Presentato è un protocollo per fabbricare un dispositivo cartaceo per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi.
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Articolo metodologico
Preconcentrazione su carta e isolamento di microvescicoli ed esosomi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I microvescoli e gli esosomi sono piccole vesciche membranose rilasciate nell'ambiente extracellulare e circolate in tutto il corpo. Poiché contengono varie biomolecole derivate dalle cellule parentali come DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, il loro arricchimento e isolamento sono passaggi critici per il loro sfruttamento come potenziali biomarcatori per applicazioni cliniche. Tuttavia, i metodi di isolamento convenzionali (ad esempio, l'ultracentrifuga) causano perdite e danni significativi ai microvescicoli e agli esosomi. Questi metodi richiedono anche più passaggi ripetitivi di ultracentrifugazione, carico e sprechezza dei reagenti. Questo articolo descrive un metodo dettagliato per fabbricare un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) progettato per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi in modo semplice. Il design unico dell'Exo-PAD, costituito da strati multipiegati a fisarmonica con aree campione convergenti, è integrato con la tecnica di polarizzazione della concentrazione degli ioni, consentendo così l'arricchimento di cinque volte dei microvigli e degli esosomi su strati specifici. Inoltre, i microvescicoli arricchiti e gli esosomi sono isolati semplicemente dispiegando l'Exo-PAD.
Introduzione
I microvescicoli e gli esosomi sono piccole vesciche a membrana che misurano rispettivamente 0,2 m e 30-200 nm. Essi sono secreti nell'ambiente extracellulare da diversi tipi di cellule1,2,3,4,5. Essi contengono informazioni sulle cellule parentali sotto forma di sottoinsiemi di DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, e circolano in tutto il corpo attraverso vari fluidi corporei come siero, plasma, urina, liquido cerebrospinale, liquido amniotico, e saliva6,....
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Protocollo
1. Fabbricazione del dispositivo
- Definire la regione da stampare su carta utilizzando il software della stampante (Table of Materials).
NOTA: Il disegno ha 12 strati con motivi di cera in cui i diametri delle aree campione circolari si restringono gradualmente da 5 a 2 mm (Figura 1A). - Stampare la cera idrofobica sulle regioni designate su entrambi i lati della carta di cellulosa (Tabella dei materiali) utilizzando una stampante di cera commerciale ( Tabella deimateriali) (Figura 1B).
- Mettere la carta stampata in cera in un for....
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Risultati
Il tempo di funzionamento deve essere ottimizzato per ottenere il massimo rendimento di recupero dei microvessicoli arricchiti e degli esosomi. Tempo insufficiente non consente una sufficiente migrazione dei microvicoli e degli esosomi, che diminuisce l'arricchimento, mentre il tempo eccessivo deteriora la messa a fuoco spaziale e quindi disperde i migameni e gli esosomi. Così, attraverso la fase di ottimizzazione del tempo, è possibile identificare il massimo fattore di preconcentrazione di microvissicoli ed esosomi e l.......
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Discussione
Anche se l'Exo-PAD è stato utilizzato con successo per l'arricchimento e l'isolamento di microvicoli ed esosomi, diversi punti critici devono essere attentamente considerati: 1) il tempo di incubazione del forno e la temperatura durante la preparazione del dispositivo, 2) tempo di elaborazione, 3) applicazione di tensione con diversi numeri di strato e diametri di area campione, e 4) l'applicabilità ai campioni clinici.
Il tempo di incubazione e la temperatura indicati nel protocollo sono cond.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dalla National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee è stato sostenuto da una borsa di ricerca della Kwangwoon University nel 2019. Hyerin Kim è stata sostenuta dal "Programma di sviluppo delle competenze per gli specialisti dell'industria" del Ministero coreano del commercio, dell'industria e dell'energia (MOTIE), gestito dal Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (n. P0002397, programma HRD per la convergenza industriale di dispositivi intelligenti indossabili).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Elettrodi Ag/AgCl | A-M Systems, Inc. | 531500 | |
| Albumina da siero bovino (BSA) con diametro di 0,15", Alexa Fluor 594 coniugato | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA coniugato con Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Tampone carbonato-bicarbonato | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Tampone carbonato |
| Software CorelDraw (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Software per stampante per definire la stampa in cera regione | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Stampante a cera | |
| Carta per cromatografia grado 1 | Whatman | 3001-861 | Carta di cellulosa, dimensione: 20 * 20 cm |
| Standard esosoma marcato con fluorescenza | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Esosoma marcato con FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 misuratore di corrente/tensione | Keithley Instruments, Inc. | Attuale– sistema di misurazione della sorgente di tensione | |
| Soluzione di resina perfluorurata Nafion | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Membrana permselettiva, 20% in peso nella miscela di alcoli alifatici inferiori e acqua; contiene il 34% di acqua |
| NanoSight LM10 | Tecnologia NanoSight Macchina | l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA | |
| ) Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
Riferimenti
- Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
- Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 ....
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Ristampe e permessi
