Analisi per la convalida degli inibitori dell'acetiltransferasi di Histone

Aaron R. Waddell; Daiqing Liao

doi:10.3791/61289

Articolo metodologico

Analisi per la convalida degli inibitori dell'acetiltransferasi di Histone

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DOI:

10.3791/61289

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6 agosto 2020

Aaron R. Waddell¹ , Daiqing Liao¹

¹Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Gli inibitori dei l'acetiltransferasi dell'istone (HAT, noto anche come lisina acetiltransferasi), come CBP/p300, sono potenziali terapie per il trattamento del cancro. Tuttavia, sono necessari metodi rigorosi per convalidare questi inibitori. Tre metodi in vitro per la convalida includono i saggi HAT con acetiltransferasi ricombinanti, l'immunoblotting per l'acetilazione degli istoni nella coltura cellulare e ChIP-qPCR.

Abstract

L'acetiltransferasi della lniina (KAT) catalizzare l'acetilazione dei residui di litina sugli istoni e su altre proteine per regolare la dinamica della cromatina e l'espressione genica. I T-A, come il CBP/p300, sono oggetto di un'intensa indagine in quanto obiettivi terapeutici a causa del loro ruolo critico nella tumorigenesi di diversi tipi di cancro. Lo sviluppo di nuovi inibitori di piccole molecole che prendono di mira la funzione dell'acetiltransferasi istone (HAT) dei KAT è impegnativo e richiede robusti saggi in grado di convalidare la specificità e la potenza dei potenziali inibitori.

Questo articolo descrive una pipeline di tre metodi che forniscono una rigorosa convalida in vitro per i nuovi inibitori HAT (HATi). Questi metodi includono un test tube di prova HAT, chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) saggio, e Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). Nel saggio HAT, i TEST ricombinanti vengono incubati con istoni in una reazione in provetta, consentendo l'acetilazione di specifici residui di litina sulle code istonese. Questa reazione può essere bloccata da un HATi e i livelli relativi di acetilazione istone specifica del sito possono essere misurati tramite immunoblotting. Gli inibitori identificati nel saggio HAT devono essere confermati nell'ambiente cellulare.

Il saggio ChHAI utilizza l'immunoblotting per lo screening per i nuovi HATi che attenuano la robusta iperacetilazione degli istoni indotti da un inibitore della deacetilase istonea (HDACi). L'aggiunta di un HDACi è utile perché i livelli basali di acetilazione istone può essere difficile da rilevare tramite immunoblotting.

I saggi HAT e ChHAI misurano i cambiamenti globali nell'acetilazione degli itoni, ma non forniscono informazioni sull'acetilazione in specifiche regioni genomiche. Pertanto, ChIP-qPCR viene utilizzato per studiare gli effetti di HATi sui livelli di acetilazione degli itoni a elementi regolatori genici. Ciò si ottiene attraverso l'immunoprecipizione selettiva dei complessi istone-DNA e l'analisi del DNA purificato attraverso il qPCR. Insieme, questi tre saggi permettono un'attenta convalida della specificità, della potenza e del meccanismo d'azione del nuovo HATi.

Introduzione

L'acetiltransferasi di l'acetilsina (KAT) catalizzare l'acetilazione dei residui di lino sia sulle proteine istonesine che su proteine non istonese¹^,²^,³^,⁴. Recenti ricerche rivelano che i KAT e la loro funzione di acetiltransferase possono promuovere la crescita del tumore^{solido 4}^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Ad esempio, la proteina legante CREB (CBP)/p300 sono du....