Un sistema di bioreattore di stimolazione meccanica uniassiale tridimensionale è un bioreattore ideale per la differenziazione tenogenica-specifica delle cellule staminali derivate dal tendine e della formazione neo-tendina.
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Articolo metodologico
Applicazione di un sistema di bioreattore tridimensionale di stimolazione meccanica uniassiale per indurre la differenziazione tenogena delle cellule staminali derivate da Tendon
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tendinopatia è una comune malattia cronica del tendine a cui si tratta di infiammazione e degenerazione in un'area ortopedica. Con un'elevata morbilità, una limitata capacità di auto-riparazione e, soprattutto, senza trattamenti definitivi, la tendinopatia influenza ancora negativamente la qualità della vita dei pazienti. Le cellule staminali derivate dal tendone (TDSC), come cellule precursori primarie delle cellule tendisuotiche, svolgono un ruolo essenziale sia nello sviluppo della tendinopatia, sia nel ripristino funzionale e strutturale dopo la tendinopatia. Pertanto, sarebbe utile un metodo che può in vitro imitare la differenziazione in vivo dei TDSC nelle cellule tendinee. Qui, il presente protocollo descrive un metodo basato su un sistema di stretching uniaxial tridimensionale (3D) per stimolare i TDSC a differenziarsi in tessuti simili a quelli tendoni. Ci sono sette stadi del protocollo attuale: isolamento dei topi TDSC, coltura ed espansione dei topi TDSC, preparazione del mezzo di coltura della stimolazione per la formazione di lamiere cellulari, formazione di lamiere cellulari mediante stimolazione in media, preparazione del costrutto di cellule staminali del tendine 3D, assemblaggio del complesso di stimolazione meccanica che si estende uniaxial e valutazione del tessuto tendineo stimolato meccanicamente stimolato in vitro. L'efficacia è stata dimostrata dall'istologia. L'intera procedura richiede meno di 3 settimane. Per promuovere la deposizione di matrici extracellulari, è stato utilizzato 4,4 mg/mL di acido ascorbico nel mezzo di coltura della stimolazione. Una camera separata con un motore lineare fornisce un carico meccanico accurato ed è portatile e facilmente regolabile, che viene applicato per il bioreattore. Il regime di carico nel protocollo attuale era di 4%, 0,25 Hz, 8 h, seguito da 16 h resto per 6 giorni. Questo protocollo potrebbe imitare la differenziazione cellulare nel tendine, che è utile per lo studio del processo patologico di tendinopatia. Inoltre, il tessuto tendineo è potenzialmente utilizzato per promuovere la guarigione del tendine in lesioni tendinee come un innesto autologo ingegnerizzato. Per riassumere, l'attuale protocollo è semplice, economico, riproducibile e valido.
Introduzione
La tendinopatia è una delle lesioni sportive comuni. Si manifesta principalmente da dolore, gonfiore locale, diminuzione della tensione muscolare nella zona interessata, e disfunzione. L'incidenza della tendinopatia è elevata. La presenza di achille tendinopatia è più comune per i corridori di media e lunga distanza (fino al 29%), mentre la presenza di tendinopatia rotutare è anche alta negli atleti di pallavolo (45%), basket (32%), atletica leggera (23%), pallamano (15%) e calcio (13%)1 ,2,,,3,4. Tuttavia,....
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Protocollo
I metodi descritti sono stati approvati ed eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti del Comitato Etico Animale dell'Università dell'Australia Occidentale.
1. Isolamento dei topi TDSC
- Eutanasia i topi C57BL/6 di 6-8 settimane da lussazione cervicale.
- Tendini rotulare di raccolta24 e tendini di Achille25.
- Tendini digerivi da uno con 6 mL di collagenasi di tipo I (3 mg/mL) per 3 h.
NOTA: Poiché la dimensione del tendine nel mouse è piccola, tutti i tendini raccolti da un topo devono essere utilizzati in questo passaggio. - Raccogliere le c....
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Risultati
Prima della stimolazione meccanica, i TDSC erano cresciuti al 100% di confluenza in mezzo completo e mostravano una morfologia ultrastrutturale disorganizzata (Figura 2A). Dopo 6 giorni di carico meccanico di stretching uniassiale, matrice extracellulare (ECM) e allineamenti cellulari erano ben orientati (Figura 2B). Le celle erano ben popolate e ben avvolte in ECM dopo il caricamento meccanico. La morfologia cellulare è stata presentata per essere allungata ed era più simile alla normal.......
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Discussione
Il tendine è un tessuto connettivo fibroso meccanosensibile. Secondo precedenti ricerche, l'eccesso di carico meccanico potrebbe portare a differenziazione osteogenica delle cellule staminali del tendine, mentre un carico insufficiente porterebbe a una struttura disordinata della fibra di collagene durante la differenziazione del tendine21.
Una visione comune è che la chiave per un bioreattore ideale è la capacità di simulare il microambiente cellulare in vitro a cui su.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La ricerca è stata condotta mentre l'autore stava ricevimentando "una borsa di studio della University of Western Australia International Fee e un premio post-laurea dell'Università dell'Australia Occidentale". Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81802214).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido ascorbico | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibcoä di Life Technologies | 1908361 | |
| Istologia processore | Leica | TP 1020 | |
| Medium essenziale minimo (Alpha-MEM) | Gibcoä di Life Technologies | 2003802 | |
| Cellula | staminale derivata dal tendine di topoIsolato dai tendini d'Achille di topi C57BL/6 di 6-8 settimane. Quindi digerito con collagenasi di tipo I (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) per 3 ore e passata attraverso un filtro da 70 mmcell per produrre sospensioni a singola cellula. | ||
| Paraformaldeide | Sigma-aldrich | 441244 | |
| Miscela di streptomicina e penicillina | Gibcoä di Life Technologies | 15140122 | |
| Sistema di bioreattore di stimolazione meccanica uniassiale tridimensionale | Centro di ricerca traslazionale ortopedica, Medical School, University of Western Australia | Disponibile presso l'autore corrispondente su richiesta. Oppure realizzalo secondo il nostro design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. La stimolazione meccanica programmabile influenza l'omeostasi tendinea in un sistema di bioreattori. Biotechnol Bioeng. 2013; 110(5):1495-1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
| Tripsina | Gibcoä di Life Technologies | 1858331 |
Riferimenti
- Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
- Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J.
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Ristampe e permessi
