Articolo metodologico

Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

4.5K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/61299

⸱

2 luglio 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui viene presentato un protocollo chimicamente definito per la derivazione di podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte ad alta efficienza (>90%) e indipendenti da manipolazioni genetiche o selezione di sottopopolazioni. Questo protocollo produce il tipo di cellula desiderato entro 26 giorni e potrebbe essere utile per i test di nefrotossicità e la modellazione della malattia.

Abstract

La malattia renale colpisce più del 10% della popolazione mondiale e costa miliardi di dollari in spese federali. Le forme più gravi di malattia renale e l'eventuale insufficienza renale allo stadio terminale sono spesso causate dal danno ai podociti glomerulari, che sono le cellule epiteliali altamente specializzate che funzionano insieme alle cellule endoteliali e alla membrana basale glomerulare per formare la barriera di filtrazione del rene. I progressi nella medicina renale sono stati ostacolati dalla limitata disponibilità di tessuti primari e dalla mancanza di metodi robusti per la derivazione di cellule renali umane funzionali, come i podociti. La capacità di derivare podociti da fonti rinnovabili, come le cellule staminali, potrebbe aiutare a far progredire l'attuale comprensione dei meccanismi dello sviluppo e della malattia del rene umano, oltre a fornire nuovi strumenti per la scoperta terapeutica. L'obiettivo di questo protocollo era quello di sviluppare un metodo per derivare podociti maturi e post-mitotici da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPS) con alta efficienza e specificità e in condizioni chimicamente definite. I podociti derivati da cellule hiPS prodotti con questo metodo esprimono marcatori specifici del lignaggio (tra cui nefrina, podocin e tumore di Wilm 1) e mostrano le caratteristiche morfologiche specializzate (compresi i processi primari e secondari del piede) associate ai podociti maturi e funzionali. Curiosamente, queste caratteristiche specializzate sono notevolmente assenti nella linea cellulare di podociti immortalizzati ampiamente utilizzata nel campo, il che suggerisce che il protocollo qui descritto produce podociti renali umani che hanno un fenotipo evolutivamente più maturo rispetto alle linee cellulari podocitarie esistenti tipicamente utilizzate per studiare la biologia renale umana.

Introduzione

I progressi nella coltura di cellule staminali pluripotenti umane sono pronti a rivoluzionare la medicina rigenerativa, la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci fornendo ai ricercatori una fonte rinnovabile e scalabile di materiale biologico che può essere progettato per ottenere quasi tutti i tipi di cellule all'interno del corpo umano1. Questa strategia è particolarmente utile per ricavare tipi di cellule specializzate e funzionali che altrimenti sarebbero difficili da ottenere. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPS)2,3,4,5 sono particolarmente attraenti per la loro origine cellulare somatica e il potenziale che rappresentano per la medicina personalizzata. Tuttavia, lo sviluppo di metodi per derivare altre linee cellulari da cellule hiPS rimane difficile a causa dell'uso frequente di condizioni di coltura scarsamente definite che portano a una bassa efficienza e alla generazione non specifica di popolazioni cellulari eterogenee6,7.

Qui viene presentato un metodo per la derivazione di podociti renali maturi da cellule hiPS con specificità e alta efficienza in condizioni chimicamente definite. Considerando i ruoli di molteplici fattori all'interno del microambiente cellulare, è stata sviluppata una strategia di differenziazione delle cellule staminali che ha comportato l'ottimizzazione dei fattori solubili presentati nel terreno di coltura cellulare e dei fattori insolubili, come componenti della matrice extracellulare o substrati adesivi. Data l'importanza della segnalazione dell'integrina nello sviluppo e nella funzione dei podociti, è stata inizialmente esaminata l'espressione dei recettori dell'integrina sulla superficie cellulare. Le integrine β1 erano altamente espresse non solo nelle cellule hiPS, ma anche nei loro derivati tra cui le cellule mesodermiche e mesodermicheintermedie8,9,10. Esperimenti successivi hanno confermato che i ligandi che si legano alle integrine β1 (incluso il frammento di laminina 511 o la laminina 511-E8) supportano l'adesione e la differenziazione delle cellule hiPS in podociti quando usati in combinazione con il mezzo induttivo solubile descritto di seguito.

L'induzione dell'impegno di lignaggio cellulare è stata avviata confermando innanzitutto che le cellule hiPS coltivate sulle superfici rivestite di laminina per due giorni in presenza di un mezzo contenente Activin A, CHIR99021 e Y27632 Rock inibitore possono differenziarsi in cellule che esprimono i primi marcatori del mesoderma HAND1, goosecoid e brachyury8,11. Il trattamento delle cellule del mesoderma per 14 giorni con un mezzo integrato con proteina morfogenetica ossea 7 (BMP-7) e CHIR99021 ha permesso la derivazione di cellule mesodermiche intermedie che esprimevano i marcatori delle cellule nefrone-progenitrici del tumore di Wilm 1 (WT1), della proteina correlata saltata dispari 1 (OSR1)8,11e della proteina 2 del gene 2 accoppiato (PAX2)12. Per ricavare i podociti glomerulari renali maturi, le cellule mesodermiche intermedie sono state trattate per 4-5 giorni con un nuovo mezzo costituito da BMP-7, Activin A, fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), acidoall-trans retinoico e CHIR99021. La citometria a flusso e l'immunostaining sono state utilizzate per confermare che >90% delle cellule risultanti presentava le caratteristiche molecolari, morfologiche e funzionali del podocita renale maturo8,11,13. Queste caratteristiche includono lo sviluppo di processi del piede primario e secondario; l'espressione di geni specifici del lignaggio podocitario tra cui SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 e l'espressione di proteine tra cui podocin, nefrina e WT114,15,16. Inoltre, è stato scoperto che i podociti derivati dalle cellule hiPS possono essere mantenuti in coltura fino a quattro settimane in vitro utilizzando un mezzodisponibilein commercio 8,11 che fornisce un'ulteriore flessibilità nei tempi degli esperimenti a valle. Per ulteriori informazioni sui pannelli di citometria a flusso utilizzati per determinare la purezza degli hiPS-podociti, fare riferimento alla nostra precedente pubblicazione11.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

  1. Integratore diluito scongelato 5x hiPS cell culture media (CCM) in terreno basale di coltura cellulare hiPS per ottenere una soluzione 1x di hiPS CCM.
    NOTA: L'integratore di CCM 5x hiPS congelato richiede un lento processo di scongelamento, idealmente a 4 °C per la notte. Le aliquote del CCM 1x hiPS possono essere conservate fino a 6 mesi a -20 °C.
  2. Preparazione di piastre a matrice di membrana basale (BM) 1 rivestite per la coltura cellulare hiPS: Scongelare la matrice BM 1 durante la notte su ghiaccio a 4 °C. Una volta scongelate, preparare aliquote con fattori di diluizione appropriati come suggerito dal produttore.
    NOTA: Tipicamente, le aliquote vengono preparate per la successiva diluizione in 25 mL di DMEM/F12 freddo in un tubo conico da 50 mL seguito da un'accurata miscelazione per sciogliere completamente la matrice BM 1 ed evitare la formazione di cristalli residui.
  3. Trasferire 1 mL della soluzione bm matrix 1 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per 1-2 ore o a 4 °C per un minimo di 24 ore, avvolto in un film di paraffina. Le piastre rivestite con matrice BM 1 possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
  4. Preparazione della matrice della membrana basale (BM) 2 - piastre rivestite: diluire quantità appropriate di matrice BM 2 in 9 mL di acqua distillata sterile per preparare una concentrazione finale di 5 μg/mL. Aggiungere 700 μL della soluzione BM matrix 2 a ciascun pozzetti di una piastra da 12 pozzetti e incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore o durante la notte a 4 °C.
  5. Preparare soluzioni stock da 100 μg/mL ciascuna di BMP7, Activin A e VEGF come segue: ricostituire BMP7 in acqua distillata sterile contenente lo 0,1% (wt/vol) di BSA e ricostituire Activin A e VEGF separatamente in PBS sterile contenente lo 0,1% (wt/vol) di BSA. Per evitare frequenti cicli di congelamento-disgelo, preparare aliquote da 100 μL da ciascuna soluzione stock e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
  6. Preparare una soluzione stock da 10 mM di Y27632 sciogliendo 10 mg di Y27632 in 3,079 mL di acqua distillata sterile. Aliquota 100 μL dal magazzino e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
  7. Sciogliere 2 mg di CHIR99021 in 143,4 μL di DMSO sterile per preparare una soluzione madre da 30 mM. Preparare aliquote da 5 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 1 mese (o secondo la raccomandazione del produttore).
  8. Sciogliere 10 mg di acidoall-trans retinoico in 3,33 mL di DMSO sterile. Preparare aliquote da 500 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.

2. Preparazione dei mezzi di coltura

  1. Preparare il mezzo di differenziazione mesoderma ricostituendo le corrispondenti soluzioni stock a una concentrazione finale di 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 e 1x integratore privo di siero B27 in un volume appropriato di DMEM/12 con integratore di glutammina.
    NOTA: Il mezzo di differenziazione del mesoderma deve essere preparato al momento prima delle fasi di differenziazione e ad un volume appropriato per la scala dell'esperimento (in genere, 50 ml di terreno sono adeguati per due piastre da 12 pozzetti).
  2. Preparare il mezzo di differenziazione del mesoderma intermedio ricostituendo le corrispondenti soluzioni stock a una concentrazione finale di 100 ng / mL BMP7, 3 μM CHIR99021 e 1x integratore privo di siero B27 in DMEM / F12 con un integratore di glutammina.
    NOTA: Se necessario, il mezzo può essere integrato con 1% (vol / vol) Penicillina-Streptomicina. Regolare il volume del mezzo utilizzando DMEM / F12 con integratore di glutammina. Questo mezzo può essere preparato in grandi lotti; tuttavia, si raccomanda di conservare in aliquote più piccole (ad esempio, 45 mL in tubi conici da 50 mL) per evitare ripetuti cicli di congelamento-disgelo. Questo supporto può essere conservato a -20 °C per un massimo di 3 mesi e può essere scongelato a 4 °C durante la notte prima dell'uso.
  3. Preparare il mezzo di induzione podocitario ricostituendo a una concentrazione finale 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL activina A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 integratore senza siero e 0,1 μM di acido retinoico all-trans in DMEM/F12 con integratore di glutammina. Proteggere il mezzo dalla luce (ad esempio, avvolgendo il contenitore con carta stagnola).
    NOTA: Questo mezzo può essere preparato in grandi lotti e conservato al buio a -20 °C per un massimo di 3 mesi. Le aliquote congelate devono essere scongelate durante la notte a 4 °C prima dell'uso.
  4. Preparare 25 mL di soluzione neutralizzante di tripsina aggiungendo il 10% (vol/vol) di FBS inattivato al calore in DMEM/F12 e filtrare in condizioni sterili.
  5. Per il mantenimento post-differenziazione dei podociti derivati da cellule staminali, preparare Complete Medium con mezzi di mantenimento podocyte aggiungendo il supplemento al mezzo basale secondo le linee guida del produttore e conservare a 4 °C per un massimo di due settimane.

3. Coltura cellulare hiPS senza alimentatore utilizzando il terreno di coltura cellulare hiPS

  1. Aspirare la soluzione residua di bm matrix 1 dalle piastre preverniciate e lavare i pozzi 3 volte con 1-2 ml di DMEM/F12 riscaldato.
  2. Aspirare hiPS CCM dalle cellule hiPS e risciacquare le cellule 3 volte con DMEM / F12 riscaldato. Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco a cellule calde e incubare per 1 minuto a 37 °C per aiutare a dissociare le cellule. Eseguire l'ispezione visiva delle cellule al microscopio di coltura tissutale e assicurarsi che i bordi delle colonie cellulari appaiano arrotondati, quindi aspirare rapidamente la soluzione di distacco cellulare dalle cellule (assicurandosi che le colonie cellulari siano ancora attaccate alla piastra, anche se in modo approssimativo). Risciacquare delicatamente le cellule una volta con DMEM/F12 per rimuovere la soluzione di distacco cellulare.
  3. Aggiungere 3 ml di hiPS CCM alle cellule hiPS (in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) che sono state trattate con la soluzione di distacco cellulare. Raschiare le colonie usando un sollevatore di cellule e pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per rimuovere le cellule liberamente aderenti. Lavare accuratamente la piastra per assicurarsi che tutte le cellule vengano raccolte.
    NOTA: si consiglia l'uso di una pipetta da 5 ml per evitare un eccessivo taglio sulle cellule.
  4. Trasferire 0,5 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzetti di una nuova matrice BM a 1 piastra a 6 pozzetti rivestita contenente 2 mL di hiPS CCM per pozzetti. Spostare la piastra in modo figura otto per distribuire le colonie cellulari all'interno dei pozzetti e incubare a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5 %. Aggiornare il mezzo ogni giorno fino a quando le cellule sono pronte per essere attraversate o utilizzate per l'esperimento di differenziazione (circa il 70 % di confluenza).
    NOTA: La dimensione ideale della colonia per il passaggio di routine delle iPSC è compresa tra 200-500 μm in condizioni di alimentazione libera utilizzando hiPS CCM (senza inibitore ROCK). Se le cellule vengono individualizzate durante il trattamento con enzimi di dissociazione o tamponi, l'hiPS CCM può essere integrato con l'inibitore ROCK (ad esempio, 10 μM Y27632) per migliorare la vitalità cellulare.

4. Differenziazione delle cellule hiPS in cellule mesodermiche (giorni 0-2)

  1. Mentre le colture cellulari hiPS sono nella fase di crescita esponenziale (approssimativamente entro 4 giorni dalla coltura dopo il passaggio e circa il 70% di confluenza), ispezionare visivamente la presenza di cellule spontaneamente differenziate all'interno e intorno ai bordi delle colonie. Se necessario, raschiare asetticamente le aree di differenziazione.
  2. Aspirare hiPS CCM da cellule hiPS e risciacquare le cellule 3 volte con DMEM / F12 caldo. Incubare le cellule con 1 mL di tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi per 10 minuti a 37 °C e verificare la dissociazione al microscopio. A causa delle differenze intrinseche tra le diverse linee cellulari hiPS, il tempo di incubazione effettivo per il buffer di dissociazione cellulare deve essere determinato per una determinata linea cellulare.
  3. Raschiare delicatamente il pozzetto con un sollevatore di cellule per rimuovere le cellule liberamente aderenti e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml, seguito da pipettare su e giù più volte per individualizzare le cellule hiPS.
    1. Portare la sospensione cellulare al volume di 15 ml con DMEM/F12 caldo e centrifugare per 5 minuti a 290 x g a temperatura ambiente.
    2. Aspirare delicatamente il surnatante e risospenare le cellule con DMEM/F12 caldo per un altro ciclo di centrifugazione per rimuovere la matrice BM residua 1 e i componenti tampone di dissociazione.
  4. Aspirare le cellule surnatante e ripresa in 1 mL di mezzo di induzione del mesoderma come descritto sopra. Contare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore coulter per determinare il volume appropriato del mezzo di differenziazione del mesoderma necessario per raggiungere una concentrazione di 1 x 105 cellule / mL.
  5. Aspirare la soluzione ECM dalle piastre rivestite a matrice BM 2 e risciacquare le piastre due volte con DMEM/F12 caldo. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare hiPS pipettando un paio di volte. Trasferire 1 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzo delle piastre a 12 pozzi rivestite in matrice BM 2 e quindi agitare delicatamente le piastre per distribuire le cellule in modo più uniforme.
  6. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5%. Aggiornare il mezzo di induzione del mesoderma il giorno successivo.
    NOTA: dopo 2 giorni, le cellule mesodermiche derivate dalle cellule hiPS sarebbero pronte per l'induzione del mesoderma intermedio.

5. Differenziazione delle cellule mesodermiche derivate dalle cellule hiPS in mesoderma intermedio (giorni 2-16)

  1. Il giorno 2 del protocollo di differenziazione, aspirare il mezzo di induzione del mesoderma e reintegrare con 1 mL per mezzo di induzione del mesoderma intermedio del pozzo.
  2. Aggiorna il mezzo ogni giorno per mantenere una soglia accurata di fattori di crescita e piccole molecole per le cellule metabolicamente attive. Se c'è una sostanziale crescita cellulare e un rapido esaurimento dei nutrienti dei media (indicato dall'ingiallimento dei mezzi), il volume del mezzo di differenziazione del mesoderma intermedio può essere aumentato a 1,3 ml per pozzo delle 12 piastre del pozzo.
  3. Cellule di coltura per ulteriori 14 giorni per ottenere cellule mesodermiche intermedie. Entro il giorno 16, queste cellule possono essere crioconservate per un uso successivo.

6. Differenziazione delle cellule intermedie del mesoderma derivate dalle cellule hiPS in podociti (giorni da 16 a 21)

  1. Risciacquare le cellule intermedie del mesoderma con DMEM/F12 caldo seguito da incubazione delle cellule con 0,5 mL per pozzet di tripsina-EDTA allo 0,05% per 3 minuti a 37 °C. Eseguire un'ispezione visiva per assicurarsi che le cellule inizino a dissociarsi.
  2. Raschiare le cellule usando un sollevatore di celle e pipettare la sospensione cellulare più volte usando una punta di pipetta da 1.000 μL per ottenere cellule individualizzate (o piccoli grumi di).
    NOTA: In questa fase, assicurarsi che le cellule siano completamente dissociate poiché le cellule aggregate potrebbero non riuscire ad acquisire un fenotipo differenziato terminalmente entro la tempistica del protocollo.
  3. Aggiungere circa 2 ml per pozzet di soluzione neutralizzante di tripsina per fermare l'attività della tripsina.
  4. Trasferire le celle in un tubo conico da 50 mL e portare il volume fino a 50 mL utilizzando DMEM/F12, quindi centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 201 x g a temperatura ambiente.
  5. Aspirare le cellule surnatante e risospende nel mezzo di induzione dei podociti. Per risultati ottimali, garantire una densità di semina finale di circa 100.000 cellule/pozzetti di una piastra da 12 pozzetti. Aggiungere la sospensione cellulare alle piastre rivestite in BM matrix 2 e agitare delicatamente la piastra per aiutare a distribuire le cellule in modo più uniforme.
  6. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 e rinfrescare il mezzo ogni giorno per un massimo di 5 giorni per ottenere podociti entro il giorno 21.
    NOTA: I podociti derivati da cellule hiPS risultanti possono essere mantenuti in coltura per 2-4 settimane aggiuntive utilizzando un mezzo completo con mezzi di mantenimento dei podociti. Una volta in mezzi di mantenimento dei podociti, le cellule possono essere alimentate a giorni alterni e possono essere utilizzate per studi successivi o analisi a valle.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

L'obiettivo di questo protocollo era dimostrare che i podociti umani maturi possono essere derivati da cellule hiPS in condizioni chimicamente definite. I dati presentati in questo manoscritto sono stati generati utilizzando la linea cellulare DU11 hiPS17, che è stata testata per la prima volta e si è scoperta priva di micoplasma. È stata eseguita anche l'analisi cromosomica e le cellule sono risultate essere cariotipicamente normali. Partendo dalle cellule hiPS DU11 indifferenziate, la strategia ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

In questo rapporto, descriviamo un protocollo per la generazione di podociti glomerulari renali da cellule hiPS. I podociti derivati da cellule hiPS presentano caratteristiche morfologiche e molecolari associate al fenotipo13del podocita renale maturo. In precedenti pubblicazioni, abbiamo dimostrato che i podociti derivati dalle cellule hiPS possono imitare la struttura e la funzione di filtrazione selettiva del glomerulo renale quando co-coltivati con cellule endoteliali microvascolari glomerular...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

S.M. è autore di un brevetto in attesa di brevetto per metodi per la generazione di podociti renali da cellule staminali pluripotenti (domanda di brevetto USA 14/950859). Gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla Pratt School of Engineering della Duke University, dalla Division of Nephrology della Duke Medical School, da A Chair's Research Award dal Dipartimento di Medicina della Duke University e da un Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award a S.M.. M.B è stato supportato dal Graduate Research Fellowship Program della National Science Foundation. Ringraziamo il Bursac Lab per averci generosamente fornito la linea di cellule staminali DU11 e il Varghese Lab della Duke University per aver temporaneamente condiviso la loro struttura di coltura tissutale con il nostro gruppo. Questa pubblicazione è dedicata alla Prof.ssa Laura L. Kiessling, Novartis Professor of Chemistry presso il Massachusetts Institute of Technology, per celebrare il suo 60° compleanno.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cells
DU11 cellule iPSLa linea cellulare iPS DU11 (clone #11 della Duke University) è stata generata presso la Duke University iPSC Core Facility e ci ha fornito il Bursac Lab della Duke University. Questa linea è stata testata per il micoplasma ed è stata cariotipizzata l'ultima volta nel luglio 2019 dal nostro laboratorio ed è risultata cariotipicamente normale.
Fattori di crescita e integratori di terreni
forteAll-trans (500 mg)72262Stem Cell Technologies
Integratore senza siero B2717504044Thermo/Life Technologies
CHIR9902104-0004StemgentPuò mostrare variazioni da lotto a lotto
Kit completo di terreno con CultureBoost-R4Z0-500-RSistemi dicelle Terreni di manutenzione dei podociti
DMEM/F1212634028Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 con integratore GlutaMAX10565042Thermo/Life TechnologiesDMEM/F12 con integratore di glutammina
FBS inattivato termicamente10082147Thermo/Life Technologies
Activina umana APHC9564Thermo/Life Tecnologie
BMP7 umanoPHC9544Tecnologie Thermo/Life VEGF
umanoPHC9394Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium05850Stem Cell Technologiesterreni di coltura cellulare hiPS (CCM)
Penicillina... streptomicina, liquida (100&volte;)15140-163Thermo/Life Technologies
Y27632 Inibitore ROCK1254Tocris
Anticorpi
Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 594 anticorpi secondari coniugatiA32744; A32754; A-11076; A32790Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)ab20680Abcam
NephrinGP-N2Progen
OCT4AF1759R& D Systems
PAX271-6000Invitrogen
WT1MAB4234Millipore
ECM Molecole
iMatrix-511 Frammento di laminina-E8 (LM-E8)N-892012Iwai North AmericaMatrice della membrana basale (BM) 2
Matrigel matrice qualificata hESC, fiala da 5 mL354277BD BioscienzeMatrice della membrana basale (BM) 1. Può mostrare variazioni da lotto a lotto
Enzimi e altri reagenti
AccutasiA1110501Thermo/Life TechnologiesSoluzione di distacco cellulare
BSAA9418Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)D2438Sigma-AldrichDMSO è tossico. Deve essere maneggiato in una cappa di sicurezza chimica
Tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi, Hank' Soluzione13150016'etanolo
è infiammabile e tossico
FBS431097Corning
Paraformaldeide (PFA)28906Thermo/Life TechnologiesIl PFA deve essere maneggiato in una cappa chimica con adeguati dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Evitare l'inalazione e il contatto con la pelle.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)14190-250Thermo/Life Technologies
Acqua distillata sterile15230162Thermo/Life Technologies
Triton X-10097062-208VWR
Tripsina-EDTA, 0,05%25300-120Thermo/Life Technologies
Equipment
Pipette di aspirazione, confezionate singolarmente29442-462Centrifuga Corning
Avanti J-15RB99516Beckman Coulter
Provetta da centrifuga conica, 15 mL352097Provetta da centrifuga conica Corning
, 50 mL352098Corning
Cryobox3395465Tecnologie Thermo/Life Perla conservazione di prodotti congelati aliquote
EVOS M7000AMF7000Thermo/Life TechnologiesMicroscopio fluorescente utilizzato per acquisire immagini di cellule iPS fissate e colorate e dei loro derivati
Emocitometro100503-092VWR
Heracell VIOS 160i Incubatore a CO251030403Thermo/Life TechnologiesPer la coltura e la manutenzione di routine di cellule iPS e loro derivati
Osservatore Zeiss Axio invertito dotato di fotocamera AxioCam 503491916-0001-000 (microscopio) ; 426558-0000-000 (fotocamera)Microscopia Carl ZeissUtilizzato per acquisire immagini a contrasto di fase di cellule iPS vive e dei loro derivati in ogni fase della differenziazione dei podociti
Guanti in nitrile Kimberly-Clark40101-346VWR
Kimwipes, grandi21905-049VWR
Kimwipes, piccoli21905-026Puntali
P10P1096-FRDenville Scientific
P100P1125Denville Scientific
P1000P1126Denville Scientific
P20P1121Puntali
P200P1122Denville Scientific
, 10 mL, confezionata singolarmente356551Pipetta
, 25 mL, confezionatasingolarmente 356525Pipetta
, 5 mL, confezionata singolarmente356543Corning
Steriflip, 0,22 μ m, PESSCGP00525EMD Millipore
1138W14Thomas ScientificPer aliquotare fattori
di crescita Coltura tissutale– piastre a 12 pozzetti trattate353043coltura di tessuti Corning
... piastre a sei pozzetti trattate353046Corning
VWR camice da laboratorio techuni bianco10141-342VWR
Sollevatore di celle ad ampia smussatura3008Corning
umane di etanolo, 70% (vol/vol), grado biotecnologico 97065-058 VWR L per pipette barriera di precisione VWR Puntali per pipette barriera Puntali per pipette barriera Puntali per pipette barriera per pipette barriera Denville Scientific Pipetta sierologica sierologica Corning sierologica Corning sterile provette per microcentrifuga

Riferimenti

  1. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145(1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
  8. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
  9. Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
  10. Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
  11. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).
  12. Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
  13. Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
  14. Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
  15. Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
  16. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
  17. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825(2017).
  18. Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
  19. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  20. Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
  21. Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
  22. Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
  23. Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
  24. Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
  25. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cellule iPS umanedifferenziamento dei podocitiinduzione del mesodermamesoderma intermediomatrice della membrana basaleespressione della nefrinaespressione della podocinamarker WT1processi pedicellari

Articoli correlati