Articolo metodologico

Un saggio di colorazione nucleare differenziale automatizzato per una determinazione accurata della citotossicità mitocana

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DOI:

10.3791/61295

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12 maggio 2020

 ,  , 
1Department of BioSciences, Rice University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il protocollo descrive un saggio rapido, ad alta produttività, affidabile, economico e imparziale per determinare in modo efficiente la vitalità cellulare. Questo saggio è particolarmente utile quando i mitocondri delle cellule sono stati danneggiati, il che interferisce con altri saggi. Il saggio utilizza il conteggio automatizzato delle celle macchiate con due coloranti nucleari: Hoechst 33342 e propidium ioduro.

Abstract

Il contributo dei mitocondri alla trasformazione oncogenica è oggetto di ampio interesse e studio attivo. Man mano che il campo del metabolismo del cancro diventa più complesso, l'obiettivo di colpire i mitocondri usando vari composti che infliggono danni mitocondriali (i cosiddetti mitocani) sta diventando abbastanza popolare. Sfortunatamente, molti saggi di citotossicità esistenti, come quelli a base di sali di tetrazolio o resazurina richiedono enzimi mitocondriali funzionali per le loro prestazioni. Il danno inflitto dai composti che prendono di mira i mitocondri spesso compromette l'accuratezza di questi saggi. Qui descriviamo un protocollo modificato basato sulla colorazione differenziale con due coloranti fluorescenti, uno dei quali è permeante alle cellule (Hoechst 33342) e l'altro non lo è (ioduro di propidio). La differenza di colorazione consente di discriminare le cellule vive e morte. Il saggio è suscettibile alla microscopia automatizzata e all'analisi delle immagini, che aumenta la produttività e riduce la distorsione. Ciò consente anche di utilizzare il saggio in modo ad alta produttività utilizzando piastre a 96 pozzi, rendendolo un'opzione praticabile per gli sforzi di scoperta di farmaci, in particolare quando i farmaci in questione hanno un certo livello di mitotossicità. È importante sottolineare che i risultati ottenuti dal saggio di colorazione Hoechst/PI mostrano una maggiore consistenza, sia con i risultati dell'esclusione blu del tripano che tra le repliche biologiche quando il saggio viene confrontato con altri metodi.

Introduzione

Il primo passo per identificare trattamenti efficaci contro il cancro è la selezione di un test di citotossicità robusto e imparziale che può essere utilizzato per esaminare l'effetto del trattamento. Una scelta comune per esperimenti a bassa produttività è l'esclusione del colorante blu tripano dalle cellule viventi. Questo metodo è favorito perché consente un metodo relativamente imparziale per quantificare la sopravvivenza cellulare. trypan blue si diffonde passivamente in cellule le cui membrane sono compromesse, ma è effettivamente impedito di entrare nelle cellule sane1. Il quoziente delle cellule viventi e delle cellule totali rappresenta la vitalità percentuale, che indica l'efficacia del trattamento. Lo svantaggio più significativo del test blu del trypan è che è poco adatto per metodologie ad alta produttività. Ha un rapporto segnale-rumore relativamente basso e la colorazione prolungata può causare artefatti a causa della colorazione di cellule vitali. Di conseguenza, l'esclusione blu trypan è in genere, ma nonsempre 2, relegata al conteggio manuale. Questo lo rende troppo lento e introduce la forte possibilità di parzialità a causa del giudizio soggettivo del ricercatore (a meno che non vengano utilizzati conteggi accecante o indipendenti, che riducono ulteriormente la produttività del laboratorio). In generale, la produttività di questo saggio è insufficiente per la moderna scoperta di farmaci.

I test di fattibilità, che generalmente hanno una produttività molto più elevata, consentono ai ricercatori di aggirare questa limitazione, ma sono disponibili con avvertenze significative (vedi tabella 1). Questi metodi generalmente si suddividono in due gruppi. Un gruppo è composto da saggi colorimetrici basati sulla funzione degli enzimi redox cellulari. I substrati incolori o non fluorescenti vengono convertiti in prodotti vibranti quantificabili utilizzando uno spettrofotometro. Esempi classici includono sali di tetrazolio (MTT, WST-1, XTT, ecc.) e resazurina. Questa categoria include anche test luminescenti che utilizzano luciferina per valutare il livello ATP. Saggi di questo tipo hanno la limitazione sottostante che stanno misurando il metabolismo cellulare, che non è la vitalità cellulare di per sé. È abbastanza comune che le cellule diventino quiescenti in condizioni avverse, ma mantengano comunque la capacità didividere 3,4,5. Ad esempio, le cellule staminali tumorali sono spesso relativamente metabolicamente quiescenti6,7,8,9e sono probabilmente difficili da saggiare utilizzando queste tecniche. Anche l'efficacia dei trattamenti che danneggiano la funzione mitocondriale, come la maggior parte dei mitocani, è probabile che sia significativamente sopravvalutata.

Una metodologia alternativa sfrutta le proprietà chimiche di varie sostanze che consentono loro di attraversare o meno membrane biologiche. Un esempio sono le macchie nucleari come SYTOX o propidium iodide (PI). Questa categoria comprende anche saggi simili nel concetto ma diversi nella funzione, come il saggio lattato deidrogenasi (LDH), che misura il rilascio di LDH nell'ambiente extracellulare come indicatore della necrosi cellulare (Figura 1, Tabella 1). Questi test sono più in grado di distinguere tra cellule metabolicamente inattive e morte.

Saggio/coloranteTipi di morte cellulare rilevatiAttrezzature necessarieCaratteristiche principali
MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurina)Apoptosi/NecrosiSpettrofotometroEconomico, rapido; test dell'endpoint; dipende dall'attività degli enzimi (esclusivamente mitocondriale in caso di MTT) e non discrimina tra i modi di morte cellulare1,10
Versione LDHNecrosiSpettrofotometroRapido, indipendente dall'attività degli enzimi mitocondriali; costoso per i test ad alta produttività; rileva cellule necrotiche con membrana plasmatica compromessa11,12
Trypan Blue (TB)Apoptosi/NecrosiMicroscopioImpermeente cellulare; non discrimina tra le modalità di morte cellulare; laborioso e non adatto per lo screening ad alta produttività; più difficile da usare con le cellule aderenti; soggetto a giudizio soggettivo dell'utente, ma è considerato il metodo standard di misurazione della vitalità cellulare13
Arancia acridina (AO)Apoptosi/Necrosi/Microscopio a fluorescenzaUn colorante acido nucleico con proprietà spettrali uniche, può distinguere tra apoptosi e necrosi/necrotosi14
Necroptosi
Hoechst 33342ApoptosiMicroscopio a fluorescenza o citometro a flussoPermeabile alle cellule; inappropriato da solo per monitorare la morte cellulare; utile per la co-colorazione; può essere usato per valutare la condensazione della cromatina e la frammentazione dei nuclei nell'apoptosi precoce; può essere abbinato allo ioduro di propidio per distinguere l'apoptosi dallanecrosi 15,16
Ioduro di propidio (PI)Apoptosi tardiva/NecrosiMicroscopio a fluorescenza o citometro a flussoIntercalatore impermeante cellulare; rileva sia l'apoptosi tardiva che i modi di necrosi della mortecellulare 17. Tossico e permeabile dopo lunghe incubazioni per18

La tabella 1. Lista di test di citotossicità. I test di citotossicità, alcuni dei quali sono stati utilizzati in questo studio, elencati insieme alla breve descrizione delle loro caratteristiche chiave.

Recenti studi hanno dimostrato che il metabolismo mitocondriale è alterato in alcuni tumori19,20,21,22,23,24,25. Ad esempio, le leucemie mieloidi acute (AML) hanno dimostrato di aregolare la loro massa mitocondriale, il contenuto di MTDNA e la respirazione mitocondriale per soddisfare il loro fabbisognoenergetico 19,26,27. D'altra parte, alcuni tumori solidi sono caratterizzati da disfunzione mitocondriale, o meglio "riprogrammazione metabolica", come la deregolamentazione delle proteine mitocondriali coinvolte in OXPHOS o la diminuzione del contenuto di mtDNA, che è stata associata all'invasività tumorale, al potenziale metastatico e alla resistenza ai farmaci che inducono l'apoptosi28,29. Inoltre, recentemente, c'è stato un maggiore interesse nell'uso di composti meccanisticamente diversi che influenzano la funzione mitocondriale (generalmente chiamata mitocani30), come potenziali terapie per particolari tumori. Questi farmaci prendono di mira la sintesi di ATP, il DNA mitocondriale, OXPHOS e la produzione di ROS, nonché proteine pro-apoptotiche e anti-apoptotiche associate ai mitocondri30,31. Diversi studi hanno dimostrato che questo approccio ha una promessasignificativa 19,32,33,34. Tuttavia, queste deviazioni metaboliche nella biologia delle cellule tumorali o nei trattamenti mirati ai mitocondri possono influenzare significativamente i test di vitalità convenzionali basati sulla funzionalità mitocondriale.

Qui viene descritto un protocollo ottimizzato per un saggio differenziale di colorazione nucleare. Il protocollo consente una determinazione rapida e accurata della citotossicità dei mitocani o delle loro combinazioni con altri composti. Hoechst 33342 è un colorante nucleare permeante alle cellule che attraversa facilmente le membrane cellulari per macchiare il DNA, permettendo di ottenere il conteggio totale delle cellule. Co-colorazione con PI, che entra solo nei nuclei di cellule morte, la proporzione di cellule viventi (solo Hoechst) e morte (macchiate con entrambe) cellule può essere determinata con precisione. Questo protocollo affina il saggiopubblicato 35 aggiungendo un passo per l'ottimizzazione della concentrazione di colorante (incrociando i risultati con metodo blu trypan ortogonale) e la centrifugazione della piastra prima dell'imaging. Poiché molte linee cellulari sono semi-aderenti o sospese, la centrifugazione aumenta la proporzione di celle che vengono immagini e migliora fortemente la precisione. Il saggio ha diversi vantaggi, tra cui quella colorazione non richiede la rimozione dei supporti o il lavaggio. La miscela di coloranti è anche economica, facile da preparare e compatibile con i sistemi di pipettazione multicanale / robotica.

Dopo che le celle sono state macchiate, vengono immagini con un microscopio automatizzato. Questo ha l'ulteriore vantaggio di creare una registrazione permanente delle immagini che possono essere ri-analizzate in seguito e gli effetti di particolari composti possono essere rivalutazioneti mediante l'ispezione visiva delle immagini acquisite. Una volta ottenute le immagini, le celle possono essere conteggiate manualmente o utilizzando uno dei diversi pacchetti software, inclusi sia software gratuiti (ad esempio, ImageJ, CellProfiler, ecc.) che commerciali (ad esempio, Metamorph, Gen5, ecc.). Il conteggio automatico delle celle è generalmente preferibile poiché le pipeline automatizzate di conteggio delle celle adeguatamente sviluppate sono più accurate e meno distorte rispetto al conteggio manuale. Ignorano anche in modo più efficace i detriti cellulari o i complessi insolubili. Lo sviluppo di queste tubazioni è generalmente semplice ed è semplificato dall'efficienza delle macchie utilizzate. L'output è quantitativo poiché il numero effettivo di celle morte viene calcolato automaticamente rispetto al numero totale di celle e possono essere applicate soglie diverse per aumentare o diminuire il rigore delrilevamento 35. Per comodità, sono inclusi parametri ottimizzati per il conteggio delle celle che utilizzano il lettore multi-modalità Cytation 5 Cell Imaging compatibile con il software Gen5 v. 3.00.

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Protocollo

1. Test di citotossicità: installazione

  1. Preparare soluzioni di composti di interesse alle concentrazioni desiderate nei mezzi appropriati (senza siero o 1, 2,5 o 5% FBS RPMI-1640).
    1. Per misurare la citotossicità di un singolo composto (ad esempio, per determinare dosi efficaci), preparare composti a concentrazione finale 2x.
    2. Per misurare la citotossicità delle combinazioni di composti, preparare composti a concentrazione finale 4x.
    3. Preparare controlli solo con solvente mescolando la stessa quantità di solvente con il mezzo appropriato. Ad esempio, se i composti di prova sciolti in DMSO e metanolo, effettuare un controllo solo con solvente per ogni solvente.
  2. Raccogliere le cellule dal piatto di coltura o dal pallone in un tubo conico da 15 ml.
  3. Trasferire 10 μL di sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo e macchiare con 10 μL 0,4% di trypan blu. Utilizzare un emocitometro per contare cellule vitali e non vitali per ogni sorgente cellulare.
  4. Celle a pellet a 200 g per 5 min. Aspirato o decantante supernatante.
  5. Resuspend cell pellet in mezzi appropriati per il dosaggio (senza siero o 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) ad una densità cellulare di 3*105 celle/mL.
    NOTA 1: La densità cellulare di 3*105 celle/mL fornisce una densità di semina di 15.000 cellule/pozzo. La densità di semina è un parametro importante e idealmente dovrebbe essere prede definita prima dell'esperimento. La densità di semina dovrebbe tenere conto di 1) dimensione cellulare - di solito le cellule più grandi vengono sementi a una densità inferiore; 2) durata del trattamento - le cellule sono tipicamente sementi a una densità inferiore per esperimenti che dureranno più a lungo; e 3) velocità di divisione cellulare - le cellule con un più alto tasso di divisione sono sementi ad una densità inferiore. Esempi specifici di densità di semina ottimizzate: cellule K562, più grandi, durata 24 ore - 10.000 cellule / pozzo; Cellule MOLM-13, dimensioni moderate, trattamento di 24 ore - 15.000 /pozzo; Cellule MOLM-13, trattamento di 48 ore – 8.000/pozzo; piccole cellule mononucleari sane del sangue periferico (PBPC), trattamento di 24 ore – 50.000/pozzo; cellule AML primarie, trattamento 24 ore su 24 - 15.000-20.000/pozzo.
    NOTA 2: La presenza di FBS nei media può influenzare l'attività dei composti. Ridurre la concentrazione di FBS può semplificare l'interpretazione dei risultati dei test, ma riduce anche l'accuratezza fisiologica.
  6. Seme 50 μL di sospensione cellulare dal passo 1.5 in ogni pozzo di una piastra da 96 potte utilizzando una pipetta multicanale.
  7. Aggiungere composti come segue:
    1. Per i test composti singoli, aggiungere 50 μL di soluzione composta 2x in ogni pozzo. Per i pozzi di controllo del solvente, aggiungere 50 μL di mezzi di prova contenenti il solvente alla concentrazione 2x.
    2. Per i test combinati, aggiungere 25 μL di ciascuno dei composti (soluzioni 4x) in ogni pozzo. Per i singoli pozzi di controllo composto, aggiungere 25 μL di soluzione composta 4x e 25 μL di mezzo di prova. Per i pozzi di controllo del solvente, aggiungere 50 μL di mezzo di prova o mezzo di prova contenente il solvente.
      NOTA 1: La concentrazione finale di DMSO non deve superare lo 0,5%.
      NOTA 2: Si consiglia di aggiungere il supporto contenente i composti con la pipetta che tocca la parete di ogni pozzo a causa del basso volume.
  8. Toccare delicatamente la piastra per garantire la miscelazione del contenuto dei pozzi.
  9. Incubare le piastre a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 per un tempo appropriato, ad esempio 24 ore su 24.

2. Test di citotossicità: colorazione con Hoechst 33342 e ioduro di propidio

  1. Preparare una soluzione di colorazione 10x. Questa soluzione deve essere preparata fresco prima di ogni esperimento, non può essere conservata. Le concentrazioni finali di colorante devono essere determinate prima dell'esperimento.
    1. Per le linee cellulari della leucemia e le cellule primarie di leucemia, 1 mL di tampone di colorazione 10x contiene 10 μL di 20 mM Hoechst 33342 e 50 μL di 1 mg/mL di propididio ioduro in PBS sterile (concentrazioni finali: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).
    2. Per i PBBC sani, 1 mL di tampone di colorazione 10x contiene 10 μL di 20 mM Hoechst 33342 e 10 μL di 1 mg/mL di propididio ioduro in PBS sterile (concentrazioni finali: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL).
      NOTA: La concentrazione finale di ioduro di propidio deve essere determinata prima degli esperimenti. Le cellule devono essere testate utilizzando una gamma di concentrazioni di PI (1, 2,5, 5 μg/mL), quindi la vitalità calcolata da Hoechst/PI deve essere confrontata con la vitalità misurata tramite tripano blu. Le concentrazioni pi sopra elencate sono state scelte in base alla vitalità delle cellule bersaglio nei pozzi di controllo dei supporti (superiore a ~ 90% per le linee cellulari di leucemia, superiore a ~ 70% per i PBPC sani).
      ATTENZIONE: Hoechst 33342 e propidio ioduro sono potenziali cancerogeni. Indossare dispositivi di protezione individuale appropriati durante la loro manipolazione.
  2. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 10 μL di tampone di colorazione 10x a ciascun pozzo.
    NOTA: Per evitare la contaminazione incrociata, assicurarsi che le punte delle pipette non tocchino il supporto.
  3. Toccare delicatamente il piatto per mescolare e cancellare le bolle. Macchia a 37 °C per 15 min.
  4. Centrifugare la piastra a 200 g per 4 minuti per portare tutte le cellule sul fondo della piastra. Pulire con cura il fondo della piastra con un kimwipe umido per rimuovere fibre e / o detriti che interferiranno con l'imaging.
    NOTA 1: La centrifugazione della piastra garantisce le maggiori possibilità che tutte le cellule siano catturate nell'immagine. Spesso le cellule morte si staccano e galleggiano, fornendo valori fuorvianti di citotossicità. La centrifugazione attenua questo effetto.
    NOTA 2: La piastra deve essere stampata il più rapidamente possibile dopo la centrifugazione, idealmente, entro 15 minuti. La centrifugazione può ridurre la selettività della colorazione PI e può consentire alle cellule di accumulare lentamente ioduro di propidio. Il miglioramento della precisione ottenuto visualizzando le cellule morte supera il leggero aumento della colorazione PI. Si consiglia di completare l'imaging entro 1 h dalla centrifugazione.

3. Test di citotossicità: acquisizione dei dati

  1. Impostare il software per l'imager automatizzato microscopio/piastra per rilevare la fluorescenza sia per hoechst 33342 (eccitazione massima 350 nm, emissione massima 461 nm) che PI (eccitazione massima 493 nm, emissione massima 636 nm). Acquisire immagini per ogni pozzo in entrambi i canali.
  2. Utilizzando il software (come CellProfiler, uno studio di analisi delle immagini gratuito basato su MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ o software proprietario come Gen5) contare le celle in ogni pozzo in ogni canale.
    NOTA: Poiché ogni cella deve essere macchiata con Hoechst 33342 e le celle morte devono essere macchiate con PI, il rapporto tra morti e tutti rappresenta la frazione di cellule morte. Ad esempio, se il conteggio automatico nel campione non trattato mostra 467 celle macchiate con PI (celle morte) e 2335 celle macchiate con Hoechst 33342 (celle totali), la frazione morta è dello 0,2 o 20%. Questo valore viene quindi confrontato con un campione gestito in modo identico in cui è stato utilizzato il trattamento.
  3. Descrizione dettagliata dell'acquisizione dei dati Hoechst/PI utilizzando il lettore multimodale Cytation5 Cell Imaging e il software Gen5 v. 3.00:
    1. Impostare il lettore/imager a piastre multimodale Cytation5 su celle di immagine in basso piatto, piastre di plastica nera generiche da 96 pozzi.
    2. Impostare un protocollo di imaging per l'utilizzo dei set di filtri DAPI e Texas Red standard. Scatta immagini al centro del pozzo usando un obiettivo di ingrandimento 4x. Non utilizzare alcun offset (X/Y o Z). Utilizzare le seguenti impostazioni di imaging: DAPI - LED - 10, tempo di integrazione - 99, guadagno - 0; Texas Red - LED - 8, tempo di integrazione - 950, guadagno - 18. Eseguire la messa a fuoco automatica utilizzando il segnale DAPI; non ci dovrebbe essere alcun offset nella messa a fuoco tra i canali.
    3. Eseguire l'analisi delle immagini utilizzando il software Gen5 v 3.00. Nelle impostazioni software, definire le celle come forme tra 5 e 25 μm nelle loro dimensioni. Escludere gli oggetti bordo primario e dividere gli oggetti toccanti attivando l'opzione speciale "Dividi oggetti toccanti".  Elaborare quindi l'immagine per rimuovere lo sfondo (sottrazione di sfondo scura), applicare una maschera nucleare (valore soglia DAPI >= 6000 UA) e contare gli oggetti. Eseguire un'analisi del sottopopolazione basata sulla colorazione PI (valore soglia Texas Red >= 5000 AU) e contare gli oggetti. La percentuale di vitalità delle celle è definita come (1 - figure-protocol-1 .

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Risultati

Il suddetto protocollo è stato sviluppato utilizzando cellule OCI-AML2, che sono state prese come una linea cellulare rappresentativa di leucemia mieloide acuta. L'AML è caratterizzato da una proliferazione anomala di cellule ematopoietiche indifferenziate e non funzionali nel midollo osseo26. Nonostante i recenti sviluppi nella terapia mirata AML, lo standard di cura è rimasto invariato per diversi decenni e consiste in terapia a induzione (tipicamente composta da tre giorni di antraciclina, ad e...

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Discussione

Sebbene il protocollo per il test di citotossicità Hoechst/PI sia robusto e richieda relativamente poco tempo pratico, ci sono diversi dettagli sperimentali che sono molto importanti per garantire risultati accurati. In primo luogo, è essenziale assicurarsi che la concentrazione di DMSO rimanga al di sotto dello 0,5% (v/v). È generalmente riconosciuto che l'esposizione a dosi anche basse di DMSO può alterare sostanzialmente la morfologia e l'attaccamento delle cellule e ritardare significativamente la progressione

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

NVK, uno studioso CPRIT in Ricerca sul Cancro, ringrazia il Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) per il suo generoso sostegno, la sovvenzione CPRIT RR150044. Questo lavoro è stato sostenuto anche dal Welch Foundation Research Grant C-1930 e dal National Institutes of Health R35 GM129294 assegnato alla NVK. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o preparare il manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-Deossi-D-glucosio/2-DGChem-Impex50-519-067
3-bromo-piruvatoAlfa Aesar1113-59-3
Piastre a 96 pozzettiGreiner Bio-One655090Piastre a 96 pozzetti nere o trasparenti a fondo piatto
Reagente per la vitalità cellulare HS blu Alamar (100 ml) Thermo FisherA50101
Contatore di cellule automatizzato Countess IIThermo Fisher
Cytation 5 Cell Imaging Lettore multimodaleBioTek
Hoechst 33342Thermo Fisher6224920 mM soluzione; concentrazione finale 1:1.000
Siero fetale bovino HyCloneGE Healthcare#25-514
m-clorofenilidrazone/CCCPSigma AldrichC2759
Compresse PBSThermo FisherBP29441001 compressa + 200 ml di acqua sterile = 1x soluzione PBS
Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100X)Gibco10378016
Kit di test LDHPierce Thermo Fisher50-103-5952
Ioduro di propidioThermo Fisher50-596-072Polvere secca; stock 1 mg/mL in PBS; concentrazione finale 5 µ g/mL (cellule leucemiche), 1 µ g/mL (PBMC normali)
RotenoneArk PharmAK115691
RPMI-1640 Medium
Con L-glutammina e bicarbonato di sodio, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari		Sigma AldrichR8758-500ML
Tiazoile blue tetrazolium bromideACROS OrganicsAC158990010
Trypan blue color (0,4%)Gibco15250-061
Linee cellulari
K562ATCCCCL-243Linea cellulare LMC
MOLM-13ATCCLinea cellulare AML
MOLT-4ATCCCRL-1582ALL linea cellulare
OCI-AML2Linea cellulare ATCCAML

Riferimenti

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