Articolo metodologico

Un protocollo migliorato per purificare e direttamente mono-biotinyare recombinante BDNF in un tubo per gli studi sul traffico cellulare nei neuroni

DOI:

10.3791/61262

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11 luglio 2020

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1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

In questo articolo

Sommario

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Il BDNF ricombinante contenente una sequenza Avi (BDNFAvi) viene prodotto nelle cellule HEK293 in modo conveniente ed è purificato dalla cromatografia di affinità. BDNFavi viene quindi direttamente mono-biotinylated con l'enzima BirA in un tubo. BDNFavi e BDNFavi monobionlate mantengono la loro attività biologica rispetto al BDNF disponibile in commercio.

Abstract

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Il BDNF ricombinante contenente una sequenza Avi (BDNFAvi) viene prodotto nelle cellule HEK293 e quindi purificato in modo conveniente dalla cromatografia di affinità. È stato sviluppato un protocollo riproducibile per mono-biotinylate BDNFAvi direttamente monobiolare con l'enzima BirA in un tubo. In questa reazione, BDNFAvi monobiolato mantiene la sua attività biologica.

Le neurotrofie sono fattori di crescita derivati dagli obiettivi che svolgono un ruolo nello sviluppo e nella manutenzione neuronali. Essi richiedono meccanismi di trasporto rapido lungo il percorso endocitico per consentire la segnalazione a lunga distanza tra diversi compartimenti neuronali. Lo sviluppo di strumenti molecolari per studiare il traffico di neurotrofinelle ha permesso il monitoraggio preciso di queste proteine nella cellula utilizzando la registrazione in vivo. In questo protocollo, abbiamo sviluppato una procedura ottimizzata ed economica per la produzione di BDNF monobionlate. Una variante BDNF ricombinante contenente una sequenza avi biotinyilable (BDNFAvi) viene prodotta in cellule HEK293 nell'intervallo di microgrammi e quindi purificata in una procedura facilmente scalabile utilizzando la cromatografia di affinità. Il BDNF purificato può quindi essere omogeneamente mono-biotinylated da una reazione diretta in vitro con l'enzima BirA in un tubo. L'attività biologica del BDNF monobiolato (mbtBDNF) può essere coniugata a streptavidin-conjugated a diversi fluorofori. BDNFAvi e mbtBDNF mantengono la loro attività biologica dimostrata attraverso il rilevamento di bersagli fosforillati a valle utilizzando macchie occidentali e l'attivazione del fattore di trascrizione CREB, rispettivamente. Utilizzando i punti streptavidin-quantum, siamo stati in grado di visualizzare l'internalizzazione mbtBDNF concomitante con l'attivazione del CREB, che è stato rilevato con un anticorpo specifico fosforo-CREB. Inoltre, mbtBDNF coniugato ai punti streptavidin-quantum era adatto per l'analisi del trasporto retrogrado nei neuroni corticali coltivati in camere microfluidiche. Così, in tubo prodotto mbtBDNF è uno strumento affidabile per studiare la dinamica endosomica di segnalazione fisiologica e il traffico di neuroni.

Introduzione

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I neuroni sono le unità funzionali del sistema nervoso in possesso di una morfologia complessa e specializzata che consente la comunicazione sinaptica, e quindi la generazione di un comportamento coordinato e complesso in risposta a diversi stimoli. Proiezioni neuronali come dendriti e assoni sono caratteristiche strutturali critiche coinvolte nella comunicazione neuronale, e le neurotrofie sono fattori cruciali per determinare la loro morfologia e funzione1. Le neurotrofie sono una famiglia di fattori di crescita secreti che includono NGF, NT-3, NT-4 e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)2. Nel sistema nerv....

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con le linee guida approvate di CONICYT (Commissione nazionale cilene per la ricerca scientifica e tecnologica). I protocolli utilizzati in questo studio sono stati approvati dai Comitati di Biosicurezza e Bioetica e Benessere Animale della Pontificia Universidad Catalica del Cile. Gli esperimenti riguardanti i vertebrati sono stati approvati dal Comitato per il benessere bioetico e animale della Pontificia Universidad Catalia de Chile.

NOTA: il seguente protocollo è stato progettato per purificare BDNFAvi da un volume totale di 500 mL di mezzo condizionato prodotto nelle celle HEK29....

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Risultati

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L'uso di un protocollo cromatografico basato su colonne consente l'elaborazione di volumi significativi di supporti condizionati HEK293. Nella Figura 1vengono visualizzati i risultati della purificazione di BDNFAvi da 500 mL di supporti condizionati. Le luzioni consecutive di BDNFAvi dalle perline di agarose Ni-NTA producono concentrazioni decrescenti di BDNFAvi(Figura 1A). Dopo quattro eluzioni consecutive (ognuna della durata di 15 min), la maggior parte del B.......

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Discussione

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In questo articolo viene descritta una metodologia ottimizzata per la produzione e la purificazione di mbtBDNF in una procedura basata sulla cromatografia di affinità, basata sul lavoro di Sung e dei collaboratori17. Le ottimizzazioni includono l'uso di una reagente di trasfezione conveniente (PEI) pur mantenendo l'efficienza di metodi di trasfezione più costosi come la lipofectamine. Questa ottimizzazione si traduce in una significativa riduzione dei costi nel protocollo, consentendo una scalabil.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario di Fondecyt (1171137) (FCB), il Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucle (P07/011-F) (FCB), il Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116 / 15 / s) (GS) e un premio UK Dementia Research Institute Foundation (GS). Questo lavoro è stato supportato dall'Unidad de Microscopa Avanzada UC (UMA UC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Rubinetto a 2 vieBioRad7328102Componente dell'apparecchio per cromatografia
2-mercaptoetanoloSigmaM6250Tampone di eluizione BDNF
Acrilammide/BisacrilammideBioRad1610154Preparazione del gel SDS-PAGE
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024Concentrazione di BDNF
Persolfato di ammonioSigmaA9164Preparazione del gel SDS-PAGE
anticorpo anti B-III-TubulinaSigmaT8578Saggi Western blot per il rilevamento dell'attività biologica BDNF
anticorpo anti BDNFAlomoneAGP-021Saggi Western blot per la quantificazione del BDNF
anticorpo anti BDNFAlomoneANT-010Saggi Western blot per la quantificazione del BDNF
Anti ERK anticorpoCell Signaling9102Saggi Western blot per il rilevamento dell'attività biologica BDNF
anticorpi anti pCREB (S133)Cell Signaling9198Saggi Western blot per il rilevamento dell'attività biologica BDNF
anticorpi anti pERK (T202, Y204)Cell Signaling4370Saggi Western blot per il rilevamento dell'attività biologica BDNF
anticorpi anti pTrkB (Y515)Abcamab109684Saggi Western blot per il rilevamento dell'attività biologica del BDNF
Antibiotico/antimicoticoGibco15240-062HEK293 mantenimento
ATPSigmaA26209BDNF tampone di monobiotinilazione
B-27 SupplementoGibco17504-044Mantenimento dei neuroni
BicineSigmaB3876tampone di monobiotinilazione BDNF
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzima per BDNF AviTag monobiotinilazione
Siero fetale bovinoHyCloneHC. SH30396.02HEK293
mantenimento Albumina sierica bovinaJackson ImmunoResearch001-000-162Componente di modifica del tampone BDNF, tampone bloccante per western blot e immunofluorescenza
D-BiotinaSigmaB4639BDNF tampone di monobiotinilazione
DMEM Alto glucosio MediumGibco11965-092Semina neuronale
DMEM MediumGibco11995-081Manutenzione HEK293
Econo Column FunnelBioRad7310003Componente dell'apparecchio per cromatografia
EDTAMerck108418
Kit EZ-ECLBiological Industries1633664Rilevamento di proteine mediante western blotting
GlutamaxGibco35050-061Neuron e manutenzione HEK293
GlycerolMerck104094Tampone di eluizione BDNF, tampone di lisi per saggi western blot
Centrifuga Hettich Rotina 46R CentrifugaproduzioneHettichutilizzata per eliminare il terreno dai detriti
Centrifuga Hettich Universal 32R CentrifugaHettichfuori produzioneutilizzata per la centrifugazione del concentratore di proteine
Siero di cavalloGibco16050-122Semina neuronale
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western blot acquisizione di immagini
ImidazoleSigmaI55513BDNF componente di modifica del tampone
KClWinklerBM-1370componente PBS
KH2PO4Merck104873componente PBS
LamininInvitrogen23017-015Rivestimento di copertura per neuroni compartimentati
Adattatore per tubo LuerBioRad7323245Componente per apparecchio cromatografico
Luminata™ Substrato Forte Western HRPMilliporeWBLUF0100Rilevamento di proteine mediante western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819tampone di monobiotinilazione BDNF
Mowiol 4-88Calbiochem475904Reagente di montaggio per saggi di immunofluorescenza
MyOne C1 Streptavidin Magnetic BeadsInvitrogen65001Verifica della biotinilazione
Na2HPO4Merck106586Componente di modifica del tampone BDNF
NaClWinklerBM-1630Componente PBS, componente di modifica del tampone BDNF
NaH2PO4Merck106346Componente di modifica del tampone BDNF
Terreno neurobasaleGibco21103-049Manutenzione dei neuroni
Perle di agarosio Ni-NTAQiagen30210BDNF Purificazione AviTag
Nikon Ti2-EMicroscopio Nikonper imaging a fluorescenza
Membrana di nitrocellulosaBioRad1620115Trasferimento di proteine per western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Fotocamera CMOS digitaleHamamatsuC13440-20CUTelecamera per l'imaging dell'epifluorescenza
P8340 Inibitore della proteasi CocktailSigmaP8340BDNF Componente di modifica del tampone
ParaformaldeideMerck104005Fissativo per saggi di immunofluorescenza
Penicillina/StreptomicinaGibco15140-122Manutenzione dei neuroni
Poli-D-LisinaCorningDLW354210Rivestimento di copertura per neuroni compartimentati
Poli-L-LisinaMilliporeP2363Rivestimento di copertura per neuroni non compartimentalizzati
Colonna per cromatografia Poly-PrepBioRad7311550Componente dell'apparecchio per cromatografia
Polietilenimmina 25KPolysciences Inc.Trasfezione PLY-0296HEK293
Quantum Dots 655 coniugato di streptavidinaInvitrogenQ10121MPBDNF monobiotinilato Etichetta AviTag per esperimenti su cellule vive e fissate
SaponinaSigmaS4521Detergente per saggi di immunofluorescenza
Syldgard 184 base di elastomero siliconicoPoirot4019862Preparazione della camera microfluidica
TEMEDPreparazione del gel SigmaT9281SDS-PAGE
TrisWinklerBM-2000Componente tampone di lisi
Triton X100Merck108603Permeabilizzazione cellulare in saggi di immunofluorescenza e western blot
Tripsina-EDTA 0,5%Gibco15400-054HEK293 passamento
fuori

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology.

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Purificazione del BDNFCromatografia d affinitMonobiotinilazioneBDNF di ovidottoCellule HEK293Enzima BirAQuantum dot di streptavidinaNeuroni corticaliCamere microfluidicheWestern Blot

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