Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Natalie Biel; Lauren Figard; Anna Marie Sokac

doi:10.3791/61297

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Articolo metodologico

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

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DOI:

10.3791/61297

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15 maggio 2020

Natalie Biel¹^,² , Lauren Figard³ , Anna Marie Sokac¹^,²^,³

¹Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, ²Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, ³Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è quello di iniettare l'actina globulare coniugata con rhodamina negli embrioni di Drosophila e nell'assemblaggio dell'asta di actina intranucleare dell'immagine a seguito dello stress da calore.

Abstract

Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare le barre di actina intranucleare che si assemblano in embrioni di melanogaster Drosophila vivi a seguito dello stress termico. Le canne Actin sono un segno distintivo di una risposta allo stress actina conservata e induttibile (ASR) che accompagna patologie umane, tra cui la malattia neurodegenerativa. In precedenza, abbiamo dimostrato che l'ASR contribuisce ai fallimenti della morfogenesi e alla ridotta vitalità degli embrioni in via di sviluppo. Questo protocollo consente di continuare lo studio dei meccanismi alla base dell'assemblaggio dell'asta di actina e dell'ASR in un sistema modello altamente suscettibile di imaging, genetica e biochimica. Gli embrioni vengono raccolti e montati su una coverlip per prepararli all'iniezione. L'actina globulare coniugata con rodamina (G-actina^Rossa)viene diluita e caricata in un microneedle. Una singola iniezione viene effettuata al centro di ogni embrione. Dopo l'iniezione, gli embrioni vengono incubati a temperatura elevata e le barre di actina intranucleare vengono quindi visualizzate mediante microscopia confocale. Il recupero della fluorescenza dopo esperimenti di fotobleaching (FRAP) può essere eseguito sulle barre di actina; e altre strutture ricche di actina nel citoplasma possono anche essere immagini. Scopriamo che G-actin^Red polimerizza come l'endogeno G-actina e non interferisce, da solo, con il normale sviluppo embrionale. Una limitazione di questo protocollo è che occorre fare attenzione durante l'iniezione per evitare gravi lesioni all'embrione. Tuttavia, con la pratica, iniettare G-actina^Rossa negli embrioni di Drosophila è un modo rapido e affidabile per visualizzare le aste di actina e può essere facilmente utilizzato con mosche di qualsiasi genotipo o con l'introduzione di altri stress cellulari, tra cui ipossia e stress ossidativo.

Introduzione

Questo protocollo descrive come iniettare G-actin^{Red per} visualizzare l'assemblaggio di barre di actina intranucleare in embrioni stressati dal calore che stanno subendo un'induttibile risposta allo stress actina (ASR)¹. Abbiamo sviluppato questo protocollo per aiutare gli studi dell'ASR, che negli embrioni porta a morfogenesi interrotta e ridotta vitalità, e nei tipi di cellule umane adulte è associato a patologie tra cui insufficienza renale^2,miopatie^{muscolari 3}e morbo di Alzheimer e Huntington^4,^5,^....