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Articolo metodologico

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

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⸱

DOI:

10.3791/61270

⸱

20 maggio 2020

 ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

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Sommario

L'iniezione endovenosa di cellule tumorali viene spesso utilizzata nella ricerca sulle metastasi, ma il carico tumorale metastatico può essere difficile da analizzare. Qui, dimostriamo un modello di iniezione della vena caudale di metastasi e includiamo un nuovo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico risultante.

Abstract

Le metastasi, la causa principale di morbilità e mortalità per la maggior parte dei malati di cancro, possono essere difficili da modellare preclinicamente nei topi. Sono disponibili pochi modelli di metastasi spontanee. Pertanto, il modello sperimentale di metastasi che coinvolge l'iniezione della vena caudale di linee cellulari adatte è un pilastro della ricerca sulle metastasi. Quando le cellule tumorali vengono iniettate nella vena laterale della coda, il polmone è il loro sito preferito di colonizzazione. Una potenziale limitazione di questa tecnica è la quantificazione accurata del carico tumorale polmonare metastatico. Mentre alcuni ricercatori contano macrometastasi di dimensioni predefinite e/o includono micrometastasi dopo il sezionamento del tessuto, altri determinano l'area delle lesioni metastatiche rispetto all'area tissutale normale. Entrambi questi metodi di quantificazione possono essere estremamente difficili quando il carico metastatico è elevato. Qui, dimostriamo un modello di iniezione endovenosa di metastasi polmonari seguito da un metodo avanzato per quantificare il carico tumorale metastatico utilizzando un software di analisi delle immagini. Questo processo consente di studiare più parametri end-point, tra cui la dimensione media delle metastasi, il numero totale di metastasi e l'area totale delle metastasi, per fornire un'analisi completa. Inoltre, questo metodo è stato esaminato da un patologo veterinario certificato dall'American College of Veterinary Pathologists (SEK) per garantire l'accuratezza.

Introduzione

Nonostante sia un processo altamente complesso e inefficiente1, le metastasi contribuiscono in modo significativo alla morbilità e alla mortalità dei pazienti oncologici2. In effetti, la maggior parte dei decessi correlati al cancro sono attribuiti alla diffusione metastatica della malattia3,4. Affinché le cellule tumorali possano metastatizzare con successo, devono staccarsi dal sito primario, invadere attraverso lo stroma adiacente, intravasare la circolazione sanguigna o linfatica, viaggiare verso il letto capillare di un sito secondario, estravasare nel tessuto secondario e proliferare o crescere fino a formare lesioni metastatiche5. L'uso di modelli murini è stato fondamentale per promuovere la comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della semina e della crescita metastatica6,7. Qui ci concentriamo sulle metastasi del cancro al seno, per le quali vengono spesso utilizzati sia modelli murini geneticamente modificati che metodi di trapianto, ognuno con la propria serie di vantaggi e limitazioni.

I modelli di tumore mammario geneticamente modificati fanno uso di promotori specifici della ghiandola mammaria, tra cui MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus long terminal repeat) e WAP (Whey Acidic Protein), per guidare l'espressione dei transgeni nell'epitelio mammario8. Gli oncogeni tra cui l'antigene T medio del polioma (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 e il virus simian 40 (SV40) sono stati espressi in questo modo9,10,11,12,13, e mentre questi modelli genetici sono utili per studiare l'inizio e la progressione del tumore primario, pochi metastatizzano facilmente in organi distanti. Inoltre, questi modelli genetici murini sono spesso più proibitivi in termini di tempo e costi rispetto ai modelli di metastasi spontanee o sperimentali. Data la limitazione della maggior parte dei modelli di tumore mammario geneticamente modificati per studiare le metastasi, le tecniche di trapianto sono diventate metodi interessanti per studiare questo complesso processo. Ciò include l'iniezione ortotopica, della vena della coda, intracardiaca e intracranica di linee cellulari adatte.

Sebbene diverse linee cellulari di cancro al seno metastatizzino prontamente dopo l'iniezione ortotopica nel cuscinetto di grasso mammario14,15, la consistenza e la riproducibilità del carico tumorale metastatico può essere una sfida e la durata di tali studi può essere dell'ordine di diversi mesi. Per valutare le metastasi polmonari, in particolare, l'iniezione endovenosa nella vena della coda è spesso un metodo più riproducibile ed efficace nel tempo con diffusione metastatica che si verifica tipicamente nell'arco di poche settimane. Tuttavia, poiché il modello di iniezione endovenosa bypassa le fasi iniziali della cascata metastatica, è necessario prestare attenzione nell'interpretare i risultati di questi studi. In questa dimostrazione, mostriamo l'iniezione della vena caudale di cellule tumorali mammarie insieme a un metodo di analisi accurato e completo.

Anche se la comunità di ricerca ha compiuto progressi significativi nella comprensione del complesso processo delle metastasi del cancro al seno, si stima che oltre 150.000 donne abbiano attualmente il cancro al seno metastatico16. Di quelli con carcinoma mammario in stadio IV, >36% dei pazienti ha metastasi polmonari17; tuttavia, il modello sito-specifico e l'incidenza delle metastasi possono variare in base al sottotipo molecolare18,19,20,21. Le pazienti con metastasi polmonari associate al cancro al seno hanno una sopravvivenza mediana di soli 21 mesi, evidenziando la necessità di identificare trattamenti efficaci e nuovi biomarcatori per questa malattia17. L'uso di modelli sperimentali di metastasi, compresa l'iniezione endovenosa di cellule tumorali, continuerà a far progredire la nostra conoscenza di questa importante sfida clinica. Quando combinate con la patologia di imaging digitale e il metodo di analisi del carico tumorale polmonare metastatico descritto in questo protocollo, le iniezioni di vena caudale sono uno strumento prezioso per la ricerca sulle metastasi del cancro al seno.

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Protocollo

L'uso degli animali ha seguito i regolamenti dell'Università Laboratory Animal Resources (ULAR) nell'ambito del protocollo approvato dall'OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).

1. Iniezione della vena della coda delle cellule del cancro al seno

  1. Preparazione di cellule e siringhe per iniezione
    1. Placcare un numero appropriato di cellule in base al numero di topi e alla concentrazione cellulare da utilizzare.
      NOTA: Il numero di cellule iniettate e il tempo per lo sviluppo delle metastasi dipenderanno dalla linea cellulare utilizzata e dovranno essere ottimizzati. In questa dimostrazione, 1 x 106 cellule MDA-MB-231 vengono iniettate per via endovenosa in topi NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) e le lesioni polmonari macroscopiche vengono osservate entro e non oltre 24 giorni dopo l'iniezione. Per la linea cellulare del tumore mammario murino MVT117, 3 x 106 cellule vengono iniettate in topi FVB/N immunocompatibili con numerose metastasi polmonari osservate da 14 giorni22,23.
    2. Aspirare i mezzi e le piastre delle celle di risciacquo con 1x PBS. Tripsinizzare le cellule in volume minimo, aggiungere il volume appropriato di media e contare le cellule utilizzando un ematocitometro o un altro metodo preferito. Il blu di tripano (0,4%) o altri coloranti a cellule vive / morte possono essere utilizzati per determinare la conta cellulare vitale.
    3. Celle a pellet ruotando a 180 x g per 5 min.
    4. Sospendere il numero appropriato di cellule in PBS sterile 1x in modo tale che venga iniettato un volume di 100 μL per topo. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio per mantenere la vitalità.
    5. Prima dell'iniezione, risospendare accuratamente le cellule con una pipetta da 200 μL o 1 mL per evitare l'aggregazione. Aspirare 100 μL in una siringa da insulina da 28 G (vedere Tabella dei materiali).
    6. Eliminare eventuali bolle d'aria mantenendo la siringa verticale, picchiettando la siringa e regolando lentamente lo stantuffo. L'iniezione di bolle d'aria nella vena è probabile che causi un'embolia aria / gas che può essere fatale.
  2. Iniezione laterale della vena della coda
    NOTA: Per i test sperimentali di metastasi del cancro al seno, le iniezioni vengono eseguite su topi femmina di > 6 settimane.
    1. Maneggiare il mouse per la coda e far scivolare l'animale in un tubo/dispositivo di ritenuta a fessura di dimensioni appropriate (vedere la tabella dei materiali per il dispositivo di ritenuta utilizzato).
    2. Inserire la parte della spina del dispositivo di ritenuta e posizionare il mouse su un lato in modo tale che la sua vena laterale della coda sia facile da visualizzare. Il topo ha un'arteria ventrale in linea con i genitali, una vena dorsale e due vene caudali laterali.
    3. Pulire la superficie della coda del mouse con una salvietta asettica. Afferrare la coda tra indice e pollice con la mano non dominante e applicare una leggera tensione.
    4. A partire dalla porzione distale della coda, inserire l'ago parallelo alla vena con la fine smussata.
    5. Se consentito, ricapitolare attentamente l'ago e piegarlo con un angolo di 20-30 °. Un dispositivo di avvicinamento con una sola mano o un dispositivo di ricapitolazione dell'ago è altamente raccomandato.
      NOTA: Non è necessario aspirare in quanto ciò potrebbe causare il collasso della vena. Tuttavia, un piccolo lampo di sangue può essere visto quando viene posizionato per la prima volta. L'ago avanzerà dolcemente nella vena con un posizionamento corretto.
    6. Erogare lentamente il volume completo nella vena. Non ci dovrebbe essere resistenza quando lo stantuffo viene spinto.
    7. Se si avverte resistenza, rimuovere prontamente l'ago della siringa. Se necessario, reinserire l'ago (idealmente non più di 3 tentativi) spostandosi verso l'estremità prossimale della coda o la vena laterale opposta.
    8. Un piccolo volume di sangue sarà probabilmente spostato dopo l'iniezione. Applicare una leggera pressione con una garza sterile e pulire con una salvietta asettica.
    9. Smaltire tempestivamente la siringa in un apposito contenitore per taglienti.
    10. Riportare il mouse in una gabbia pulita e ventilata e monitorare i segni di pericolo.
    11. Monitorare i topi 2-3x / settimana per segni di formazione di metastasi (respirazione affannosa, postura curva, perdita di peso) e disagio generale. Il tempo di sviluppo delle metastasi dipenderà dalla linea cellulare e dal ceppo di topo.
    12. Se si utilizza un dispositivo di imaging animale vivo in vivo, i topi immagine immediatamente dopo l'iniezione della vena della coda per confermare il successo dell'iniezione di cellule e ottenere dati "zero" a tempo (dettagli specifici sull'imaging a bioluminescenza in vivo non sono inclusi nel presente documento, ma sono descritti da Yang et al.24).

2. Fissazione del tessuto polmonare e analisi del carico tumorale polmonare metastatico

  1. Gonfiaggio del tessuto polmonare per mantenere il formato strutturale dei polmoni per l'istopatologia
    1. Dopo aver seguito le procedure di eutanasia approvate (ad es. anidride carbonica al 30 - 70% di spostamento del volume della camera / min), fissare la carcassa del topo a una scheda di dissezione con perni. Spruzzare o applicare il 70% di etanolo per tenere la pelliccia del topo fuori mano durante la dissezione.
      NOTA: L'asfissia da anidride carbonica può causare emorragia polmonare come lesione di fondo prevista, specialmente a portate più lente.
    2. Aprire il torace con un'incisione della linea mediana, estendere l'incisione cranicamente / caudale attraverso il peritoneo e tagliare via il diaframma afferrando il processo xifoide.
    3. Usando un set separato di forbici per non opacizzare le lame, tagliare le costole lungo ciascun lato dello sterno e rimuovere con cura la gabbia toracica lasciando spazio ai polmoni per espandersi.
    4. Isolare la trachea rimuovendo le ghiandole salivari sottomandibolari e la muscolatura infraioide. Posizionare i perni su entrambi i lati della trachea può impedire movimenti indesiderati durante l'inserimento dell'ago.
    5. Riempire una siringa da 26 G con 2-3 mL di formalina tamponata neutra al 10% e inserirla nella trachea.
    6. Iniettare lentamente formalina e guardare per i polmoni di espandersi (di solito richiede ~ 1,5 ml di formalina).
    7. Una volta che la formalina inizia a fuoriuscire dai polmoni (evitare l'inflazione eccessiva), pizzicare la trachea con un paio di pinze, rimuovere l'ago della siringa e staccare l'intero apparato respiratorio. Posizionare polmoni, cuore, ecc. direttamente nella formalina poiché è possibile eseguire ulteriori rifilature del tessuto dopo la fissazione.
    8. Completa la lavorazione, l'incorporamento, il sezionamento del tessuto e la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) utilizzando metodi standard.
  2. Analisi del carico tumorale polmonare metastatico
    1. Scansione di sezioni polmonari colorate di H&E su uno scanner a vetrini ad alta risoluzione con ingrandimento 40x (Figura 3).
    2. Importare immagini in un software di analisi delle immagini (ad esempio, Visiopharm Image Analysis) per la quantificazione delle metastasi polmonari.
      NOTA: si consiglia ai nuovi utenti di ottenere una formazione in loco o online per utilizzare il software di analisi delle immagini. Numerosi webinar sono disponibili anche attraverso la pagina web commerciale.
    3. Selezionare l'app Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis dalla libreria di app del software.
      NOTA: lo scopo di questa app è quello di etichettare e quantificare le metastasi polmonari sui vetrini colorati di H & E. Come parte dell'app 10118 H&E Lung Metastasis, la prima fase di elaborazione delle immagini segmenta il tessuto polmonare con l'app Tissue Detection. La seconda fase di elaborazione delle immagini utilizza l'app Metastasis Detect che identifica le metastasi all'interno del tessuto polmonare. Le metastasi sono identificate attraverso la forma insieme a regioni che sono troppo deformate, troppo rosse o troppo sparse per essere identificate come metastasi.
    4. Regola i parametri che definiscono la forma e la scarsità per adattarli al meglio alle immagini rappresentative. Le aree segmentate delle metastasi tumorali e del tessuto polmonare normale possono essere visualizzate utilizzando etichette di colore diverse per ogni tipo di tessuto.
      NOTA: nel caso in cui l'app non sia in grado di separare con precisione le metastasi dal tessuto polmonare normale, potrebbe essere necessario scrivere un'app personalizzata che utilizza il programma Visiopharm Decision Forest come è stato fatto per gli esperimenti (vedere figura 2 e figura 3). Di seguito sono riportati i dettagli per la scrittura di un algoritmo personalizzato. In caso contrario, procedere al passaggio 2.2.9.
    5. Apri il programma Decision Forest, che funziona addestrando più classi [ad esempio, tessuto polmonare (non neoplastico), metastasi, globuli rossi, epitelio e / o spazio bianco] su un'immagine desiderata. Nella Figura 2, le metastasi tumorali sono blu, il tessuto normale è verde e l'epitelio bronchiolare è giallo. Inoltre, i globuli rossi sono in rosso e gli spazi d'aria in rosa.
    6. Segui la serie di domande sì o no richieste per addestrare in modo appropriato ogni classe per un'immagine. L'accuratezza dell'algoritmo determinerà il numero di domande sì/no. Per l'analisi, l'algoritmo/app personalizzato è stato scritto con una precisione impostata su 50 (intervallo 0-100).
    7. Regola le funzionalità per ogni classe applicando filtri per affinare, sfocare, ordinare per forma, ecc. per migliorare l'accuratezza dell'algoritmo/app. Visiopharm visualizza ogni classe attraverso una o più lenti note come funzionalità. Le funzionalità modificano il modo in cui la classe vede l'immagine per far risaltare determinati colori o intensità.
      NOTA: per l'algoritmo personalizzato, le metastasi di 8500 μm2 e superiori sono etichettate e misurate come metastasi. Ciò tiene conto della varianza delle dimensioni e delle metastasi troppo piccole per essere rilevate. Piccole aree deformate e piccole aree metastatiche inferiori a 8500 μm2 sono state incluse nella normale quantificazione tissutale.
    8. Salva le impostazioni modificate dall'app o dall'algoritmo personalizzato e quindi applica l'algoritmo / app a un intero set o serie di tessuti colorati H & E.
    9. Infine, esportare tutte le variabili di output, incluse quelle elencate nella Tabella 1. L'area in micron al quadrato (μm2) può essere quantificata per ciascun tipo di tessuto e le percentuali sono derivate dall'area totale del tessuto netto del campione (cioè tessuto totale meno spazio aereo).
    10. Quando si crea un algoritmo personalizzato, rivedere i markup dei tessuti in consultazione con un patologo veterinario certificato dall'American College of Veterinary Pathologists per garantire misurazioni accurate e distinguere tra i tipi di tessuto.

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Risultati

Se si utilizzano cellule non etichettate per l'iniezione della vena della coda, può essere difficile confermare la colonizzazione polmonare fino a (1) il tempo dell'autopsia se si possono osservare macrometastasi o (2) dopo l'analisi istologica se esistono metastasi microscopiche. Con un ampio carico di tumore polmonare metastatico, i topi avranno faticato a respirare. Come con qualsiasi studio sul tumore, i topi devono essere attentamente monitorati per tutta la durata dello studio. L'uso di cellule marcate è un modo se...

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Discussione

Mentre i ricercatori continuano a utilizzare l'iniezione endovenosa di cellule tumorali come modello sperimentale per le metastasi, mancano pratiche standard per analizzare il carico tumorale metastatico risultante. In alcuni casi, differenze significative nel carico tumorale metastatico in caso di manipolazione di particolari linee cellulari e/o uso di composti chimici possono essere osservate macroscopicamente. Tuttavia, in altri casi, sottili differenze nella semina e nella crescita metastatica possono essere trascura...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

I dati rappresentativi sono stati finanziati attraverso il National Cancer Institute (K22CA218549 a S.T.S). Oltre alla loro assistenza nello sviluppo del metodo di analisi completo qui riportato, ringraziamo l'Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direttore - Krista La Perle, DVM, PhD) per i servizi di istologia e immunoistochimica e il Pathology Imaging Core per lo sviluppo e l'analisi degli algoritmi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
cuscinetti per la preparazione dell'alcolFisher Scientific22-363-750per pulire la coda prima dell'iniezione
dissezioneforte Fisher Scientific08-951-5per la dissezione del topo e il gonfiaggio del tessuto polmonare
DMEM con L-glutammina, 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodioFisher ScientificMT10013CVbase di terreni di coltura cellulare per linee cellulari MDA-MB-231 e MVT1
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1xFisher ScientificMT21030CVutilizzata per la risospensione di cellule tumorali per iniezione
etanolo (soluzione al 70 %)OSUutilizzata per ridurre al minimo il pelo del topo durante la dissezione; prestare attenzione - colorante blu di
Evan infiammabileMillipore SigmaE2129utilizzato all'1 % in PBS sterile per esercitarsi con il metodo di iniezione della vena di coda; usare cautela - reagente pericoloso
Siero fetale bovinoMillipore SigmaF4135additivo per terreni di coltura cellulare; utilizzato al 10% nelle
pinzeFisher Scientific10-270per la dissezione e il gonfiaggio dei tessuti polmonari
Topi FVB/NJThe Jackson Laboratory001800ceppo di topo singenico per cellule MVT1
emacitometro (Bright-Line)Millipore SigmaZ359629per l'uso in colture cellulari per ottenere la conta cellulare
siringa da insulina (28 G)Fisher Scientific14-829-1Bper iniezioni di vena di coda (BD 329424)
MDA-MB-231 cellulelinea cellulare di carcinoma mammario umanoATCC
cellule MVT1 celluletumore mammario di topo
aghi (26 G)Fisher Scientific14-826-15utilizzato per gonfiare il Formalina
tamponata neutra polmonare (10%)Fisher Scientific245685utilizzata come fissativo tissutale e per gonfiare il tessuto polmonare; prestare attenzione - reagente
pericoloso NOD. Topi Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)Il Jackson Laboratory005557gestito da OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillina Streptomycin 100xThermoFisher15140163Additivo per terreni di coltura cellulare
Garza sterileFisher ScientificNC9379092per l'applicazione di pressione sulla coda del topo in caso di sanguinamento
siringa (5 mL)Fisher Scientific14-955-458utilizzato per gonfiare il sistema
contenimento della vena caudaletopo Braintree Scientific, Inc.TV-150 STDutilizzato per trattenere il topo per iniezioni della vena caudale Blu
tripano (0,4 %)ThermoFisher15250061utilizzato in colture cellulari per valutare la vitalità
Tripsina-EDTA 0,25 %ThermoFisher25200-114utilizzato in coltura cellulare per staccare le cellule tumorali dalla piastra
DMEM ATCC di di del tessuto polmonare di di

Riferimenti

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Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

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