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Articolo metodologico

Cristallografia a raggi X per studiare la transizione di stato oligomerica della termotoga maritima M42 Aminopeptidasi TmPep1050

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DOI:

10.3791/61288

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13 maggio 2020

 ,  ,  , 
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology, Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050, un'amminopeptidasi M42, a livello strutturale. È una pipeline semplice che parte dalla purificazione delle proteine all'elaborazione dei dati a raggi X. La cristallogenesi, l'indicizzazione del set di dati e la sostituzione molecolare sono state enfatizzate attraverso un caso di studio, variante TmPep1050H60A H307A.

Abstract

Le amminopeptidasi M42 formano complessi funzionalmente attivi fatti di 12 subunità. Il loro processo di assemblaggio sembra essere regolato dai loro cofattori ionici metallici che innescano una transizione dimero-dodecamero. Al momento del legame ionici metallici, si verificano diverse modifiche strutturali nel sito attivo e nell'interfaccia di interazione, modellando i dimeri per promuovere l'auto-assemblaggio. Per osservare tali modifiche, gli oligomeri stabili devono essere isolati prima dello studio strutturale. Qui riportato è un metodo che consente la purificazione di dodecamer stabili e dimeri di TmPep1050, un amminopeptidasi M42 di T. maritimae la loro determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X. I dimeri venivano preparati da dodecamer rimuovendo ioni metallici con un agente chelatante. Senza il loro cofattore, i dodecamer divennero meno stabili e furono completamente dissociati al riscaldamento. Le strutture oligomeriche sono state risolte con il semplice approccio di sostituzione molecolare. Per illustrare la metodologia, viene presentata la struttura di una variante TmPep1050, totalmente compromessa nel legame ionici metallici, che non mostra ulteriori dimeri in monomeri.

Introduzione

L'oligomerizzazione è un processo predominante che detta le funzioni biologiche di molte proteine. In Escherichia coli, si stima che solo il 35% delle proteine siano monomeriche1. Alcune proteine, chiamate morfeeine, possono anche adottare diversi stati oligomerici con subunità aventi una struttura distinta in ogni stato oligomerico2. La transizione tra i loro stati oligomerici è spesso una media per regolare l'attività proteica in quanto ogni stato oligomerico può avere un'attività o una funzione specifica diversa. Diversi esempi di morfeeine sono stati ben documentati in letteratura, in particolare il porfobilinogeno sintasi3, HPr chinasi/fosfatasi4, Lon proteasi5, lattato deidrogenasi6, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi7, piruvato chinasi8, citrato sintasi9e ribonucleasi A10. Recentemente, abbiamo descritto l'amminopeptidasi M42 TmPep1050, un altro esempio di enzima con comportamento simile alla morfeina, la cui attività dipende dai suoi stati oligomerici11. La transizione tra i suoi stati oligomerici è mediata dai suoi cofattori metallici che inducono diverse modifiche strutturali delle subunità.

La famiglia M42 aminopeptidasi appartiene al clan MH12,13,ed è ampiamente distribuita tra Batteri e Archaea14. Le amminopeptidasi M42 sono veri enzimi dinucleari che degradano peptidi fino a 35 residui di amminoacidi inlunghezza 15. Adottano una particolare struttura a forma di tetraedro composta da 12 subunità con i loro siti attivi orientati verso una cavità interna. Tale disposizione è spesso descritta come una nano-compartimentazione dell'attività per evitare la proteolisi incontrollata. La funzione fisiologica delle amminopeptidasi M42 può essere associata al proteasome, peptidi idrolizzando risultanti dalla degradazione proteica16,17. Pyrococcus horikoshii possiede quattro aminopeptidasi M42, ognuna delle quali presenta specifiche distinte ma complementari18,19,20,21. Singolarmente, eterocomplessi fatti di due diversi tipi di subunità sono stati descritti in P. horikoshii, suggerendo l'esistenza di complessi peptidasomei22,23.

Diverse strutture di M42 aminopeptidasi sono state descritte nellaletteratura 11,16,18,19,20,24,25,26. La subunità è composta da due domini distinti, un dominio catalitico e un dominio di dimerizzazione. Il dominio catalitico adotta una comune piega α/β conservata in tutto il clan MH, il dominio catalitico archetipico è l'amminopeptidasi Ap1 di Vibrio proteolyticus27. Il dominio di dimerizzazione adotta una piega16 simile a PDZ e può avere, oltre al suo ruolo nell'oligomerizzazione, un ruolo nel controllo dell'accesso al substrato e del legame nella cavitàinterna 11. Poiché l'elemento costitutivo di base è un dimero, il dodecamero è spesso descritto come l'associazione di sei dimeri, ognuno dei quali è posizionato ad ogni bordo del tetraedro16. L'oligomerizzazione delle aminopeptidasi M42 si basa sulla disponibilità dei suoi cofattori metallici. Gli ioni metallici divalenti, spesso Zn2+ e Co2+,sono cataliticamente coinvolti nel legame peptidico e nell'idrolisi. Si trovano in due siti di binding distinti, vale a dire siti M1 e M2. I due ioni metallici guidano e ottimizzano finemente l'oligomerizzazione come dimostrato per PhTET2, PhTET3, PfTET3 e TmPep105011,24,28,29. Quando i cofattori metallici sono esauriti, il dodecamero si smonta in dimeri, come in PhTET2, PhTET3 e TmPep105011,16,28o anche monomeri, come in PhTET2 e PfTET324,29.

Presentato qui è un protocollo utilizzato per studiare le strutture degli oligomeri TmPep1050. Questo protocollo è un insieme di metodi comuni tra cui la purificazione proteica, lo screening dell'attività proteolitica, la cristallizzazione, la diffrazione dei raggi X e la sostituzione molecolare. Vengono enfatizzate le sottigliezze inerenti alla gestione dei metalloenzimi, all'oligomerizzazione proteica, alla cristallizzazione proteica e alla sostituzione molecolare. Viene inoltre presentato un caso di studio per dimostrare se i dodecamer TmPep1050 possono dissociarsi ulteriormente in monomeri o meno. Per rispondere a questa domanda, è stata studiata una variante TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, i cui siti di legame metallico sono compromessi mutando i residui di His-60 (sito M2) e His-307 (sito M1) ad Ala. Questo protocollo può essere ospitato per studiare altre amminopeptidasi M42 o qualsiasi metalloenzima con comportamento simile alla morfeina.

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Protocollo

1. Produzione e purificazione del ricombinante TmPep1050

NOTA: Di seguito sono descritte la procedura di clonazione e la purificazione di tipo selvatico TmPep1050 adattato da uno studioprecedente 11. In alternativa, la clonazione può essere eseguita utilizzando un gene sintetico. Per generare varianti TmPep1050, la mutagenesi diretta dal sito può essere eseguita seguendo, ad esempio, le reazioni a singolo primer nel metodo SPRINP (Parallel Protocol)30. Il protocollo di purificazione può essere utilizzato per le varianti TmPep1050. L'uso di His-tag dovrebbe essere evitato in quanto interferisce con l'attacco ioniche metallico.

  1. Progettazione del vettore di espressione
    1. Acquisire DNA genomico di Thermotoga maritima MSB8 (ATCC 43589) o TmCD00089984 (Joint Center for Structural Genomics).
    2. Amplificare il TM_1050 di lettura aperto (ORF) utilizzando DNA genomico o plasmide modello, una DNA polimerasi ad alta fedeltà e i seguenti primer: ocej419 (5'- TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATACCCATGAAGGAACTGATCAGAAAGCTG) e ocej420 (5'- ATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGGAGACCGTTTACGCCCCCAGATACCTGATGAG). Eseguire lo screening della reazione a catena della polimerasi (PCR) secondo il seguente schema: 5 min a 95 °C, 30 cicli di 3 passaggi (30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C, 90 s a 72 °C) e 10 min a 72 °C come fase finale.
    3. Clonare il frammento PCR in un vettore di espressione adatto (Table of Materials) mediante ricombinazione omologa ( Figura1) in E. coli secondo il protocollo SLiCE31. A 50 ng di vettore linearizzato, aggiungere il frammento PCR in un rapporto molare 10:1 tra frammento e vettore, 1 μL di estratto di ceppo PPY, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP e 10 mM ditiothreitol (DTT) per un volume di reazione di 10 μL. Incubare per 1 h a 37 °C.
    4. Trasformare il ceppo blu E. coli XL1 chimicamente competente (o qualsiasi ceppo adattoal rec A) con 1 μL di reazione di ricombinazione. Placcare le celle su supporto LB contenente 100 μg/mL di ampicillina. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
    5. Raccogliere colonie su piastre LB fresche con ampicillina da 100 μg/mL. Incubare le piastre a 37 °C per almeno 8 ore.
    6. Schermo per candidati positivi per colonia PCR utilizzando coppia di primer adatta (5'- ATGCCATAGCATTTTTATCC e 5'- ATTTAATCTGTATCAGGC se si utilizza il vettore consigliato elencato in Table of Materials). Con un'estremità microtip, graffiare una colonia prelevata e trasferire le cellule a 20 μL di miscela di reazione contenente 0,5 μM di ogni primer e 10 μL di una miscela commerciale di DNA polimerasi Taq.
    7. Eseguire lo screening PCR secondo il seguente schema: 5 min a 95 °C come fase di denaturazione, 30 cicli di 3 passaggi (30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C, 90 s a 72 °C) e 10 min a 72 °C come fase finale.
      NOTA: Le reazioni PCR possono essere conservate durante la notte nella macchina PCR a 12 °C.
    8. Caricare 10 μL di ogni reazione PCR su un gel di agarosio dello 0,8% preparato in tampone Tris-acetato-EDTA (TAE). Eseguire l'elettroforesi per 25 minuti a 100 V.
      NOTA: è previsto un amplicon da 1,1 kbp.
    9. Estrarre i plasmidi dai candidati utilizzando un kit commerciale (Table of Materials) e sequenziarli utilizzando la stessa coppia di primer utilizzata nel passaggio 1.1.6.
  2. Coltura cellulare
    NOTA: quando un candidato adatto è stato identificato sequenziando, il clone può essere utilizzato direttamente come espressione se si utilizza il vettore consigliato (Table of Materials). In tal caso, l'espressione è controllata dal promotore arabinosi-inducibile PBAD 32.
    1. Inoculare 10 mL di mezzo LB contenente 100 μg/mL di ampicillina con il candidato e incubare la precultura durante la notte a 37 °C sotto scuotimento orbitale. Aggiungere 5 mL della precultura a 1 L di mezzo LB con 100 μg/mL di ampicillina. Mente di rispettare un rapporto aria/liquido di 3.
    2. Lascia che le cellule crescano a 37 °C sotto scuotimento orbitale. Monitorare la densità ottica a 660 nm (OD660).
    3. Quando L'OD660 ha raggiunto 0,5−0,6, raffreddare rapidamente la coltura per 5 minuti sul ghiaccio e trasferirla in un incubatore impostato su 18 °C.
    4. Aggiungere 0,2 g/L arabinosi per indurre l'espressione genica e incubare per 12−18 h a 18 °C.
    5. Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 6.000 x g per 30 min a 4 °C. Scartare le cellule supernatanti e di lavaggio con 100 mL dello 0,9% (w/v) NaCl.
    6. Centrifugare di nuovo a 6.000 x g per 15 minuti a 4 °C e scartare il supernatante.
      NOTA: I pellet cellulari possono essere utilizzati direttamente per l'estrazione di proteine o conservati a -80 °C.
  3. Purificazione delle proteine
    1. Rimescolare il pellet cellulare in 40 mL di MOPS da 50 mM, 1 mM CoCl2, pH 7.2. Aggiungere 1 μL di 25 U/μL DNA/RNA endonucleasi e una compressa di cocktail inibitore della proteasi che non contiene EDTA. Sonicare le sospensioni in modalità impulso sotto raffreddamento per 30 minuti.
    2. Centrifugare l'estratto grezzo a 20.000 x g per 30 min a 4 °C. Raccogliere il supernatante e scaldarlo in un bagno d'acqua a 70 °C per 10 minuti.
    3. Centrifugare l'estratto di cellule denaturate a 20.000 x g per 30 min a 4 °C e raccogliere il supernatante per la purificazione.
    4. Utilizzare resina adatta per lo scambio di anione(Tabella deimateriali) imballata in una colonna di ~15 mL di volume. Fare riferimento alle raccomandazioni del produttore per la portata di lavoro e il limite di pressione della colonna. Equilibrare la resina con MOPS da 50 mM, 1 mM CoCl2, pH 7.2.
    5. Caricare il supernatante raccolto dal passaggio 1.3.3 nella colonna. Monitorare l'assorbanza dell'eluiato a 280 nm. Una volta raggiunta la linea di base, procedere all'eluizione.
    6. Applicare una sfumatura da 0 a 0,5 M NaCl in MOPS da 50 mM, 1 mM CoCl2, pH 7,2 per 5 volumi di colonna (CV). Attendere che la conducibilità sia stabilizzata e che l'assorbanza abbia raggiunto la linea di base.
    7. Applicare una pendenza finale da 0,5 a 1 M NaCl in MOPS da 50 mM, 1 mM CoCl2, pH 7,2 per 1 CV.
    8. Analizzare alcune frazioni (vedi figura 2A per indicazioni) mediante elettroforesi del gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio (SDS-PAGE).
      NOTA: TmPep1050 appare come una banda da 36 kDa dopo la colorazione Coomassie. In alternativa, la presenza di TmPep1050 può essere confermata dal saggio di attività (vedi sezione 2.1). In questa fase, le frazioni possono essere conservate a 4 °C durante la notte.
    9. Mettere in comune le frazioni contenenti TmPep1050 e aggiungere polvere finemente macinata di (NH4)2SO4 per ottenere una concentrazione di 1,5 M (NH4)2SO4. Mescolare delicatamente invertendo il tubo a testa in giù fino alla completa dissoluzione.
    10. Utilizzare resina ad interazione idrofobica(Tabella deimateriali) imballata in una colonna di ~30 mL di volume. Fare riferimento alle raccomandazioni del produttore per la portata di lavoro e il limite di pressione della colonna. Equilibrare la resina con MOPS da 50 mM, 1,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2, pH 7,2.
    11. Caricare il campione sulla colonna e monitorare l'assorbanza dell'eluiato a 280 nm. Quando l'assorbanza ha raggiunto la linea di base, le proteine legate all'eluto applicando un gradiente da 1,5 M a 0 M(NH4) 2 SO4 in MOPS da 50 mM, 1 mM CoCl2, pH 7,2 per 5 CV.
    12. Analizzare alcune frazioni (vedere la figura 2B per indicazioni) da SDS-PAGE.
      NOTA: TmPep1050 appare come una banda da 36 kDa dopo la colorazione Coomassie. In alternativa, la presenza di TmPep1050 può essere confermata dal saggio di attività (vedi sezione 2.1). In questa fase, le frazioni possono essere conservate a 4 °C durante la notte.
    13. Mettere in comune le frazioni contenenti TmPep1050 e concentrarsi a 2 mL utilizzando unità di ultrafiltrazione con taglio da 30 kDa(Tabella dei Materiali). Procedere alla sezione 1.4 per determinare il peso molecolare.
  4. Cromatografia ad esclusione delle dimensioni
    1. Utilizzare resina di esclusione delle dimensioni (Tabella deimateriali ) imballata in una colonna di ~120 mL di volume. Fare riferimento alle raccomandazioni del produttore per la portata di lavoro e il limite di pressione della colonna. Equilibrare la resina con MOPS da 50 mM, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2, pH 7,2.
    2. Caricare il campione sulla colonna e monitorare l'assorbanza dell'eluiato a 280 nm. Frazionato dal volume morto della colonna (~0,33 CV) fino alla fine dell'eluizione (1 CV).
    3. Misurare il volume di eluizione per ogni picco osservato.
      NOTA: Per una guida, dodecamerico TmPep1050 eluisce a ~82 mL (Figura 3A) nelle attuali condizioni sperimentali, mentre il dimerico TmPep1050, come la variante TmPep1050H60A H307A, eluisce a ~95 mL (Figura 3B). Alcuni TmPep1050 possono adottare entrambe le forme oligomeriche, come TmPep1050H60A (Figura 3C).
    4. Analizzare le frazioni corrispondenti ai massimi e alle code dei picchi osservati utilizzando SDS-PAGE.
      NOTA: TmPep1050 appare come una banda da 36 kDa dopo la colorazione Coomassie.
    5. Mettere in comune le frazioni di ogni picco e concentrarsi utilizzando unità di ultrafiltrazione con taglio da 30 kDa(Table of Materials)per ottenere una concentrazione di ~300 μM.
    6. Misurare l'assorbanza a 280 nm su uno spettrofotometro a nano-volume e calcolare la concentrazione utilizzando il coefficiente di estinzione molecolare di 18.910 M-1 cm-1.
    7. Conservare la proteina purificata a -18 °C.
    8. Per determinare il peso molecolare, calibrare la colonna sec (Size Exclusion Chromatography) utilizzando standard di peso molecolare(Table of Materials). Analizzare gli standard utilizzando MOPS da 50 mM, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2 pH 7,2 come buffer di corsa.

2. Test di attività e preparazione dell'apo-enzima

NOTA: Originariamente, l'apo-enzima è stato preparato diluendo 1 volume di TmPep1050 in 10 volumi di acido malico 2.1 M pH 7.0 e concentrandosi di nuovo a 1 volume prima della dialisi11. Di seguito viene presentata una procedura alternativa utilizzando 1,10-fenantrolina, un chelatore ionica metallico. Questa procedura riduce la perdita di proteine e dà gli stessi risultati rispetto al metodo pubblicato in precedenza.

  1. Saggio di attività
    1. Preparare una soluzione stock di 100 mM L-Leucine-p-nitroanilide(Tavola dei materiali)in metanolo.
    2. Aggiungere 25 μL di 100 mM L-Leucine-p-nitroanilide in 965 μL di MOPS da 50 mM, 250 μM CoCl2, pH 7,2, 10% metanolo. Preincubare la miscela di reazione a 75 °C in un bagno asciutto.
    3. Diluire l'enzima in 50 mM MOPS pH 7.2 a una concentrazione di 1 μM. Aggiungere 10 μL alla miscela di reazione, vortice e incubare a 75 °C fino a quando non è diventato giallastro o per 1 h.
    4. Interrompere la reazione aggiungendo 1 mL di acido acetico al 20%. Vortice bene e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
    5. Trasferire la miscela di reazione in una cella spettrofotometrica. Leggere l'assorbanza a 410 nm contro un controllo negativo (miscela di reazione incubata senza enzima).
  2. Preparazione apo-enzimatica
    1. Preparare una soluzione stock di 1 M 1,10-fenantrolina in etanolo. Aggiungere 10 μL di soluzione stock di 1,10-fenantropina a 890 μL di MOPS da 50 mM, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7,2. Aggiungere 100 μL di TmPep1050 purificato (concentrazione di 300 μM−1 mM).
    2. Controllare la perdita di attività utilizzando il saggio di attività descritto nella sezione 2.1 senza aggiungere CoCl2 nella miscela di reazione.
    3. Trasferire il campione in un tubo di dialisi. Dializzare contro 200 mL di MOPS da 50 mM, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7,2 a 4 °C. Scambiare tre volte il dialisato con tampone fresco durante la dialisi di 48 ore.
    4. Raccogliere il campione dal tubo di dialisi e concentrarsi di nuovo a 100 μL utilizzando unità di ultrafiltrazione con taglio da 30 kDa(Tabella dei materiali). Controllare la concentrazione leggendo l'assorbanza a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro a nano-volume.
  3. Preparazione del dimero
    1. Diluire l'apo-enzima ad una concentrazione di 1 μM in MOPS da 50 mM, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7,2. Incubare per 2 ore a 75 °C in un bagno asciutto, quindi lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente.
    2. Concentrare il campione in una concentrazione enzimatica di almeno 50 μM. Controllare il peso molecolare per SEC (vedere sezione 1.4). Il picco di eluizione deve spostarsi da ~82 mL a ~95 mL (nelle attuali condizioni sperimentali).

3. Cristallizzazione TmPep1050

NOTA: La cristallizzazione proteica rimane una scienza empirica in quanto è un fenomeno multifattoriale33. Mentre alcuni parametri possono essere identificati e controllati (come temperatura, pH, concentrazione dell'agente di precipitazione), altri possono influenzare in modo sfuggente la cristallizzazione (come proteine e purezza chimica, proteolisi, storia del campione). Al giorno d'oggi la cristallizzazione proteica viene affrontata in modo razionale e sistematico grazie a un sacco di condizioni commerciali di screening della cristallizzazione e automazione. L'ottimizzazione di una condizione di cristallizzazione, tuttavia, si basa principalmente su un approccio di prova ed errore. Di seguito sono descritti un progetto per cristallizzare le proteine e diversi consigli per ottimizzare le condizioni di cristallizzazione.

  1. Screening della cristallizzazione
    NOTA: Utilizzando kit di cristallizzazione commerciale, cristalli di TmPep1050 dodecamerico sono stati ottenuti in 2,2 M di acido DL-malico pH 7.0, 0.1 M Bis-Tris propano pH 7.0 e 0.18 M citrato di tri-ammonio, 20% glicole polietilene (PEG) 3350. Cristalli di dimerico TmPep1050 sono stati ottenuti in 0,1 M di citrato di sodio pH 5.6, acetato di ammonio 0,2 M, 30% PEG4000. Cristalli di dodecamer appaiono entro una settimana e raggiungono le loro dimensioni complete in un mese. I cristalli dei dimeri di solito compaiono entro 24 ore e crescono a grandezza naturale in una settimana.
    1. Acquisire diversi kit di cristallizzazione commerciale (vedi Tabella dei materiali per esempi).
    2. Impostare le lastre di cristallizzazione (Table of Materials) per il metodo della goccia appesa. Riempire i pozzi con 500 μL di ogni soluzione di un kit di screening di cristallizzazione.
    3. Per ogni pozzo, impostare un supporto di cristallizzazione. Sul supporto, depositare una goccia di 1 μL di proteine purificate (di solito ~10 mg/mL).
    4. Pipet immediatamente 1 μL di soluzione di cristallizzazione dal pozzo. Aggiungere con attenzione alla goccia proteica e mescolare delicatamente pipettando a testa in giù tre volte. La goccia deve rimanere semisferica senza bolle.
    5. Avvitare il supporto sopra il pozzo corrispondente. Ripetere l'operazione per l'intero kit.
    6. Dopo aver sistemato le piastre, osservare ogni goccia con un binocolo. Fare riferimento alla guida per l'utente del kit di cristallizzazione per l'interpretazione (caduta chiara, separazione di fase, precipitato, aghi, ecc.).
    7. Incubare le piastre a 20 °C. Controllare i piatti una volta al giorno durante la prima settimana e una volta alla settimana dopo.
    8. Segna ogni bene usando il foglio di punteggio e la guida dell'utente fornita con i kit di cristallizzazione.
  2. Ottimizzazione della cristallizzazione
    NOTA: Le condizioni iniziali di cristallizzazione del dodecamerico TmPep1050 sono state ottimizzate a 2,1 M di acido DL-malico pH 6,75 e 0,18 M citrato di tri-ammonio pH 7,5, 40% (w/v) PEG3350 mentre la condizione di cristallizzazione del dimerico TmPep1050 è stata spostata a 0,1 M di citrato di sodio pH 6.0, 10% (w/v) PEG3350. Un ciclo di semina è stato necessario per migliorare la cristallinità. Di seguito viene descritto come è stata ottimizzata la cristallizzazione della variante TmPep1050H60A H307A.
    1. Preparare soluzioni stock di tampone di citrato di sodio da 0,5 M a diversi pH (4,5, 5,2 e 6,0) e 50% (con v) soluzione PEG3350.
    2. Impostare una piastra di cristallizzazione come matrice di pH rispetto all'agente di precipitazione (vedere figura 4A).
    3. Incubare la piastra a 20 °C. Osserva ogni bene con un binocolo una volta al giorno durante una settimana.
    4. Segna ogni bene in base alle dimensioni e alla forma del cristallo. Selezionare una condizione che dia cristalli di almeno 50 μm. Procedere al microseeding.
  3. Microseeding
    NOTA: Il microseeding è un metodo potente per migliorare la forma, le dimensioni e la cristallinità dei cristalli proteici34. Un approccio di semina più veloce è la semina a striscia usando un baffo di gatto. Vedere la figura 4 come esempio di come l'ottimizzazione della cristallizzazione e il microseeding abbiano migliorato la forma e le dimensioni del cristallo per TmPep1050H60A H307A.
    1. Preparare i semi utilizzando il pozzo selezionato nel passaggio 3.2.4.
    2. Aumentare il volume di una goccia contenente cristalli a 10 μL aggiungendo una soluzione di cristallizzazione dal pozzo. Pipettare la goccia e aggiungere 90 μL di soluzione di cristallizzazione dal pozzo. Vortice accuratamente e tenere i semi sul ghiaccio.
    3. Preparare diverse diluizioni dei semi: 1x, 10x, 25x e 100x. Vortice bene i semi prima di pipettare. Tieni le diluizioni sul ghiaccio.
    4. Per ogni diluizione del seme, impostare una piastra di cristallizzazione come matrice di pH rispetto all'agente di precipitazione (vedere figura 4B). Utilizzare le soluzioni stock preparate al passaggio 3.2.1.
    5. Quando si effettua la goccia, aggiungere 0,2 μL di semi per una goccia di 2 μL. Incubare la piastra a 20 °C. Osserva ogni bene con un binocolo una volta al giorno durante una settimana.
      NOTA: La distribuzione e la forma delle dimensioni del cristallo devono essere migliorate, vedere La figura 4C come esempio per TmPep1050H60A H307A. Per ulteriori usi, i semi possono essere conservati a -20 °C.

4. Diffrazione a raggi X

  1. Raccolta del cristallo
    NOTA: La preparazione del campione dipende dalla struttura sorgente a raggi X (struttura domestica vs sincrotrone). Utilizzare di conseguenza i dispositivi di archiviazione (flaconcini e cestello porta flaconcino). L'aggiunta di crioprotettivo (come il glicerolo) può essere richiesta a seconda della concentrazione di sale/agente di precipitazione. Per i cristalli TmPep1050, un crioprotettore non è necessario in quanto peg o concentrazione tampone è abbastanza alta da evitare cristalli d'acqua.
    1. Preparare un bagno riempito con azoto liquido, immergere eventuali fiale o cesto utilizzati per la manipolazione del campione.
    2. Impostare cicli di prelievo campioni di diverse dimensioni: 100, 150 e 200 μm(Tabella dei materiali). Scegli le dimensioni in base alle dimensioni del cristallo.
    3. Utilizzando un binocolo, controllare la goccia contenente cristalli e individuare cristalli isolati (il più facile da raccogliere). Con un anello, scegli delicatamente un cristallo dal basso. Immergere immediatamente l'anello in azoto liquido e posizionare l'anello in una fiala adatta.
  2. Raccolta dati
    NOTA: la raccolta dei dati può variare notevolmente a seconda della sorgente a raggi X (funzione domestica rispetto al sincrotrone) e della sensibilità del rivelatore. La strategia di raccolta può anche differire notevolmente da un campione all'altro, a seconda della risoluzione, dell'intensità dello spot, del gruppo spaziale, ecc. L'argomento è stato ampiamente esaminato da Dauter35.
    1. Montare l'anello portando il cristallo sulla testa del goniometro del diffractometro.
    2. Sintonizzate la testa del goniometro lungo gli assi XYZ per allineare il cristallo al percorso del fascio di raggi X.
    3. Impostare la lunghezza d'onda su 0,98 Å e spostare il rivelatore per ottenere 2 Å di risoluzione.
    4. Inizia una breve raccolta di dati acquisendo immagini in almeno due diversi orientamenti cristallini. Scatta 10 immagini (1 immagine per 0,1°) a 0° e 90°.
    5. Controlla le immagini raccolte con un software adatto (ad esempio, ADXV, XDS-Viewer o Albula Viewer). Determinare l'intensità del punto e la risoluzione più alta in cui vengono visti i punti. Controllare anche la monocristallità e la separazione spot.
    6. Infine, ripetere i passaggi 4.2.3−4.2.5 cambiando la posizione del rivelatore per una risoluzione più o meno alta e il tempo di esposizione in conformità con l'osservazione.
    7. Inizia la raccolta dei dati a circa 360° con 1 immagine scattata per 0,1°. Ricordarsi di impostare la posizione del rilevatore e il tempo di esposizione in modo ottimale.

5. Indicizzazione, sostituzione molecolare e costruzione di modelli

  1. Indicizzazione
    NOTA: L'indicizzazione è un metodo per misurare l'intensità delle macchie di diffrazione, dando le ampiezze dei fattori di struttura36. Quattro pacchetti software sono comunemente utilizzati per l'elaborazione di immagini raccolte: Mosflm37, HKL200038, DIALS39e XDS40. Quest'ultimo è stato utilizzato per indicizzare i set di dati ottenuti dalla diffrazione cristallina TmPep1050.
    1. Installare il pacchetto XDS e XDSME41. Se si elaborano file HDF5, installare il plug-in XDS Neggia (disponibile sul sito web di Dectris). Per ulteriori informazioni, visitare la pagina Web wiki di XDS https://strucbio.biologie.uni-konstanz.de/xdswiki/index.php/Main_Page pagina Web XDSME https://github.com/legrandp/xdsme.
    2. Prima di elaborare i dati, creare una cartella da cui verrà eseguito XDS. Individuare il percorso delle immagini.
    3. Per eseguire XDSME, digitare xdsme /path_to_images/image.extension in una finestra terminale.
    4. Dopo che XDS ha terminato il processo, controllare il file CORRECT. File LP. Si noti la probabilità della determinazione del gruppo spaziale, la completezza dei dati, la massima risoluzione, la mosaicità cristallina e la qualità dei dati. Controllare anche XDS_pointless.log per ottenere la probabilità di gruppi spaziali.
      NOTA: vedere la figura 5 come esempio di output.
    5. Riesegui XDSME con diverse soluzioni di gruppi spaziali proposte da XDS in cartelle separate per evitare di sovrascrivere il processo precedente. Digitare xdsme -s space_group_name -c "unit_cell_parameters" /path_to_images/image.extension (ad esempio, xdsme -s P21 -c "43.295 137.812 61.118 90.000 110.716 90.000).
    6. Controllare il file CORRECT. LP e scegliere la soluzione migliore in base alle statistiche sui dati.
    7. Eseguire XSCALE digitando xscale.py XDS_ASCII. HKL. Eseguire XDSCONV digitando xdsconv.py XSCALE. HKL ccp4.
      NOTA: in alcuni casi, XDSME non riesce a identificare il gruppo spaziale o non riesce a tagliare correttamente l'intervallo di risoluzione o genera statistiche di dati strane. Se si verifica un tale problema, vale la pena eseguire XDS in modo nativo. Diversi parametri devono essere introdotti nell'XDS. File di avvio INP (vedi pagina wiki XDS). Quando si utilizza XDS, è possibile verificare la probabilità di possibili gruppi spaziali utilizzando Pointless, parte del pacchettoCCP4 42. Per ridurre la risoluzione del set di dati, Rmeas < 60% e I/σ ~2 sono comunemente accettati per determinare la risoluzionepiù alta 43. La sostituzione molecolare e la raffinazione del modello, tuttavia, possono essere migliorate estendendo la risoluzione a I/σ ~0,5−1,5 e CC1/2 fino a 0,2−0,444.
  2. Sostituzione molecolare
    NOTA: I dati sperimentali danno accesso all'ampiezza dei fattori strutturali ma, senza conoscere la fase, sono inutili. La fase può essere determinata sperimentalmente con diversi metodi basandosi su un segnale anomalo (da un atomo pesante, per esempio)45. La sostituzione molecolare è un altro metodo per determinare la fase senza un atomo di scatteringanomalo 46,47. Questo metodo utilizza le coordinate di una molecola correlata per trovare e migliorare la fase iterativamente. Usiamo Phaser48 in Phenix GUI49 per la sostituzione molecolare.
    1. Preparare il modello iniziale per la sostituzione molecolare utilizzando le coordinate 4P6Y. Dal file pdb, estrarre il monomero A ed troncare i relativi aminoacidi in alanina utilizzando l'editor di file PDB in Phenix (nella scheda Strumenti modello).
    2. Eseguite Xtriage in Phenix (nella scheda Analisi dati) con il file di riflessione generato da XDSCONV (5.1.9) e la sequenza come input.
    3. Controllare il file di registro da Xtriage. Si noti la completezza, il numero di subunità nell'unità asimmetrica, l'anisotropia, la presenza di anelli di ghiaccio e l'occorrenza del gemellaggio.
    4. Eseguire Phaser-MR in Phenix (sotto la scheda Sostituzione molecolare) per la sostituzione molecolare utilizzando il file di riflessione, la sequenza e il modello 4P6Y iniziale troncato in poli alanina (passaggio 5.2.1).
    5. Al termine, verificare se è stato trovato un modello e il punteggio della sostituzione molecolare. Un fattore di traduzione Z-score (TFZ) di almeno 8 indica che la soluzione è definitivamente corretta.
  3. Costruzione di modelli
    NOTA: Dopo aver determinato la fase con sostituzione molecolare, il modello deve essere costruito e perfezionato. Questo protocollo utilizza Phenix GUI49 per la costruzione automatica e perfezionamenti iterativi e Coot50 per la costruzione e il perfezionamento manuale della struttura.
    1. Dopo la sostituzione molecolare utilizzando Phase-MR in Phenix, selezionare Esegui compilazione automatica. Tutti i file richiesti verranno aggiunti automaticamente. Basta premere Esegui per avviare la compilazione automatica.
    2. Al termine, controllare il modello in Folaga. Costruire e perfezionare manualmente il modello in base alla mappa di densità degli elettroni in Folaga.
    3. Perfezionate il modello curato manualmente in Phenix (nella scheda Perfezionamento) utilizzando il modello, la sequenza e i dati di diffrazione come input. Fare riferimento alla guida di Phenix per scegliere la strategia giusta.
    4. Dopo il perfezionamento, controllare i risultati: il lavoro Rfree e R deve diminuire, gli indicatori di Molprobity51 devono essere rispettati e gli outlier con bassa correlazione dello spazio reale devono essere limitati.
    5. Ripetere i passaggi 5.3.2−5.3.4 fino a generare il modello più raffinato.
    6. Eseguire Molprobity sul server: http://molprobity.biochem.duke.edu/. Controlla eventuali outlier identificati da Molprobity.
    7. Infine ripetere i passaggi 5.3.2−5.3.6 fino ad ottenere il miglior modello raffinato.

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Risultati

Per studiare una possibile dissociazione del dodecamero in monomeri in TmPep1050, i codoni His-60 e His-307 sono stati sostituiti da alanina codone usando un gene sintetico. Questo gene è stato quindi clonato nel vettore pBAD per l'espressione e la purificazione della corrispondente variante TmPep1050 successivamente denominata TmPep1050H60A H307A. La cromatografia ad esclusione di dimensioni(figura 3B)ha mostrato che la proteina purificata aveva un peso molecolare apparente di 56...

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Discussione

Il protocollo qui descritto consente di comprendere la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050 a livello strutturale. La metodologia è stata sperimentata in precedenza per determinare la struttura di entrambi gli oligomeri TmPep105011. Il passo più impegnativo è stato quello di trovare le condizioni che promuoveno la dissociazione dei dodecamer in dimeri stabili. Tali condizioni dovevano essere abbastanza miti da consentire la riassociazione dei dimeri in dodecamer al momento dell'aggiunta del ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Martine Roovers per aver corretto questo documento e per aver dato commenti costruttivi. L'accesso alla linea di travi Proxima 2 (sincrotrone SOLEIL) rientrava nei gruppi di allocazione dei blocchi 20151139.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,10-fenantrolinaSigma-Aldrich13, 137-7
Filtri centrifughi Amicon Ultra 0,5 ml Ultracel 30KMerck MilliporeUFC503096
Filtri centrifughi Amicon Ultra 15 Ultracel 30KMerck MilliporeUFC903024
Nucleasi BenzonasiMerck Millipore70664-3
CCP4N/Avisita http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-freeRoche5056489001
CootN/A visitahttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen IHampton ResearchHR2-110
Crystal Screen IIHampton ResearchHR2-112
DreamTaq Green PCR Master MixThermoFisher ScientificK1082
EasyXtal Strumento a 15 pozzettiNeXtal132007
Escherichia coli ceppo PPYN/Avedi riferimento 31
Escherichia coli XL1 ceppo bluAgilent200249
HMWGE Healthcare Life Sciences28-4038-42
Kit di calibrazione per filtrazione su gel LMWGE Sanità Scienze della vita28-4038-41
Filtrazione su gel StandardBiorad1511901
GeneJET Plasmide Miniprep KitThermoFisher ScientificK0503
IndiceHampton ResearchHR2-144
LitholoopsDimensioni molecolari
L-leucina-p-nitroanilideBachem AG
Natrix 1Hampton ResearchHR2-116
Natrix 2Hampton ResearchHR2-117
Neggia pluginDectrisN/Avisita https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite INeXtal130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IINeXtal130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IIINeXtal130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IVNeXtal130727
pBAD-TOPOThermoFisher ScientificK430001
PhenixN/Avisita https://www.phenix-online.org/
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltàThermoFisher ScientificF-530L
Salt RX 1Hampton ResearchHR2-107
Salt RX 2Hampton ResearchHR2-109
SnakeSkin Tubo per dialisi, 3.5K MWCOThermoFisher Scientific88242
Fonte 15PheGE Healthcare Life Sciences17014702
Fonte 15QGE Healthcare Life Sciences17094705
Superdex 200 grado di preparazioneGE Healthcare Life Sciences17104301
Thermotoga maritima MSB8 ceppoAmerican Type Culture CollectionATCC 43589
TmCD00089984Archivio plasmidico DNASUN/A
XDSN/Avisita http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsmeN/Avisita https://github.com/legrandp/xdsme
Kit di calibrazione per filtrazione su gel 40010720025

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