Qui viene presentato un protocollo chimicamente definito per la derivazione di podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte ad alta efficienza (>90%) e indipendenti da manipolazioni genetiche o selezione di sottopopolazioni. Questo protocollo produce il tipo di cellula desiderato entro 26 giorni e potrebbe essere utile per i test di nefrotossicità e la modellazione della malattia.
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Articolo metodologico
Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malattia renale colpisce più del 10% della popolazione mondiale e costa miliardi di dollari in spese federali. Le forme più gravi di malattia renale e l'eventuale insufficienza renale allo stadio terminale sono spesso causate dal danno ai podociti glomerulari, che sono le cellule epiteliali altamente specializzate che funzionano insieme alle cellule endoteliali e alla membrana basale glomerulare per formare la barriera di filtrazione del rene. I progressi nella medicina renale sono stati ostacolati dalla limitata disponibilità di tessuti primari e dalla mancanza di metodi robusti per la derivazione di cellule renali umane funzionali, come i podociti. La capacità di derivare podociti da fonti rinnovabili, come le cellule staminali, potrebbe aiutare a far progredire l'attuale comprensione dei meccanismi dello sviluppo e della malattia del rene umano, oltre a fornire nuovi strumenti per la scoperta terapeutica. L'obiettivo di questo protocollo era quello di sviluppare un metodo per derivare podociti maturi e post-mitotici da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPS) con alta efficienza e specificità e in condizioni chimicamente definite. I podociti derivati da cellule hiPS prodotti con questo metodo esprimono marcatori specifici del lignaggio (tra cui nefrina, podocin e tumore di Wilm 1) e mostrano le caratteristiche morfologiche specializzate (compresi i processi primari e secondari del piede) associate ai podociti maturi e funzionali. Curiosamente, queste caratteristiche specializzate sono notevolmente assenti nella linea cellulare di podociti immortalizzati ampiamente utilizzata nel campo, il che suggerisce che il protocollo qui descritto produce podociti renali umani che hanno un fenotipo evolutivamente più maturo rispetto alle linee cellulari podocitarie esistenti tipicamente utilizzate per studiare la biologia renale umana.
Introduzione
I progressi nella coltura di cellule staminali pluripotenti umane sono pronti a rivoluzionare la medicina rigenerativa, la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci fornendo ai ricercatori una fonte rinnovabile e scalabile di materiale biologico che può essere progettato per ottenere quasi tutti i tipi di cellule all'interno del corpo umano1. Questa strategia è particolarmente utile per ricavare tipi di cellule specializzate e funzionali che altrimenti sarebbero difficili da ottenere. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPS)2,3,
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
- Integratore diluito scongelato 5x hiPS cell culture media (CCM) in terreno basale di coltura cellulare hiPS per ottenere una soluzione 1x di hiPS CCM.
NOTA: L'integratore di CCM 5x hiPS congelato richiede un lento processo di scongelamento, idealmente a 4 °C per la notte. Le aliquote del CCM 1x hiPS possono essere conservate fino a 6 mesi a -20 °C. - Preparazione di piastre a matrice di membrana basale (BM) 1 rivestite per la coltura cellulare hiPS: Scongelare la matrice BM 1 durante la notte su ghiaccio a 4 °C. Una volta scongelate, preparare aliquote con fattori di diluizione appropriati come suggerito dal produttore....
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Risultati
L'obiettivo di questo protocollo era dimostrare che i podociti umani maturi possono essere derivati da cellule hiPS in condizioni chimicamente definite. I dati presentati in questo manoscritto sono stati generati utilizzando la linea cellulare DU11 hiPS17, che è stata testata per la prima volta e si è scoperta priva di micoplasma. È stata eseguita anche l'analisi cromosomica e le cellule sono risultate essere cariotipicamente normali. Partendo dalle cellule hiPS DU11 indifferenziate, la strategia .......
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Discussione
In questo rapporto, descriviamo un protocollo per la generazione di podociti glomerulari renali da cellule hiPS. I podociti derivati da cellule hiPS presentano caratteristiche morfologiche e molecolari associate al fenotipo13del podocita renale maturo. In precedenti pubblicazioni, abbiamo dimostrato che i podociti derivati dalle cellule hiPS possono imitare la struttura e la funzione di filtrazione selettiva del glomerulo renale quando co-coltivati con cellule endoteliali microvascolari glomerular.......
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Dichiarazioni
S.M. è autore di un brevetto in attesa di brevetto per metodi per la generazione di podociti renali da cellule staminali pluripotenti (domanda di brevetto USA 14/950859). Gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Pratt School of Engineering della Duke University, dalla Division of Nephrology della Duke Medical School, da A Chair's Research Award dal Dipartimento di Medicina della Duke University e da un Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award a S.M.. M.B è stato supportato dal Graduate Research Fellowship Program della National Science Foundation. Ringraziamo il Bursac Lab per averci generosamente fornito la linea di cellule staminali DU11 e il Varghese Lab della Duke University per aver temporaneamente condiviso la loro struttura di coltura tissutale con il nostro gruppo. Questa pubblicazione è dedicata alla ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cells | |||
| DU11 cellule iPS | La linea cellulare iPS DU11 (clone #11 della Duke University) è stata generata presso la Duke University iPSC Core Facility e ci ha fornito il Bursac Lab della Duke University. Questa linea è stata testata per il micoplasma ed è stata cariotipizzata l'ultima volta nel luglio 2019 dal nostro laboratorio ed è risultata cariotipicamente normale. | ||
| Fattori di crescita e integratori di terreni | |||
| forteAll-trans (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| Integratore senza siero B27 | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | Può mostrare variazioni da lotto a lotto |
| Kit completo di terreno con CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Sistemi di | celle Terreni di manutenzione dei podociti |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 con integratore GlutaMAX | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 con integratore di glutammina |
| FBS inattivato termicamente | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Activina umana A | PHC9564 | Thermo/Life Tecnologie | |
| BMP7 umano | PHC9544 | Tecnologie Thermo/Life VEGF | |
| umano | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | terreni di coltura cellulare hiPS (CCM) |
| Penicillina... streptomicina, liquida (100&volte;) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 Inibitore ROCK | 1254 | Tocris | |
| Anticorpi | |||
| Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 594 anticorpi secondari coniugati | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R& D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecole | |||
| iMatrix-511 Frammento di laminina-E8 (LM-E8) | N-892012 | Iwai North America | Matrice della membrana basale (BM) 2 |
| Matrigel matrice qualificata hESC, fiala da 5 mL | 354277 | BD Bioscienze | Matrice della membrana basale (BM) 1. Può mostrare variazioni da lotto a lotto |
| Enzimi e altri reagenti | |||
| Accutasi | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Soluzione di distacco cellulare |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO è tossico. Deve essere maneggiato in una cappa di sicurezza chimica |
| Tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi, Hank' Soluzione | 13150016'etanolo | ||
| è infiammabile e tossico | |||
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldeide (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | Il PFA deve essere maneggiato in una cappa chimica con adeguati dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Evitare l'inalazione e il contatto con la pelle. |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Acqua distillata sterile | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Tripsina-EDTA, 0,05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Pipette di aspirazione, confezionate singolarmente | 29442-462 | Centrifuga Corning | |
| Avanti J-15R | B99516 | Beckman Coulter | |
| Provetta da centrifuga conica, 15 mL | 352097 | Provetta da centrifuga conica Corning | |
| , 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryobox | 3395465 | Tecnologie Thermo/Life Per | la conservazione di prodotti congelati aliquote |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Microscopio fluorescente utilizzato per acquisire immagini di cellule iPS fissate e colorate e dei loro derivati |
| Emocitometro | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i Incubatore a CO2 | 51030403 | Thermo/Life Technologies | Per la coltura e la manutenzione di routine di cellule iPS e loro derivati |
| Osservatore Zeiss Axio invertito dotato di fotocamera AxioCam 503 | 491916-0001-000 (microscopio) ; 426558-0000-000 (fotocamera) | Microscopia Carl Zeiss | Utilizzato per acquisire immagini a contrasto di fase di cellule iPS vive e dei loro derivati in ogni fase della differenziazione dei podociti |
| Guanti in nitrile Kimberly-Clark | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, grandi | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, piccoli | 21905-026 | Puntali | |
| P10 | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 | P1121 | Puntali | |
| P200 | P1122 | Denville Scientific | |
| , 10 mL, confezionata singolarmente | 356551 | Pipetta | |
| , 25 mL, confezionata | singolarmente 356525 | Pipetta | |
| , 5 mL, confezionata singolarmente | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0,22 μ m, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| 1138W14 | Thomas Scientific | Per aliquotare fattori | |
| di crescita Coltura tissutale– piastre a 12 pozzetti trattate | 353043 | coltura di tessuti Corning | |
| ... piastre a sei pozzetti trattate | 353046 | Corning | |
| VWR camice da laboratorio techuni bianco | 10141-342 | VWR | |
| Sollevatore di celle ad ampia smussatura | 3008 | Corning |
Riferimenti
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L.
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Ristampe e permessi
