L'acetiltransferasi di l'acetilsina (KAT) catalizzare l'acetilazione dei residui di lino sia sulle proteine istonesine che su proteine non istonese1,2,3,4. Recenti ricerche rivelano che i KAT e la loro funzione di acetiltransferase possono promuovere la crescita del tumoresolido 4,5,6,7,8,9. Ad esempio, la proteina legante CREB (CBP)/p300 sono due KA paralogo che regolano numerose vie di segnalazione nelcancro 2,3. CBP/p300 hanno una funzione acetiltransferasi istone ben caratterizzata (HAT) e catalizzare Histone 3 Lysine 27 acetilazione (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marcatore importante per potenziatori attivi, regioni promotori e trascrizione genica attiva12,13,14. CBP/p300 servono come co-attivatori critici per le vie di segnalazione pro-crescita nei tumori solidi attivando la trascrizione degli oncogeni attraverso l'acetilazione degli istoni e altri fattori di trascrizione4,9,15,16,17,18. A causa del loro ruolo nella progressione del tumore, CBP/p300 e altri KAT sono sotto inchiesta per lo sviluppo di nuovi inibitori che bloccano la loro funzione oncogenica4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 e GNE-049 rappresentano due tentativi riusciti di sviluppare inibitori potenti e specifici per CBP/p3004,9. Ulteriori inibitori sono attualmente in fase di esame per CBP/p300 e altri KAT.
La qualità degli inibitori KAT precedentemente descritti (KATi) viene messa in discussione, con molti inibitori che mostrano effetti bersaglio e scarsa caratterizzazione21. Pertanto, una rigorosa caratterizzazione e convalida di nuovi farmaci candidati è essenziale per lo sviluppo di sonde chimiche di alta qualità. Qui delineati sono tre protocolli che formano una pipeline per lo screening e convalidano rigorosamente la potenza e la specificità del nuovo KATi, con un focus specifico sull'inibizione della funzione HAT (HATi) dei KAT. CBP/p300 e i loro inibitori sono utilizzati come esempi, ma questi protocolli possono essere adattati per altri KAT che hanno una funzione HAT7.
Il primo protocollo è un saggio di acetiltransferasi istone in vitro (HAT) che utilizza p300 ricombinante purificato e istoni in una reazione controllata in provetta. Questo saggio è semplice da eseguire, è conveniente, può essere utilizzato per lo screening dei composti in un ambiente a bassa produttività e non richiede materiali radioattivi. In questo protocollo, il ricombinante p300 catalizza l'acetilazione della lliina sulle code dell'istone durante un breve periodo di incubazione e i livelli di acetilazione dell'istone vengono misurati utilizzando procedure standard di immunoblotting. La reazione enzimatica può essere eseguita in presenza o assenza di inibitori CBP/p300 per lo screening di composti che riducono l'acetilazione istonea. Inoltre, l'analisi HAT può essere utilizzata per verificare se i nuovi composti sono selettivi per CBP/p300 valutando la loro attività rispetto ad altri KAT purificati, come PCAF. Il test HAT è un ottimo punto di partenza per studiare nuovi inibitori grazie alla sua semplicità, basso costo e alla capacità di determinare la potenza/selettività di un inibitore. Infatti, questo protocollo è spesso utilizzato nella letteratura come uno schermo in vitro5,10. Tuttavia, gli inibitori identificati nel saggio HAT non sono sempre efficaci nella coltura cellulare perché una reazione in provetta è molto più semplice di un sistema cellulare vivente. Pertanto, è essenziale caratterizzare ulteriormente gli inibitori negli esperimenti di colturacellulare 22,23.
Il secondo protocollo in cantiere è il saggio Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI). Questo saggio basato su cellule utilizza inibitori della deacetilase istone (HDACi) come strumento per iperacetizzare gli istoni in cromatina prima della co-incubazione con un HATi24. L'acetilazione dell'istone basale può essere bassa nella coltura cellulare, rendendo difficile la ricerca tramite immunoblotting senza l'aggiunta di un HDACi per aumentare l'acetilazione. Lo scopo del saggio ChHAI è quello di identificare nuovi HATi che possono attenuare l'aumento dell'acetilazione istonea causata dall'inibizione dell'HDAC. I vantaggi di questo saggio includono il suo basso costo, relativa facilità di esecuzione, e l'uso di cellule in coltura, che fornisce più rilevanza fisiologica rispetto al test tube HAT saggio. Simile al saggio HAT, questo protocollo utilizza l'immunoblotting standard per la raccolta dei dati.
I test HAT e ChHAI forniscono dati sulla potenza dei nuovi composti per inibire l'acetilazione degli itoni globali, ma non forniscono informazioni su come questi composti influenzano le modifiche in specifiche regioni genomiche. Pertanto, il protocollo finale, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) è un esperimento di coltura cellulare che studia le interazioni DNA-proteina in specifiche regioni del genoma. Nel protocollo ChIP, la cromatina è interconnessa per preservare le interazioni DNA-proteina. La cromatina viene quindi estratta dalle cellule e il complesso DNA-proteina subisce un'immunoprecipizione selettiva per la proteina di interesse (ad esempio, utilizzando un anticorpo specifico per H3K27ac). Il DNA viene quindi purificato e analizzato utilizzando qPCR. Ad esempio, ChIP-qPCR può essere utilizzato per determinare se un nuovo haTi downregulates histone acetylation at individual oncogenes, come Cyclin D125. Mentre ChIP-qPCR è una tecnica comune utilizzata nel campo, può essere difficile ottimizzare4,10,26. Questo protocollo fornisce suggerimenti per evitare potenziali insidie che possono verificarsi durante l'esecuzione della procedura ChIP-qPCR e include controlli di qualità che devono essere eseguiti sui dati.
Se utilizzati insieme, questi tre protocolli consentono la rigorosa caratterizzazione e convalida del nuovo HATi. Inoltre, questi metodi offrono molti vantaggi perché sono facili da eseguire, relativamente a buon mercato e forniscono dati sull'acetilazione istonea globale e regionale.