Il protocollo descrive un saggio rapido, ad alta produttività, affidabile, economico e imparziale per determinare in modo efficiente la vitalità cellulare. Questo saggio è particolarmente utile quando i mitocondri delle cellule sono stati danneggiati, il che interferisce con altri saggi. Il saggio utilizza il conteggio automatizzato delle celle macchiate con due coloranti nucleari: Hoechst 33342 e propidium ioduro.
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Articolo metodologico
Un saggio di colorazione nucleare differenziale automatizzato per una determinazione accurata della citotossicità mitocana
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il contributo dei mitocondri alla trasformazione oncogenica è oggetto di ampio interesse e studio attivo. Man mano che il campo del metabolismo del cancro diventa più complesso, l'obiettivo di colpire i mitocondri usando vari composti che infliggono danni mitocondriali (i cosiddetti mitocani) sta diventando abbastanza popolare. Sfortunatamente, molti saggi di citotossicità esistenti, come quelli a base di sali di tetrazolio o resazurina richiedono enzimi mitocondriali funzionali per le loro prestazioni. Il danno inflitto dai composti che prendono di mira i mitocondri spesso compromette l'accuratezza di questi saggi. Qui descriviamo un protocollo modificato basato sulla colorazione differenziale con due coloranti fluorescenti, uno dei quali è permeante alle cellule (Hoechst 33342) e l'altro non lo è (ioduro di propidio). La differenza di colorazione consente di discriminare le cellule vive e morte. Il saggio è suscettibile alla microscopia automatizzata e all'analisi delle immagini, che aumenta la produttività e riduce la distorsione. Ciò consente anche di utilizzare il saggio in modo ad alta produttività utilizzando piastre a 96 pozzi, rendendolo un'opzione praticabile per gli sforzi di scoperta di farmaci, in particolare quando i farmaci in questione hanno un certo livello di mitotossicità. È importante sottolineare che i risultati ottenuti dal saggio di colorazione Hoechst/PI mostrano una maggiore consistenza, sia con i risultati dell'esclusione blu del tripano che tra le repliche biologiche quando il saggio viene confrontato con altri metodi.
Introduzione
Il primo passo per identificare trattamenti efficaci contro il cancro è la selezione di un test di citotossicità robusto e imparziale che può essere utilizzato per esaminare l'effetto del trattamento. Una scelta comune per esperimenti a bassa produttività è l'esclusione del colorante blu tripano dalle cellule viventi. Questo metodo è favorito perché consente un metodo relativamente imparziale per quantificare la sopravvivenza cellulare. trypan blue si diffonde passivamente in cellule le cui membrane sono compromesse, ma è effettivamente impedito di entrare nelle cellule sane1. Il quoziente delle cellule viventi e delle cellule totali rappresent....
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Protocollo
1. Test di citotossicità: installazione
- Preparare soluzioni di composti di interesse alle concentrazioni desiderate nei mezzi appropriati (senza siero o 1, 2,5 o 5% FBS RPMI-1640).
- Per misurare la citotossicità di un singolo composto (ad esempio, per determinare dosi efficaci), preparare composti a concentrazione finale 2x.
- Per misurare la citotossicità delle combinazioni di composti, preparare composti a concentrazione finale 4x.
- Preparare controlli solo con solvente mescolando la stessa quantità di solvente con il mezzo appropriato. Ad esempio, se i composti di prova sciolti in DMSO e metanolo, effettuare un controllo solo con....
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Risultati
Il suddetto protocollo è stato sviluppato utilizzando cellule OCI-AML2, che sono state prese come una linea cellulare rappresentativa di leucemia mieloide acuta. L'AML è caratterizzato da una proliferazione anomala di cellule ematopoietiche indifferenziate e non funzionali nel midollo osseo26. Nonostante i recenti sviluppi nella terapia mirata AML, lo standard di cura è rimasto invariato per diversi decenni e consiste in terapia a induzione (tipicamente composta da tre giorni di antraciclina, ad e.......
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Discussione
Sebbene il protocollo per il test di citotossicità Hoechst/PI sia robusto e richieda relativamente poco tempo pratico, ci sono diversi dettagli sperimentali che sono molto importanti per garantire risultati accurati. In primo luogo, è essenziale assicurarsi che la concentrazione di DMSO rimanga al di sotto dello 0,5% (v/v). È generalmente riconosciuto che l'esposizione a dosi anche basse di DMSO può alterare sostanzialmente la morfologia e l'attaccamento delle cellule e ritardare significativamente la progressione
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
NVK, uno studioso CPRIT in Ricerca sul Cancro, ringrazia il Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) per il suo generoso sostegno, la sovvenzione CPRIT RR150044. Questo lavoro è stato sostenuto anche dal Welch Foundation Research Grant C-1930 e dal National Institutes of Health R35 GM129294 assegnato alla NVK. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o preparare il manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-Deossi-D-glucosio/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-piruvato | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| Piastre a 96 pozzetti | Greiner Bio-One | 655090 | Piastre a 96 pozzetti nere o trasparenti a fondo piatto |
| Reagente per la vitalità cellulare HS blu Alamar (100 ml) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Contatore di cellule automatizzato Countess II | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Lettore multimodale | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM soluzione; concentrazione finale 1:1.000 |
| Siero fetale bovino HyClone | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-clorofenilidrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| Compresse PBS | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 compressa + 200 ml di acqua sterile = 1x soluzione PBS |
| Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Kit di test LDH | Pierce Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Ioduro di propidio | Thermo Fisher | 50-596-072 | Polvere secca; stock 1 mg/mL in PBS; concentrazione finale 5 µ g/mL (cellule leucemiche), 1 µ g/mL (PBMC normali) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium Con L-glutammina e bicarbonato di sodio, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari | Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Tiazoile blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue color (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Linee cellulari | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | Linea cellulare LMC |
| MOLM-13 | ATCC | Linea cellulare AML | |
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL linea cellulare |
| OCI-AML2 | Linea cellulare ATCC | AML |
Riferimenti
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell ....
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Ristampe e permessi
