Questo protocollo descrive tre fasi per preparare i lobi ottici larvali e adulti di Drosophila per l'imaging: 1) dissezioni cerebrali, 2) immunoistochimica e 3) montaggio. L'accento è posto sul passaggio 3, poiché sono necessari orientamenti di montaggio distinti per visualizzare specifiche strutture del lobo ottico.
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Articolo metodologico
dissezione, immunoistochimica e montaggio di cervelli larvali e adulti di Drosophila per la visualizzazione del lobo ottico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il lobo ottico di Drosophila , composto da quattro neuropili: la lamina, il midollo, la lobula e la placca della lobula, è un eccellente sistema modello per esplorare i meccanismi di sviluppo che generano la diversità neurale e l'assemblaggio dei circuiti di azionamento. Data la sua complessa organizzazione tridimensionale, l'analisi del lobo ottico richiede di capire come i suoi neuropili adulti e i progenitori larvali sono posizionati l'uno rispetto all'altro e al cervello centrale. Qui, descriviamo un protocollo per la dissezione, l'immunocolorazione e il montaggio di cervelli larvali e adulti per l'imaging del lobo ottico. Particolare enfasi è posta sulla relazione tra l'orientamento del montaggio e l'organizzazione spaziale del lobo ottico. Descriviamo tre strategie di montaggio nella larva (anteriore, posteriore e laterale) e tre nell'adulto (anteriore, posteriore e orizzontale), ognuna delle quali fornisce un angolo di imaging ideale per una struttura distinta del lobo ottico.
Introduzione
Il sistema visivo di Drosophila, composto dall'occhio composto e dal lobo ottico sottostante, è stato un modello eccellente per lo studio dello sviluppo e della funzione dei circuiti neurali. Negli ultimi anni, il lobo ottico, in particolare, è emerso come un potente sistema in cui studiare i processi di sviluppo neurologico come la neurogenesi e il cablaggio dei circuiti 1,2,3,4,5,6,7,8. È cost....
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Protocollo
1. Preparazione del cervello larvale per l'imaging confocale
- Dissezioni
NOTA: Prima di iniziare la dissezione, preparare le soluzioni fix (4% di formaldeide in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)) e PBT (0,1-0,3% di tritone in PBS). La soluzione di fissaggio deve essere posta su ghiaccio durante la dissezione. Sebbene in questo protocollo venga utilizzato il fissativo della paraformaldeide (PFA), sono state descritte strategie di fissazione alternative (utilizzando PLP20 o PEM21) per epitopi specifici. Per le dissezioni larvali, sono necessarie due paia di pinze (Dumont #5 o #55s). ....
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Risultati
Le immagini confocali dei lobi ottici larvali e adulti montati negli orientamenti descritti nel protocollo sono presentate nella Figura 1 e nella Figura 2.
La Figura 1 mostra gli schemi e le fette confocali rappresentative di cervelli larvali posizionate negli orientamenti anteriore, posteriore e laterale. Nell'orientamento di montaggio anteriore, l'epitelio OPC (DE-caderina), i neuroblasti del midollo (<.......
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Discussione
In questo protocollo, descriviamo un metodo per immunocolorare il cervello larvale e adulto di Drosophila e montarlo in diversi orientamenti. Mentre i metodi per colorare il cervello larvale e adulto sono stati precedentemente descritti 22,23,24,27,28, le strategie di montaggio per la visualizzazione ottimale di specifiche strutture del lobo ottico hanno ricevuto meno attenzione <.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Claude Desplan per aver condiviso con noi un'aliquota dell'anticorpo Bsh. Gli anticorpi monoclonali DE-Caderina, Bassotto, Occhi Assenti, Seven-up e Bruchpilot sono stati ottenuti dalla Developmental Studies Hybridoma Bank, creata dal NICHD del NIH e mantenuta presso l'Università dell'Iowa, Dipartimento di Biologia, Iowa City, IA 52242. Questo lavoro è stato sostenuto da un NSERC Discovery Grant assegnato a T.E.. U.A. è supportata da una borsa di studio per laureati NSERC Alexander Graham Bell Canada. P.V. è supportato da una borsa di studio per laureati dell'Ontario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
| 37% formaldeide | Bioshop | FOR201 | |
| Alexa Fluor 488 (capra) secondario | Invitrogen | A-11055 | utilizzo a 1:500 |
| Alexa Fluor 555 (mouse) secondario | Invitrogen | A-31570 | utilizzo a 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (cavia) secondario | Invitrogen | A-21450 | utilizzo a 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (ratto) secondario | Invitrogen | A-21247 | uso a 1:500 |
| Vetrini coprioggetti | VWR | 48366-067 | |
| Pinze da dissezione - #5 | Dumont | 11251-10 | |
| Pinze da dissezione - #55 | Dumont | 11295-51 | |
| Piatto di dissezione | Corning | 722085 | |
| Salviette asciutte | Kimbery Clark | 34155 | |
| Anticorpo primario anti-Bgal di capra | Uso | a 1:1000 | |
| Anticorpo primario anti-Bsh di porcellino d'india | Dono di Claude Desplan | uso a 1:500 | |
| Anticorpo primario anti-Vsx1 di porcellino d'india | Erclik et al. 2008 | uso a 1:1000 | |
| Pellicola di laboratorio | Parafilm | PM-996 | |
| Provette | per microcentrifugaSarstedt | 72.706.600 | |
| Vetrini per microscopio | VWR | CA4823-180 | |
| Anticorpo primario anti-dac di topo | Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi (DSHB) | mabdac2-3 | uso a 1:20 |
| Anticorpo primario anti-eya di topo | DSHB | eya10H6 | uso a 1:20 |
| Anticorpo primario anti-nc82 di topo | DSHB | nc82 | uso a 1:50 |
| Topo anti-svp anticorpo primario | DSHB | Seven-up 2D3 | uso a 1:100 |
| Polymer Clay | Può essere utilizzato | ||
| Coniglio anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | uso a 1:1000 |
| Anticorpo primario anti-DE-Caderina di ratto | DSHB | DCAD2 | uso a 1:20 |
| Mezzo di montaggio a dissolvenza lenta | Invitrogen | S36967 | Il mezzo di montaggio Vectashield ( cat# H-1000) può essere utilizzato anche |
| Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |
Riferimenti
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
- Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Prolif....
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