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Summary

Questo protocollo descrive tre fasi per preparare i lobi ottici larvali e adulti di Drosophila per l’imaging: 1) dissezioni cerebrali, 2) immunoistochimica e 3) montaggio. L’accento è posto sul passaggio 3, poiché sono necessari orientamenti di montaggio distinti per visualizzare specifiche strutture del lobo ottico.

Abstract

Il lobo ottico di Drosophila , composto da quattro neuropili: la lamina, il midollo, la lobula e la placca della lobula, è un eccellente sistema modello per esplorare i meccanismi di sviluppo che generano la diversità neurale e l’assemblaggio dei circuiti di azionamento. Data la sua complessa organizzazione tridimensionale, l’analisi del lobo ottico richiede di capire come i suoi neuropili adulti e i progenitori larvali sono posizionati l’uno rispetto all’altro e al cervello centrale. Qui, descriviamo un protocollo per la dissezione, l’immunocolorazione e il montaggio di cervelli larvali e adulti per l’imaging del lobo ottico. Particolare enfasi è posta sulla relazione tra l’orientamento del montaggio e l’organizzazione spaziale del lobo ottico. Descriviamo tre strategie di montaggio nella larva (anteriore, posteriore e laterale) e tre nell’adulto (anteriore, posteriore e orizzontale), ognuna delle quali fornisce un angolo di imaging ideale per una struttura distinta del lobo ottico.

Introduction

Il sistema visivo di Drosophila, composto dall’occhio composto e dal lobo ottico sottostante, è stato un modello eccellente per lo studio dello sviluppo e della funzione dei circuiti neurali. Negli ultimi anni, il lobo ottico, in particolare, è emerso come un potente sistema in cui studiare i processi di sviluppo neurologico come la neurogenesi e il cablaggio dei circuiti 1,2,3,4,5,6,7,8. È costituito da quattro neuropili: la lamina, il midollo, la lobula e la placca lobula (le ultime due comprendono il complesso della lobula)1,2,3,4,5,6. I fotorecettori dell’occhio, colpiscono i neuroni della lamina e del midollo, che elaborano gli input visivi e li trasmettono ai neuropili del complesso lobula 1,2,3,4,5,6. I neuroni di proiezione nel complesso lobula inviano successivamente informazioni visive ai centri di elaborazione di ordine superiore nel cervello centrale ^1,5,9. La complessa organizzazione del lobo ottico, resa necessaria dalla necessità di mantenere la retinotopia e di elaborare diversi tipi di stimoli visivi, lo rende un sistema attraente per lo studio di come vengono assemblati sofisticati circuiti neurali. In particolare, il midollo condivide sorprendenti somiglianze sia nella sua organizzazione che nel suo sviluppo con la neuroretina, che è stata a lungo un modello per lo sviluppo del circuito neurale dei vertebrati ^3,8.

Lo sviluppo del lobo ottico inizia durante l’embriogenesi, con la specificazione di ~35 cellule ectodermiche che formano il placode ottico 2,4,5,6,7,8. Dopo la schiusa larvale, il placode ottico è suddiviso in due primordi distinti: 1) il centro di proliferazione esterno (OPC), che genera i neuroni della lamina e del midollo esterno e 2) il centro di proliferazione interno (IPC), che genera i neuroni del midollo interno e del complesso lobula 4,5,6,10 . Nella larva del secondo stadio tardivo, le cellule neuroepiteliali dell’OPC e dell’IPC iniziano a trasformarsi in neuroblasti che successivamente generano neuroni attraverso cellule madri gangliari intermedie 4,5,11,12. I neuroblasti del lobo ottico sono modellati da fattori di trascrizione spazialmente e temporalmente limitati, che agiscono insieme per generare diversità neurale nella loro progenie 11,12,13,14. Nella pupa, i circuiti dei neuropili del lobo ottico sono assemblati attraverso il coordinamento di diversi processi, tra cui la morte cellulare programmata^11,15, la migrazione neuronale^12,16, il targeting assonale/dendritico^10,17, la formazione delle sinapsi^18,19 e le rotazioni dei neuropili^10,17.

Qui, descriviamo la metodologia con cui i cervelli larvali e adulti vengono sezionati, immunocolorati e montati per l’imaging del lobo ottico. Data la sua complessa organizzazione tridimensionale, l’analisi del lobo ottico richiede di capire come i suoi neuropili adulti e i progenitori larvali sono posizionati l’uno rispetto all’altro e al cervello centrale. Pertanto, abbiamo posto particolare enfasi su come l’orientamento della montatura si relaziona all’organizzazione spaziale delle strutture dei lobi ottici. Descriviamo tre strategie di montaggio per i cervelli larvali (anteriore, posteriore e laterale) e tre per i cervelli adulti (anteriore, posteriore e orizzontale), ognuna delle quali fornisce un angolo ottimale per l’imaging di una specifica popolazione progenitrice del lobo ottico o neuropil.

Protocol

1. Preparazione del cervello larvale per l’imaging confocale

1. Dissezioni
   NOTA: Prima di iniziare la dissezione, preparare le soluzioni fix (4% di formaldeide in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)) e PBT (0,1-0,3% di tritone in PBS). La soluzione di fissaggio deve essere posta su ghiaccio durante la dissezione. Sebbene in questo protocollo venga utilizzato il fissativo della paraformaldeide (PFA), sono state descritte strategie di fissazione alternative (utilizzando PLP²⁰ o PEM²¹) per epitopi specifici. Per le dissezioni larvali, sono necessarie due paia di pinze (Dumont #5 o #55s). Per ulteriori dettagli, vedere la tabella dei materiali.
   1. Iniziare riempiendo ogni pozzetto della piastra di dissezione con 400 μl di 1x PBS. Usa un paio di pinze per raccogliere delicatamente le larve vaganti del terzo stadio che strisciano all’interno della fiala. Mettere le larve nel primo pozzetto del piatto pieno di PBS.
   2. Prendi una larva e trasferiscila nel pozzo centrale. Usando la mano non dominante, tieni il corpo della larva alla base del pozzo.
   3. Con la mano dominante, afferrare delicatamente il gancio larvale per la bocca e allontanarlo dal corpo. Il cervello larvale dovrebbe essere attaccato al gancio della bocca e ad altri tessuti accessori e si staccherà quando il tessuto viene tirato via.
   4. Rimuovere i dischi immaginali accessori e trasferire il cervello larvale nel terzo pozzetto della capsula di dissezione. I dischi immaginali sono tessuti epiteliali che circondano il cervello larvale, che generano strutture adulte come le antenne, gli occhi, le zampe e le ali²⁰. Se lasciati sul tessuto, i dischi immaginali possono ostruire la corretta immunocolorazione del cervello larvale.
      1. Per rimuovere i dischi immaginali, utilizzare un paio di pinze per afferrare saldamente il cervello attraverso il cordone nervoso ventrale. Usando un altro paio di pinze, strappa delicatamente i dischi.
      2. Rimuovere il disco oculare con attenzione, poiché avvolge la superficie dei lobi cerebrali. Per rimuovere il disco oculare, usa un paio di pinze per tenere il cervello contro la base del piatto. Invece di tenere il cervello attraverso il cordone nervoso ventrale, usa la pinza per afferrare leggermente il lobo del cervello facendo attenzione a non schiacciare il lobo. Usando un altro paio di pinze, tirare via delicatamente il disco oculare.
         NOTA: Il disco immaginale dell’occhio alla fine darà origine ai fotorecettori della retina. Per coloro che sono interessati a studiare la connettività neurale tra la retina e il lobo ottico, il disco oculare può essere lasciato sul cervello. Tuttavia, per coloro che sono interessati esclusivamente alle strutture del lobo ottico, si consiglia di rimuovere il disco oculare in quanto potrebbe ostacolare la qualità dell’immagine a causa della sua posizione sulla superficie del cervello.
   5. Ripetere i passaggi 1.1.2-1.4 fino a quando non è stato raccolto un numero sufficiente di cervelli (o sono trascorsi 30 minuti di tempo di dissezione). Le dissezioni non devono durare più di 30 minuti per garantire che l’integrità del tessuto non sia compromessa.
   6. Una volta terminato il periodo di dissezione, utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con cura il PBS dal terzo pozzetto. Assicurarsi che rimanga un piccolo volume di liquido nel pozzetto per mantenere il cervello immerso.
      NOTA: È fondamentale mantenere il cervello immerso nel liquido in tutti i punti del protocollo. Se il tessuto si asciuga, la qualità della macchia può essere compromessa da un’autofluorescenza indesiderata nell’immagine confocale.
   7. Aggiungere 500 μl della soluzione di fissaggio a freddo nel terzo pozzetto. Usa un paio di pinze per mescolare delicatamente il liquido, permettendo al cervello di vorticare nel piatto. Coprire il piatto con un vetrino e metterlo sul ghiaccio per 30 minuti per consentire il fissaggio dei tessuti.
   8. Rimuovere la soluzione di fissazione e lavare il cervello con 400 μL di PBT, 5 volte.
      NOTA: Triton è un detergente in PBT che impedisce al cervello di attaccarsi l’uno all’altro o al piatto e prepara il tessuto per una penetrazione ottimale degli anticorpi.
2. Immunoistochimica
   NOTA: La Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) dispone di diversi anticorpi primari che possono essere utilizzati per marcare specifiche strutture del lobo ottico o tipi di cellule. La DE-caderina marcava i neuroepiteli IPC e OPC, Bruchpilot (Brp) marcava i neuropili in via di sviluppo e il bassotto marcava i neuroni della lamina e della lobula (così come un piccolo sottoinsieme di neuroni del midollo). Inoltre, Elav può essere utilizzato per marcare i neuroni, Prospero per marcare le cellule madri gangliari e Repo per identificare la glia.
   1. Preparare la soluzione di anticorpi primari aggiungendo anticorpi al PBT fino a un volume totale di 100 μl. Un agente bloccante (10% di siero di capra normale) può essere utilizzato per prevenire il legame non specifico tra l’anticorpo primario e il tessuto 20,22,23. Gli anticorpi utilizzati in questo protocollo marcano specificamente il tessuto cerebrale senza la necessità di agenti bloccanti.
   2. Rimuovere il lavaggio finale post-fissazione e aggiungere la soluzione di anticorpi primari. Assicurarsi che ci sia solo una piccola quantità di PBT nel pozzetto prima di aggiungere la soluzione anticorpale. Dopo aver aggiunto la soluzione, mescola delicatamente il cervello con una pinza 5-10 volte. Coprire con un vetrino, sigillare con pellicola di laboratorio e incubare a 4 °C per una notte.
      1. In alternativa, se è disponibile un agitatore orbitale refrigerato, posizionare la capsula sull’agitatore per ottimizzare l’incubazione notturna.
         NOTA: L’incubazione degli anticorpi primari e tutte le fasi successive possono essere eseguite in alternativa in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Il volume delle incubazioni primarie e secondarie può rimanere di 100 μL, ma le fasi di lavaggio devono essere eseguite con 800 μL o più di PBT.
   3. Dopo l’incubazione, eliminare gli anticorpi primari con PBT come al punto 1.1.8 del paragrafo precedente.
      NOTA: La soluzione di anticorpi primari deve essere conservata e conservata a 4 °C in quanto può essere riutilizzata per esperimenti successivi. Molti anticorpi primari possono essere riutilizzati fino a quattro volte.
   4. Aggiungere 400 μl di PBT al cervello per un lavaggio finale. Coprire la capsula con un vetrino, sigillare con pellicola da laboratorio e posizionarla su un agitatore orbitale a bassa velocità (100 giri/min) e temperatura ambiente (RT) per ~4 h.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il cervello può essere lasciato in lavaggio per 2-3 giorni a 4 °C.
   5. Preparare la soluzione di anticorpi secondari in un volume totale di 100 μl.
      NOTA: In questo protocollo, tutti gli anticorpi secondari vengono utilizzati a una diluizione di 1:500, senza agenti bloccanti.
   6. Rimuovere il lavaggio PBT dal pozzetto e aggiungere la soluzione di anticorpi secondari. Mescolare il tessuto nella soluzione usando un paio di pinze. Coprire il piatto con un vetrino e una pellicola da laboratorio. Posizionare la capsula su un agitatore orbitale a RT per un periodo di incubazione minimo di 2 ore. Poiché gli anticorpi secondari contengono fluorofori sensibili alla luce, coprire il piatto con un foglio di alluminio.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il cervello può essere lasciato in soluzione di anticorpi secondari per una notte a 4 °C.
   7. Eliminare gli anticorpi secondari come descritto al punto 1.2.3. Aggiungere 400 μl di PBT al cervello per un lavaggio finale. Coprire il piatto con un vetrino, sigillare con pellicola da laboratorio e pellicola. Posizionare i cervelli su uno shaker a RT per 4 ore.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il cervello può essere lasciato in lavaggio per 2-3 giorni a 4 °C.
3. Montante
   1. Rimuovere il lavaggio PBT finale e sostituirlo con due gocce di terreno di montaggio sicuro per la fluorescenza. Posizionare una goccia del supporto di montaggio al centro di una diapositiva.
   2. Trasferire i cervelli dal pozzo alla goccia sul vetrino usando una pinza. Per evitare di danneggiare i lobi ottici, il cervello può essere trattenuto dal cordone nervoso ventrale durante il trasferimento sul vetrino.
   3. Monta i cervelli secondo le strategie di montaggio che seguono (Figura 1A).
      1. Lato anteriore rivolto verso l’alto
         NOTA: Per coloro che sono interessati a visualizzare il midollo anteriore, la lamina o il tappo della lobula, questo orientamento di montaggio è l’ideale. Il modo migliore per distinguere le montature anteriori da quelle posteriori è esaminare la posizione del cordone nervoso ventrale rispetto ai lobi cerebrali.
         1. Utilizzare l’orientamento anteriore per osservare il cordone nervoso ventrale che sporge sopra i lobi (Figura 1B).
      2. Lato posteriore rivolto verso l’alto
         NOTA: Questo orientamento è consigliato a coloro che sono interessati a visualizzare le punte posteriori dell’OPC (pOPC) o IPC ^10,11.
         1. Utilizzare l’orientamento posteriore per visualizzare il cordone nervoso ventrale che sporge da sotto i lobi cerebrali (Figura 1C).
      3. Vista laterale
         NOTA: Un orientamento di montaggio laterale viene utilizzato per visualizzare la mezzaluna dei neuroni della lamina, del midollo o della lobula in entrambi gli assi dorso-ventrale e antero-posteriore su un unico piano (Figura 1G).
         1. Per un montaggio laterale, dividi i lobi cerebrali l’uno dall’altro in modo che cadano su un lato, con la lamina e il tappo della lobula rivolti verso l’alto.
         2. Usando due paia di pinze affilate, dividi a metà il cordone nervoso ventrale, partendo dal punto in cui il cordone si attacca ai lobi. Si noti che i due lobi sono già separati l’uno dall’altro, con il cordone nervoso ventrale che li tiene intatti. Quindi, dividere il cordone nervoso ventrale dal punto di scissione tra i lobi, per separarli. Quindi capovolgere ciascun lobo cerebrale e il cordone nervoso ventrale attaccato sui lati con le superfici laterali rivolte verso l’alto.
            NOTA: Per il supporto della vista laterale, si consiglia di utilizzare un ago di tungsteno con una punta sottile per orientare il lobo cerebrale su un lato. Per visualizzare chiaramente l’orientamento dei lobi e la direzione del cordone nervoso ventrale durante il montaggio, è possibile regolare l’illuminazione del microscopio. Se si utilizza una sorgente luminosa a LED a collo d’oca, i colli d’oca devono essere posizionati parallelamente alla superficie dello scivolo per una chiara visibilità. Inoltre, l’intensità dell’illuminazione può essere aumentata o diminuita per migliorare il contrasto tra le strutture cerebrali e fornire chiarezza durante il montaggio.
   4. Posizionare una piccola goccia di PBS su entrambi i lati del supporto di montaggio contenente il cervello. Metti un vetrino coprioggetti su ogni goccia e un ultimo vetrino coprioggetti sul cervello. I bordi destro e sinistro del vetrino coprioggetti superiore devono poggiare sugli altri due vetrini coprioggetti (Figura 1A).
      NOTA: Prima di posizionare un vetrino coprioggetti sul cervello, è necessario costruire un ponte. I cervelli larvali hanno uno spessore di circa 200 μm e quindi, per mantenere l’integrità del tessuto, viene creato un ponte che aumenta la distanza tra il vetrino coprioggetti e la superficie del vetrino.
   5. Sigillare i bordi del ponte con smalto per unghie per fissare i cervelli montati.
   6. Visualizzare il cervello utilizzando la microscopia confocale.

2. Preparazione del cervello adulto per l’imaging confocale

1. Dissezioni
   NOTA: Le dissezioni cerebrali adulte sono più impegnative di quelle larvali e richiedono un’attenta manipolazione. Si consiglia vivamente di utilizzare almeno un paio di pinze ultrasottili (Dumont #55) per questa parte del protocollo.
   1. Anestetizzare le mosche con CO₂, usando un ago o un flypad, e posizionarle su una salvietta da laboratorio o un tovagliolo di carta sul ghiaccio (per mantenerle anestetizzate).
   2. Aggiungere 400 μl di PBS a tutti e tre i pozzetti del piatto di vetro. Usa un paio di pinze per afferrare delicatamente una mosca adulta per le ali e posizionarla nel primo pozzetto del piatto.
   3. Usa un paio di pinze tenute nella mano non dominante per tenere il torace della mosca contro la base del pozzo. Con la mano dominante, staccare delicatamente la testa dal resto del corpo.
   4. Trasferire la testa nel secondo pozzetto. Spesso, la testa galleggia nel PBS e può essere difficile da maneggiare. Usa un paio di pinze per tenerlo premuto contro la base del pozzo vicino alla proboscide.
   5. Staccare una parte della cuticola tra gli occhi usando entrambe le pinze. Poiché il cervello si trova proprio sotto la cuticola, sii il più delicato possibile per evitare di danneggiare il tessuto sottostante. Continua a staccare la cuticola un pezzo alla volta, fino a quando il cervello non è esposto. Rimuovere qualsiasi tessuto accessorio (ad esempio, retina, trachea, sacche d’aria) che potrebbe rimanere attaccato al cervello.
      NOTA: La rimozione della retina è stata descritta nei precedenti protocolli^22,24, ma la lamina può anche essere separata dal resto del lobo ottico. Questo è utile per coloro che desiderano studiare il complesso del midollo o della lobula, poiché la lamina si trova in superficie e può ostruire la visualizzazione di questi altri neuropils del lobo ottico durante l’imaging. Per rimuovere la lamina, utilizzare un paio di pinze affilate per tirare delicatamente la rientranza tra la lamina e i neuropili del midollo. La lamina inizierà lentamente a staccarsi dal midollo. Ripeti questo movimento fino a rimuovere l’intera lamina. Durante questo processo è importante mantenere una presa salda del cervello. Usa un altro paio di pinze per tenere il cervello contro la base del piatto posizionandolo in modo che la parte superiore e inferiore del cervello centrale si adattino perfettamente tra le punte delle pinze. Una presa salda intorno al cervello centrale eviterà danni indesiderati al lobo ottico.
   6. Trasferisci il cervello pulito nel terzo pozzo. Ripetere i passaggi 2.1.2-1.6 fino a quando non si ottiene un numero sufficiente di cervelli o non è trascorso un periodo massimo di dissezione di 30 minuti.
   7. Rimuovere il PBS nel terzo pozzetto e aggiungere 500 μL di soluzione fissa. Assicurarsi che il cervello non si secchi qui o durante le fasi di lavaggio, poiché ciò porterà alla fluorescenza di fondo nelle immagini confocali. Coprire il piatto con un vetrino e lasciare che il cervello incubi in fix per 20 minuti a RT.
   8. Dopo la fissazione, lavare il cervello con 400 μL di PBT, 5 volte.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I cervelli possono essere coperti con un vetrino e una pellicola di laboratorio e lasciati in lavaggio per 2-3 giorni a 4 °C. Per i ricercatori nuovi al sistema, potrebbe essere più facile lasciare il tessuto accessorio sul cervello prima e durante la fissazione. Ciò consentirà ai ricercatori di massimizzare il numero di campioni cerebrali ottenuti in un determinato periodo di dissezione. Dopo che il tessuto è stato fissato e lavato, il cervello può essere accuratamente pulito prima di aggiungere la soluzione di anticorpi primari. I cervelli adulti con tessuto accessorio tendono a galleggiare e quindi rischiano di seccarsi. Di conseguenza, si consiglia di utilizzare un paio di pinze per raggruppare accuratamente tutti i cervelli al centro del piatto dopo l’aggiunta della soluzione fissa e di pulire i cervelli immediatamente dopo la fissazione.
2. Immunoistochimica
   1. Eseguire l’immunoistochimica come descritto per il cervello larvale nel paragrafo 1.2.
   2. Gli anticorpi primari utili del DSHB includono quelli menzionati nel protocollo di immunoistochimica larvale nella sezione 1.2. Vedere la Tabella dei materiali per un elenco completo degli anticorpi e delle diluizioni corrispondenti.
      NOTA: È necessario prestare particolare attenzione durante le fasi di lavaggio per i cervelli adulti, poiché potrebbero galleggiare sulla superficie della soluzione di lavaggio e rischiare di seccarsi sui lati del pozzetto quando la soluzione viene rimossa (il che porterà alla fluorescenza di fondo). Una buona pratica è quella di tenere la pipetta in una mano per aggiungere o prelevare il liquido e un paio di pinze nell’altra per mantenere il cervello sommerso.
3. Montante
   1. Prima della fase di montaggio, eseguire un lavaggio finale con PBS (anziché PBT). La PBS fa sì che il cervello diventi leggermente appiccicoso, il che consente loro di rimanere nell’orientamento desiderato durante il montaggio.
   2. Rimuovere il lavaggio finale e sostituirlo con tre gocce di terreno di montaggio sicuro per la fluorescenza. Posizionare una goccia del supporto di montaggio al centro di un vetrino da microscopio.
   3. Trasferire i cervelli dal pozzo alla goccia sul vetrino usando una pinza. Per evitare di danneggiare i lobi ottici e prevenire l’essiccazione del tessuto, recuperare con cura un cervello attraverso l’azione capillare. Chiudi lentamente un paio di pinze attorno a un cervello fino a quando un piccolo volume di liquido contenente il cervello viene aspirato tra le punte.
      NOTA: Quando si trasferisce il cervello sul vetrino, fare attenzione a non chiudere la pinza in quanto ciò danneggerebbe il cervello. In alternativa, è possibile utilizzare una pipetta P200 per trasferire il cervello. Tagliare l’estremità della punta per allargare l’apertura e pre-risciacquare con PBT per evitare che il cervello si attacchi all’interno della punta.
   4. Monta i cervelli secondo le seguenti strategie (Figura 2A).
      1. Lato anteriore rivolto verso l’alto
         NOTA: Per visualizzare i neuroni della lamina e del midollo, orientare il cervello con il lato anteriore rivolto verso l’alto (Figura 2B). Ciò può essere ottenuto esaminando l’anatomia e la curvatura dei lobi antennali centrali.
         1. Con un paio di pinze, gira delicatamente il cervello su un lato per esaminare sia il lato anteriore che quello posteriore. Si osservi che sul lato anteriore, la curvatura del cervello è pronunciata e i lobi antennali sporgono leggermente verso l’esterno dal centro.
      2. Lato posteriore rivolto verso l’alto
         1. Posizionare il cervello con il lato posteriore (piatto) rivolto verso l’alto e i lobi antennali rivolti verso il basso (Figura 2C).
            NOTA: Questo avvicinerà la lobula e la piastra della lobula alla superficie di imaging ed è l’ideale per coloro che sono interessati a visualizzare i neuroni del complesso della lobula.
      3. Vista orizzontale
         NOTA: Per visualizzare contemporaneamente tutti i neuropils del lobo ottico, utilizzare una strategia di montaggio orizzontale (Figura 2G). In questo orientamento, i corpi cellulari neuronali, le traiettorie assonali e le arborizzazioni dendritiche possono essere visualizzati sullo stesso piano.
         1. Inizialmente, orientare il cervello con il lato anteriore rivolto verso l’alto. Con un ago di tungsteno, inclina delicatamente il cervello di 90° verso l’alto in modo che si sieda sul lato dorsale con i lobi antennali rivolti verso l’esterno. Verificare che sia il lato anteriore che quello posteriore del cervello siano visibili in questo orientamento.
   5. Invece di un ponte di copertura, usa l’argilla per sollevare il vetrino coprioggetti dallo scivolo. L’uso dell’argilla consente il rimontaggio del cervello dopo l’imaging (descritto nella sezione di discussione).
      1. Metti un pezzetto di argilla su ogni angolo di un vetrino coprioggetti. Assicurati che ogni pezzo di argilla abbia relativamente lo stesso spessore. I pezzi di argilla dovrebbero avere uno spessore compreso tra 0,5 e 1 mm. Posiziona delicatamente il vetrino coprioggetti sul cervello e applica una leggera pressione sugli angoli. Il vetrino coprioggetti dovrebbe catturare immediatamente il liquido e formare un sigillo. Il vetrino è ora pronto per l’imaging.
         NOTA: Per la conservazione a lungo termine del vetrino, si consiglia di sigillare il vetrino coprioggetto con smalto per unghie e di conservarlo a 4 °C al riparo dalla luce.

Representative Results

Discussion

In questo protocollo, descriviamo un metodo per immunocolorare il cervello larvale e adulto di Drosophila e montarlo in diversi orientamenti. Mentre i metodi per colorare il cervello larvale e adulto sono stati precedentemente descritti 22,23,24,27,28, le strategie di montaggio per la visualizzazione ottimale di specifiche strutture del lobo ottico hanno ricevuto meno attenzione ²⁸. Si prevede che il protocollo qui descritto fornirà ai ricercatori una maggiore comprensione della relazione tra l’orientamento di montaggio e le strutture del lobo ottico visualizzate.

Oltre agli orientamenti descritti in questo protocollo, è possibile ottenere angoli alternativi di visualizzazione del lobo ottico adulto e larvale separando il lobo ottico dal cervello centrale. I lobi ottici possono essere separati dal cervello centrale usando forbici per insetti, pinze o un ago di tungsteno. Nell’adulto, questa può essere una strategia utile nei casi in cui la curvatura del cervello centrale inibisce il montaggio piatto dei lobi, con conseguente angolo irregolare durante l’imaging. Va notato che un lobo isolato sarà più difficile da montare senza i punti di riferimento forniti dal cervello centrale (ad esempio, lobi antennali, curvatura del cervello, ecc.) che vengono utilizzati per determinare l’orientamento di montaggio. Questa limitazione può essere superata analizzando i lobi ottici con un microscopio GFP a fluorescenza (se il cervello è colorato per il marcatore fluorescente appropriato) per garantire che l’orientamento desiderato sia raggiunto prima di aggiungere il vetrino coprioggetti. Allo stesso modo, nella larva, la rimozione di un lobo cerebrale dal lobo controlaterale attaccato e dal midollo nervoso ventrale, consente al cervello di essere montato in qualsiasi orientamento. Un microscopio GFP può essere utilizzato per determinare l’angolo di montaggio rispetto alle strutture del lobo ottico di interesse.

I cervelli possono anche essere visualizzati in più orientamenti rimuovendo il vetrino coprioggetti dopo l’imaging e rimontando il cervello. Per il rimontaggio, il ponte originale deve essere realizzato con argilla e lo smalto non deve essere applicato. Per riorientare il cervello, un paio di pinze possono essere inserite sotto il vetrino coprioggetti per rompere il sigillo. Una volta sollevato il vetrino coprioggetti, la maggior parte del cervello dovrebbe rimanere nel mezzo di montaggio. I cervelli possono quindi essere rimontati e un nuovo vetrino coprioggetti può essere posizionato sopra i cervelli. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata per visualizzare un singolo cervello in più orientamenti per costruire un’immagine tridimensionale ad alta risoluzione della morfologia di un neurone midollare¹⁷. Mentre il rimontaggio viene spesso eseguito con cervelli adulti, la tecnica può essere applicata anche ai cervelli larvali, il che richiederebbe anche la costruzione del ponte con l’argilla. È importante maneggiare con cura i campioni di cervello larvale durante la rimontatura perché la loro fragilità li rende più propensi a strapparsi quando il vetrino coprioggetti viene rimosso.

I protocolli sopra menzionati possono essere applicati anche al tessuto cerebrale pupale 10,22,24. Poiché i cervelli delle pupe subiscono rapidi cambiamenti morfogenici durante lo sviluppo, gli orientamenti di montaggio per le pupe precoci (0-30 h APF) assomigliano a quelli dei cervelli larvali, mentre le pupe in stadio medio-avanzato (>50 h APF) sono più vicine agli orientamenti di montaggio del cervello adulto. I cervelli pupali sono più fragili dei cervelli larvali e adulti e quindi richiedono cure extra quando vengono manipolati.

Infine, oltre al tessuto fissato e colorato, la comprensione degli orientamenti di montaggio del cervello è importante per le applicazioni di imaging dal vivo. I cervelli larvali e adulti possono essere coltivati e visualizzati in condizioni vive per seguire le divisioni cellulari e i cambiamenti nella morfologia e nell’attività neuronale nel tempo 24,27,29. In questo caso, l’orientamento di montaggio utilizzato è fondamentale, poiché la fluorescenza endogena più debole richiede che i tipi di cellule di interesse siano posizionati il più vicino possibile alla superficie del cervello per un rilevamento ottimale del segnale durante l’imaging.

Materials

10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps – #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps – #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506