI, mescolando una volta per movimento up-down. Incubare a temperatura ambiente per 25 min.
    5. Gocciola 1 mL della miscela PEI-DNA in ogni piatto di 15 cm. Incubare le cellule con la miscela PEI-DNA per 3 h a 37 oC.
    6. Modificare il buffer di incubazione medio-nuovo.
  2. Raccolta e archiviazione dei supporti
    1. Raccogliere il mezzo da tutti i piatti 48 h dopo la trasfezione delle cellule HEK293. Preparare le scorte concentrate delle soluzioni descritte nella sezione "supernatant modification buffer" del File supplementare 1 e aggiungerle al supernatante HEK293 per ottenere le concentrazioni finali elencate.
      NOTA: le celle possono essere scartate o recuperate per ulteriori analisi.
    2. Incubare il mezzo nel ghiaccio per 15 min.
    3. Aliquota il mezzo in tubi di centrifuga.
    4. Centrifugare il mezzo a 10.000 x g per 45 min in una centrifuga a 4 gradi centigradi. Questo passaggio consente l'eliminazione di detriti cellulari e cellule morte sospese nel supporto.
    5. Raccogliere i supernatanti, aggiungere BSA ad una concentrazione finale di 0.1%. e poi conservare a -20 gradi centigradi. Il supporto può essere sponsorizzato prima del congelamento per uno scongelamento più veloce durante la fase di purificazione.
      NOTA: i tempi di conservazione dei supporti congelati fino a 2 mesi hanno prodotto risultati positivi, non sono stati valutati tempi di conservazione più lunghi.
  3. Concentrazione e purificazione dei media
    1. Scongelare i mezzi di comunicazione in un bagno termoregolato a 37 gradi centigradi.
    2. Aliquota il supporto in tubi di centrifuga.
    3. Centrifugare il mezzo per 1 h a 3.500 x g in una centrifuga raffreddata a 4 gradi centigradi. Questo passaggio consente l'eliminazione dei detriti cellulari rimanenti per garantire un flusso adeguato attraverso la colonna della cromatografia.
    4. Utilizzare i concentratori di proteine con un cutoff di 10 kDa per ridurre il supporto da 500 mL a 100 mL. Seguire i parametri di centrifugazione raccomandati dal produttore per una concentrazione ottimale.
    5. Aggiungere 500 l di perline di agarose Ni-NTA al supporto concentrato e incubare pernottandosi per una notte a 4 gradi centigradi in un rocker.
    6. Assemblare l'apparato cromatografia e versare i media in esso. Lasciare riposare per 5 min e quindi aprire il stopcock a 2 vie per far scorrere il mezzo.
    7. Lavare le perline con 5 mL di tampone di lavaggio per 5 min. Assicurarsi di rispendere le perline nella colonna. Scolare il tampone di lavaggio aprendo il tappo a 2 vie. Ripetere 3 volte.
    8. Aggiungere 1 mL di buffer di eluizione alla colonna. Assicurati di risospendere le perline nella colonna. Incubare per 15 min, e poi raccogliere l'eluato in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Ripetere questo passaggio 3 volte per l'eluzione completa di BDNFAvi.
    9. Caricare 5 l di ogni eluate e diverse concentrazioni di BDNF (40-160 ng) disponibili in tutto il 15% in un gel poliacrilammide del 15%. Rilevare la proteina purificata dal gonfiore occidentale utilizzando un anticorpo anti-BDNF.
    10. Determinare la concentrazione del BDNFAvi purificato in ogni eluato utilizzando la curva di concentrazione preparata con il BDNF disponibile in commercio.
    11. Aliquota e conservare il BDNFAvi purificato a -80 gradi centigradi.

2. Monobiolazione in vitro di BDNFAvi utilizzando l'enzima BirA

  1. Reazione monobiolazione in vitro
    1. Preparare soluzioni di stock concentrato dei reagenti del buffer di biotinylazione. L'uso di scorte concentrate ridurrà al minimo la diluizione della proteina ricombinante.
    2. Prendere un 800 ng di BDNFAvi e aggiungere il reagenti buffer biotinylation e l'enzima BirA in una relazione molare 1:1 con BDNF. Ad esempio, per un'aggiunta di volume di reazione finale di 200 l; 100 litri di soluzione che contiene 800 ng di BDNFAvi, 20 M Bicine 0,5 M pH 8,3, 20 ATP 100 mM, 20L MgOAc 100 mM, 20 d-biotin 500 M, da 0,8 a 1 g a 1 l di BirA-GST, e completare fino a 200 gradi con acqua ultrapura.
      NOTA: Sono state eseguite reazioni di biotinylazione riuscite con aliquote di 400 gradi contenenti una concentrazione di circa 30 ng/ BDNFAvi, con conseguente BDNFAvi omogeneamente biotinyato ad una concentrazione finale di 20 ng/ .
    3. Mescolare la miscela a 30 gradi centigradi in un forno di ibridazione per 1 h. Mescolare il contenuto per inversione del tubo ogni 15 min.
    4. Aggiungere lo stesso volume di ATP e BirA come nel passaggio 2.1.2 e ripetere il passaggio 2.1.3.
    5. Conservare a -80 gradi centigradi per analisi future o conservare il ghiaccio per un uso immediato (ad esempio, il controllo della qualità della biotinylazione).
  2. Analisi della biotinylazione
    1. Blocco 30 -L di perline magnetiche streptavidin per ogni campione BDNF in 1 mL di buffer di blocco. Incubare a temperatura ambiente per 1 h in un rotore tubo di microcentrifuga.
    2. Precipitare le perline magnetiche utilizzando un rack di separazione magnetica per 3 a 5 minuti o fino a quando il buffer appare completamente cancellato dalle perline e scartare il buffer di blocco.
    3. Aggiungere alle perline 50 l di nuovo buffer di blocco e 80 ng di bDNFAvi monobionlate (mbtBDNF) alle perline, assicurandosi di risospenderle completamente con la pippeting.
    4. Incubare a 4 gradi centigradi per 1 h in un tubo di microcentrifuga rotatore a circa 20 giri/min.
    5. Raccogliere le perline utilizzando il rack di separazione magnetica per 3-5 minuti, e raccogliere il supernatante, mantenendo un 30 aliquota per l'analisi.
    6. Lavare le perline una volta con 500 ll di PBS, quindi raccoglierle utilizzando il rack di separazione magnetica per 3-5 minuti. Recuperare il supernatante e mantenere un 30 l per l'analisi dell'aliquota.
    7. Aggiungere 10 lofan di 4 volte di buffer di carico alle perline.
    8. Riscaldare i campioni a 97 gradi centigradi per 7 minuti per eluire il mbtBDNF.
    9. Rilevare mbtBDNF utilizzando un anticorpo specifico anti-BDNF19.

3. Verifica dell'attività biologica mbtBDNF

  1. Rilevamento di pTrkB e pERK da macchia occidentale.
    1. Seme 2 milioni di neuroni corticali di ratto in piatti di coltura 60 mm.
    2. Cultura i neuroni per 7 giorni (DIV7). Quindi, cambiare il medio a mediun neurobasal non integrato quando si avvia l'esperimento.
    3. Un'ora dopo il cambiamento medio, aggiungere mbtBDNF a una concentrazione finale di 50 ng/mL. Incubare per 30 min a 37 oC. Tenere una parabola di controllo negativo (non stimolata con BDNF) e una parabola di controllo positiva (trattata con 50 ng/mL di BDNF disponibile in commercio).
    4. Raccogliere il mezzo e lavare delicatamente ogni piatto con 1x PBS. Raccogliere e scartare il 1x PBS.
    5. Disporre i piatti sul ghiaccio e aggiungere 50-80 l'l di tampone di lisi ad ogni piatto. Utilizzare un raschietto cellulare per losizzare le cellule.
      NOTA: Il passo di lisi deve essere eseguito il più rapidamente possibile per evitare la deptolorylazione e la degradazione delle proteine. 1-2 minuti di raschiatura vigorosa sono sufficienti per visualizzare le proteine di interesse da gonfiore occidentale.
    6. Raccogliere il tampone di lisi e mescolare in un mixer vortice alla massima velocità per 5 s.
    7. Centrifugare il buffer di lisi a 14.000 x g (4 gradi centigradi) per 10 min. Raccogliere il supernatante.
    8. Quantificare il contenuto proteico del supernatante mediante protocollo di quantificazione delle proteine BCA20.
    9. Aggiungere il buffer di carico a un'aliquota contenente 30-50 g di proteine per condizione e caricarlo in un gel poliacrilammide 12% per il gonfiore occidentale. Rilevare il pTrkB e il pERK usando anticorpi fosforo specifici per verificare l'attività biologica di BDNFAvi.
  2. Verifica dell'attività biologica BDNF-QD mediante immunofluorescenza pCREB.
    1. Seme 40.000 neuroni corticali ratti in 10 mm coprinti, precedentemente autoclaved e trattati con poli-L-lysina come descritto in precedenza21.
    2. Cultura i neuroni per 7-8 giorni in tampone di manutenzione neuronale (vedi materiali supplementari) a 37 oC.
    3. Per iniziare l'esperimento, cambiare il mezzo neurobasale medio a non integrato e incubare a 37 oC per 1 h.
    4. Preparare il mbtBDNF coniugato ai punti quantici (BDNF-QD) aggiungendo ad un mbtBDNFF, il volume necessario del coniugato di streptavidina del punto quantico (streptavidin-QD) per ottenere un rapporto molare 1:1 BDNF-QD. Quindi, diluire a 20 l con mezzo neurobasal. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
      NOTA: Preparare un altro tubo con lo stesso volume di streptavidin a punti quantici coniugato e diluirlo a 20 l con mezzo neurobasale come controllo negativo.
    5. Incubare la miscela mbtBDNF / streptavidin-QD per 30 min a temperatura ambiente in un rocker.
    6. Diluire il BDNF-QD alla concentrazione finale desiderata (200 pM e 2 nM) nel mezzo neurobasale.
    7. Dopo 1 h di incubazione con mezzo neurobasale non integrato, stimolare i neuroni con BDNF-QD o streptavidin-QD (controllo) ad una concentrazione finale di 200 pM e 2 nM di BDNF per 30 min a 37 .
    8. Lavare i coperchi 3 volte con 1x PBS (37 gradi centigradi) e fissare le cellule per 15 min trattando il coperchio con una soluzione di paraformaldeide del 4% contenente inibitori del fosfosi.
    9. Lavare le cellule 3 volte con PBS, quindi incubare con buffer di blocco/permeabilizzazione (BSA 5%, Triton X-100 0,5%, 1x inibitore del fosfosi) per 1 h.
    10. Incubare con anticorpo anti-pCREB 1:500 (nel 3% BSA, 0,1% Triton X-100) durante la notte a 4 gradi centigradi.
    11. Il giorno seguente, lavare 3 volte con 1x PBS, e incubare per 1 h con l'anticorpo secondario 1:500 (3% BSA, 0.1% Triton X-100).
    12. Lavare 3 volte con 1x PBS. Aggiungere la soluzione di macchia nucleare di Hoechst (5 g/mL) per 7 min.
    13. Lavare 3 volte con 1x PBS e montare.
  3. Visualizzazione del trasporto assonale retrogrado di BDNF-QD nei neuroni vivi
    1. Preparare camere microfluidiche e neuroni dei semi come descritto in precedenza16.
    2. Dopo 7-8 giorni in coltura, cambiare il mezzo medio a mezzo neurobasale non integrato.
    3. Preparare il mbtBDNF coniugato ai punti quantici (BDNF-QD) aggiungendo ad un mbtBDNFF, il volume necessario del coniugato di streptavidina del punto quantico (streptavidin-QD) per ottenere un rapporto molare 1:1 BDNF-QD. Quindi, diluire a 20 l con mezzo neurobasal. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
      NOTA: Preparare un altro tubo con lo stesso volume di streptavidin a punti quantici coniugato e diluirlo a 20 l con mezzo neurobasale come controllo.
    4. Incubare la miscela mbtBDNF / streptavidin-QD per 30 min a temperatura ambiente in un rocker.
    5. Diluire il BDNF-QD alla concentrazione finale desiderata (2 nM).
    6. Dopo 1 h di incubazione con mezzo neurobasale non integrato aggiungere il BDNF-QD o la miscela di controllo ai compartimenti assonali della camera microfluidica. Incubare per 210 min a 37 s per garantire un trasporto retrogrado netto di BDNF-QD.
    7. Per l'imaging a celle vive, visualizzare il trasporto retrogrado assonale nel segmento dei microgroove che è prossimale al compartimento del corpo cellulare utilizzando un obiettivo 100x utilizzando un microscopio adatto a questi scopi (37 e 5% di CO2). Acquisire immagini a 1 fotogramma/s.

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Risultati

L'uso di un protocollo cromatografico basato su colonne consente l'elaborazione di volumi significativi di supporti condizionati HEK293. Nella Figura 1vengono visualizzati i risultati della purificazione di BDNFAvi da 500 mL di supporti condizionati. Le luzioni consecutive di BDNFAvi dalle perline di agarose Ni-NTA producono concentrazioni decrescenti di BDNFAvi(Figura 1A). Dopo quattro eluzioni consecutive (ognuna della durata di 15 min), la maggior parte del B...

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Discussione

In questo articolo viene descritta una metodologia ottimizzata per la produzione e la purificazione di mbtBDNF in una procedura basata sulla cromatografia di affinità, basata sul lavoro di Sung e dei collaboratori17. Le ottimizzazioni includono l'uso di una reagente di trasfezione conveniente (PEI) pur mantenendo l'efficienza di metodi di trasfezione più costosi come la lipofectamine. Questa ottimizzazione si traduce in una significativa riduzione dei costi nel protocollo, consentendo una scalabil...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario di Fondecyt (1171137) (FCB), il Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucle (P07/011-F) (FCB), il Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116 / 15 / s) (GS) e un premio UK Dementia Research Institute Foundation (GS). Questo lavoro è stato supportato dall'Unidad de Microscopa Avanzada UC (UMA UC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Rubinetto a 2 vieBioRad7328102Componente dell'apparecchio per cromatografia
2-mercaptoetanoloSigmaM6250Tampone di eluizione BDNF
Acrilammide/BisacrilammideBioRad1610154Preparazione del gel SDS-PAGE
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024Concentrazione di BDNF
Persolfato di ammonioSigmaA9164Preparazione del gel SDS-PAGE
anticorpo anti B-III-TubulinaSigmaT8578Saggi Western blot per il rilevamento dell'attività biologica BDNF
anticorpo anti BDNFAlomoneAGP-021Saggi Western blot per la quantificazione del BDNF
anticorpo anti BDNFAlomoneANT-010Saggi Western blot per la quantificazione del BDNF
Anti ERK anticorpoCell Signaling9102Saggi Western blot per il rilevamento dell'attività biologica BDNF
anticorpi anti pCREB (S133)Cell Signaling9198Saggi Western blot per il rilevamento dell'attività biologica BDNF
anticorpi anti pERK (T202, Y204)Cell Signaling4370Saggi Western blot per il rilevamento dell'attività biologica BDNF
anticorpi anti pTrkB (Y515)Abcamab109684Saggi Western blot per il rilevamento dell'attività biologica del BDNF
Antibiotico/antimicoticoGibco15240-062HEK293 mantenimento
ATPSigmaA26209BDNF tampone di monobiotinilazione
B-27 SupplementoGibco17504-044Mantenimento dei neuroni
BicineSigmaB3876tampone di monobiotinilazione BDNF
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzima per BDNF AviTag monobiotinilazione
Siero fetale bovinoHyCloneHC. SH30396.02HEK293
mantenimento Albumina sierica bovinaJackson ImmunoResearch001-000-162Componente di modifica del tampone BDNF, tampone bloccante per western blot e immunofluorescenza
D-BiotinaSigmaB4639BDNF tampone di monobiotinilazione
DMEM Alto glucosio MediumGibco11965-092Semina neuronale
DMEM MediumGibco11995-081Manutenzione HEK293
Econo Column FunnelBioRad7310003Componente dell'apparecchio per cromatografia
EDTAMerck108418
Kit EZ-ECLBiological Industries1633664Rilevamento di proteine mediante western blotting
GlutamaxGibco35050-061Neuron e manutenzione HEK293
GlycerolMerck104094Tampone di eluizione BDNF, tampone di lisi per saggi western blot
Centrifuga Hettich Rotina 46R CentrifugaproduzioneHettichutilizzata per eliminare il terreno dai detriti
Centrifuga Hettich Universal 32R CentrifugaHettichfuori produzioneutilizzata per la centrifugazione del concentratore di proteine
Siero di cavalloGibco16050-122Semina neuronale
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western blot acquisizione di immagini
ImidazoleSigmaI55513BDNF componente di modifica del tampone
KClWinklerBM-1370componente PBS
KH2PO4Merck104873componente PBS
LamininInvitrogen23017-015Rivestimento di copertura per neuroni compartimentati
Adattatore per tubo LuerBioRad7323245Componente per apparecchio cromatografico
Luminata™ Substrato Forte Western HRPMilliporeWBLUF0100Rilevamento di proteine mediante western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819tampone di monobiotinilazione BDNF
Mowiol 4-88Calbiochem475904Reagente di montaggio per saggi di immunofluorescenza
MyOne C1 Streptavidin Magnetic BeadsInvitrogen65001Verifica della biotinilazione
Na2HPO4Merck106586Componente di modifica del tampone BDNF
NaClWinklerBM-1630Componente PBS, componente di modifica del tampone BDNF
NaH2PO4Merck106346Componente di modifica del tampone BDNF
Terreno neurobasaleGibco21103-049Manutenzione dei neuroni
Perle di agarosio Ni-NTAQiagen30210BDNF Purificazione AviTag
Nikon Ti2-EMicroscopio Nikonper imaging a fluorescenza
Membrana di nitrocellulosaBioRad1620115Trasferimento di proteine per western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Fotocamera CMOS digitaleHamamatsuC13440-20CUTelecamera per l'imaging dell'epifluorescenza
P8340 Inibitore della proteasi CocktailSigmaP8340BDNF Componente di modifica del tampone
ParaformaldeideMerck104005Fissativo per saggi di immunofluorescenza
Penicillina/StreptomicinaGibco15140-122Manutenzione dei neuroni
Poli-D-LisinaCorningDLW354210Rivestimento di copertura per neuroni compartimentati
Poli-L-LisinaMilliporeP2363Rivestimento di copertura per neuroni non compartimentalizzati
Colonna per cromatografia Poly-PrepBioRad7311550Componente dell'apparecchio per cromatografia
Polietilenimmina 25KPolysciences Inc.Trasfezione PLY-0296HEK293
Quantum Dots 655 coniugato di streptavidinaInvitrogenQ10121MPBDNF monobiotinilato Etichetta AviTag per esperimenti su cellule vive e fissate
SaponinaSigmaS4521Detergente per saggi di immunofluorescenza
Syldgard 184 base di elastomero siliconicoPoirot4019862Preparazione della camera microfluidica
TEMEDPreparazione del gel SigmaT9281SDS-PAGE
TrisWinklerBM-2000Componente tampone di lisi
Triton X100Merck108603Permeabilizzazione cellulare in saggi di immunofluorescenza e western blot
Tripsina-EDTA 0,5%Gibco15400-054HEK293 passamento
fuori

Riferimenti

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