Questo protocollo descrive tre fasi per preparare i lobi ottici larvali e adulti di Drosophila per l’imaging: 1) dissezioni cerebrali, 2) immunoistochimica e 3) montaggio. L’accento è posto sul passaggio 3, poiché sono necessari orientamenti di montaggio distinti per visualizzare specifiche strutture del lobo ottico.
Il lobo ottico di Drosophila , composto da quattro neuropili: la lamina, il midollo, la lobula e la placca della lobula, è un eccellente sistema modello per esplorare i meccanismi di sviluppo che generano la diversità neurale e l’assemblaggio dei circuiti di azionamento. Data la sua complessa organizzazione tridimensionale, l’analisi del lobo ottico richiede di capire come i suoi neuropili adulti e i progenitori larvali sono posizionati l’uno rispetto all’altro e al cervello centrale. Qui, descriviamo un protocollo per la dissezione, l’immunocolorazione e il montaggio di cervelli larvali e adulti per l’imaging del lobo ottico. Particolare enfasi è posta sulla relazione tra l’orientamento del montaggio e l’organizzazione spaziale del lobo ottico. Descriviamo tre strategie di montaggio nella larva (anteriore, posteriore e laterale) e tre nell’adulto (anteriore, posteriore e orizzontale), ognuna delle quali fornisce un angolo di imaging ideale per una struttura distinta del lobo ottico.
Il sistema visivo di Drosophila, composto dall’occhio composto e dal lobo ottico sottostante, è stato un modello eccellente per lo studio dello sviluppo e della funzione dei circuiti neurali. Negli ultimi anni, il lobo ottico, in particolare, è emerso come un potente sistema in cui studiare i processi di sviluppo neurologico come la neurogenesi e il cablaggio dei circuiti 1,2,3,4,5,6,7,8. È costituito da quattro neuropili: la lamina, il midollo, la lobula e la placca lobula (le ultime due comprendono il complesso della lobula)1,2,3,4,5,6. I fotorecettori dell’occhio, colpiscono i neuroni della lamina e del midollo, che elaborano gli input visivi e li trasmettono ai neuropili del complesso lobula 1,2,3,4,5,6. I neuroni di proiezione nel complesso lobula inviano successivamente informazioni visive ai centri di elaborazione di ordine superiore nel cervello centrale 1,5,9. La complessa organizzazione del lobo ottico, resa necessaria dalla necessità di mantenere la retinotopia e di elaborare diversi tipi di stimoli visivi, lo rende un sistema attraente per lo studio di come vengono assemblati sofisticati circuiti neurali. In particolare, il midollo condivide sorprendenti somiglianze sia nella sua organizzazione che nel suo sviluppo con la neuroretina, che è stata a lungo un modello per lo sviluppo del circuito neurale dei vertebrati 3,8.
Lo sviluppo del lobo ottico inizia durante l’embriogenesi, con la specificazione di ~35 cellule ectodermiche che formano il placode ottico 2,4,5,6,7,8. Dopo la schiusa larvale, il placode ottico è suddiviso in due primordi distinti: 1) il centro di proliferazione esterno (OPC), che genera i neuroni della lamina e del midollo esterno e 2) il centro di proliferazione interno (IPC), che genera i neuroni del midollo interno e del complesso lobula 4,5,6,10 . Nella larva del secondo stadio tardivo, le cellule neuroepiteliali dell’OPC e dell’IPC iniziano a trasformarsi in neuroblasti che successivamente generano neuroni attraverso cellule madri gangliari intermedie 4,5,11,12. I neuroblasti del lobo ottico sono modellati da fattori di trascrizione spazialmente e temporalmente limitati, che agiscono insieme per generare diversità neurale nella loro progenie 11,12,13,14. Nella pupa, i circuiti dei neuropili del lobo ottico sono assemblati attraverso il coordinamento di diversi processi, tra cui la morte cellulare programmata11,15, la migrazione neuronale12,16, il targeting assonale/dendritico10,17, la formazione delle sinapsi18,19 e le rotazioni dei neuropili10,17.
Qui, descriviamo la metodologia con cui i cervelli larvali e adulti vengono sezionati, immunocolorati e montati per l’imaging del lobo ottico. Data la sua complessa organizzazione tridimensionale, l’analisi del lobo ottico richiede di capire come i suoi neuropili adulti e i progenitori larvali sono posizionati l’uno rispetto all’altro e al cervello centrale. Pertanto, abbiamo posto particolare enfasi su come l’orientamento della montatura si relaziona all’organizzazione spaziale delle strutture dei lobi ottici. Descriviamo tre strategie di montaggio per i cervelli larvali (anteriore, posteriore e laterale) e tre per i cervelli adulti (anteriore, posteriore e orizzontale), ognuna delle quali fornisce un angolo ottimale per l’imaging di una specifica popolazione progenitrice del lobo ottico o neuropil.
1. Preparazione del cervello larvale per l’imaging confocale
2. Preparazione del cervello adulto per l’imaging confocale
In questo protocollo, descriviamo un metodo per immunocolorare il cervello larvale e adulto di Drosophila e montarlo in diversi orientamenti. Mentre i metodi per colorare il cervello larvale e adulto sono stati precedentemente descritti 22,23,24,27,28, le strategie di montaggio per la visualizzazione ottimale di specifiche strutture del lobo ottico hanno ricevuto meno attenzione 28. Si prevede che il protocollo qui descritto fornirà ai ricercatori una maggiore comprensione della relazione tra l’orientamento di montaggio e le strutture del lobo ottico visualizzate.
Oltre agli orientamenti descritti in questo protocollo, è possibile ottenere angoli alternativi di visualizzazione del lobo ottico adulto e larvale separando il lobo ottico dal cervello centrale. I lobi ottici possono essere separati dal cervello centrale usando forbici per insetti, pinze o un ago di tungsteno. Nell’adulto, questa può essere una strategia utile nei casi in cui la curvatura del cervello centrale inibisce il montaggio piatto dei lobi, con conseguente angolo irregolare durante l’imaging. Va notato che un lobo isolato sarà più difficile da montare senza i punti di riferimento forniti dal cervello centrale (ad esempio, lobi antennali, curvatura del cervello, ecc.) che vengono utilizzati per determinare l’orientamento di montaggio. Questa limitazione può essere superata analizzando i lobi ottici con un microscopio GFP a fluorescenza (se il cervello è colorato per il marcatore fluorescente appropriato) per garantire che l’orientamento desiderato sia raggiunto prima di aggiungere il vetrino coprioggetti. Allo stesso modo, nella larva, la rimozione di un lobo cerebrale dal lobo controlaterale attaccato e dal midollo nervoso ventrale, consente al cervello di essere montato in qualsiasi orientamento. Un microscopio GFP può essere utilizzato per determinare l’angolo di montaggio rispetto alle strutture del lobo ottico di interesse.
I cervelli possono anche essere visualizzati in più orientamenti rimuovendo il vetrino coprioggetti dopo l’imaging e rimontando il cervello. Per il rimontaggio, il ponte originale deve essere realizzato con argilla e lo smalto non deve essere applicato. Per riorientare il cervello, un paio di pinze possono essere inserite sotto il vetrino coprioggetti per rompere il sigillo. Una volta sollevato il vetrino coprioggetti, la maggior parte del cervello dovrebbe rimanere nel mezzo di montaggio. I cervelli possono quindi essere rimontati e un nuovo vetrino coprioggetti può essere posizionato sopra i cervelli. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata per visualizzare un singolo cervello in più orientamenti per costruire un’immagine tridimensionale ad alta risoluzione della morfologia di un neurone midollare17. Mentre il rimontaggio viene spesso eseguito con cervelli adulti, la tecnica può essere applicata anche ai cervelli larvali, il che richiederebbe anche la costruzione del ponte con l’argilla. È importante maneggiare con cura i campioni di cervello larvale durante la rimontatura perché la loro fragilità li rende più propensi a strapparsi quando il vetrino coprioggetti viene rimosso.
I protocolli sopra menzionati possono essere applicati anche al tessuto cerebrale pupale 10,22,24. Poiché i cervelli delle pupe subiscono rapidi cambiamenti morfogenici durante lo sviluppo, gli orientamenti di montaggio per le pupe precoci (0-30 h APF) assomigliano a quelli dei cervelli larvali, mentre le pupe in stadio medio-avanzato (>50 h APF) sono più vicine agli orientamenti di montaggio del cervello adulto. I cervelli pupali sono più fragili dei cervelli larvali e adulti e quindi richiedono cure extra quando vengono manipolati.
Infine, oltre al tessuto fissato e colorato, la comprensione degli orientamenti di montaggio del cervello è importante per le applicazioni di imaging dal vivo. I cervelli larvali e adulti possono essere coltivati e visualizzati in condizioni vive per seguire le divisioni cellulari e i cambiamenti nella morfologia e nell’attività neuronale nel tempo 24,27,29. In questo caso, l’orientamento di montaggio utilizzato è fondamentale, poiché la fluorescenza endogena più debole richiede che i tipi di cellule di interesse siano posizionati il più vicino possibile alla superficie del cervello per un rilevamento ottimale del segnale durante l’imaging.
The authors have nothing to disclose.
10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
37% formaldehyde | Bioshop | FOR201 | |
Alexa Fluor 488 (goat) secondary | Invitrogen | A-11055 | use at 1:500 |
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary | Invitrogen | A-31570 | use at 1:500 |
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary | Invitrogen | A-21450 | use at 1:500 |
Alexa Fluor 647 (rat) secondary | Invitrogen | A-21247 | use at 1:500 |
Cover slips | VWR | 48366-067 | |
Dissecting forceps – #5 | Dumont | 11251-10 | |
Dissecting forceps – #55 | Dumont | 11295-51 | |
Dissection Dish | Corning | 722085 | |
Dry wipes | Kimbery Clark | 34155 | |
Goat anti-Bgal primary antibody | Biogenesis | use at 1:1000 | |
Guinea pig anti-Bsh primary antibody | Gift from Claude Desplan | use at 1:500 | |
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody | Erclik et al. 2008 | use at 1:1000 | |
Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
Microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.600 | |
Microscope slides | VWR | CA4823-180 | |
Mouse anti-dac primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | mabdac2-3 | use at 1:20 |
Mouse anti-eya primary antibody | DSHB | eya10H6 | use at 1:20 |
Mouse anti-nc82 primary antibody | DSHB | nc82 | use at 1:50 |
Mouse anti-svp primary antibody | DSHB | Seven-up 2D3 | use at 1:100 |
Polymer Clay | Any type of clay can be used | ||
Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | use at 1:1000 |
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody | DSHB | DCAD2 | use at 1:20 |
Slowfade mounting medium | Invitrogen | S36967 | Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used |
Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |