Questo protocollo descrive una nuova tecnica di misurazione dei tre parametri più importanti della lesione cerebrale ischemica sullo stesso set di campioni cerebrali di roditori. L'uso di un solo campione cerebrale è altamente vantaggioso in termini di costi etici ed economici.
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Articolo metodologico
Misurazione dell'edema cerebrale post-ictus, della zona infarct e della rottura della barriera ematica-encefalica in un singolo set di campioni cerebrali dei roditori
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una delle cause più comuni di morbilità e mortalità in tutto il mondo è l'ictus ischemico. Storicamente, un modello animale utilizzato per stimolare l'ictus ischemico coinvolge l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO). Zona infarct, edema cerebrale e rottura della barriera ematico-encefalica (BBB) sono misurati come parametri che riflettono l'entità della lesione cerebrale dopo MCAO. Una limitazione significativa a questo metodo è che queste misurazioni sono normalmente ottenute in diversi campioni di cervello di ratto, portando a oneri etici e finanziari dovuti al gran numero di ratti che devono essere eutanasiati per una dimensione del campione appropriata. Qui presentiamo un metodo per valutare con precisione le lesioni cerebrali dopo MCAO misurando la zona infarct, l'edema cerebrale e la permeabilità BBB nello stesso set di cervelli di ratto. Questa nuova tecnica fornisce un modo più efficiente per valutare la fisiopatologia dell'ictus.
Introduzione
Una delle cause più comuni di morbilità e mortalità in tutto il mondo è l'ictus. A livello globale, l'ictus ischemico rappresenta il 68% di tutti i casi di ictus, mentre negli Stati Uniti l'ictus ischemico rappresenta l'87% dei casidi ictus 1,2. Si stima che l'onere economico dell'ictus raggiunga i 34 miliardi di dollari negli StatiUniti 2 e 45 miliardi di euro nell'Unione europea3. I modelli animali di ictus sono necessari per studiarne la fisiopatologia, sviluppare nuovi metodi di valutazione e proporre nuove opzioni terapeutiche4.
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Protocollo
Secondo le raccomandazioni della dichiarazione di Helsinki e di Tokyo e degli orientamenti per l'impiego di animali da esperimento della Comunità europea, sono state condotte le seguenti procedure. Gli esperimenti sono stati approvati anche dal Comitato per la cura degli animali dell'Università Ben-Gurion del Negev.
1. Preparazione dei ratti alla procedura sperimentale
- Selezionare ratti maschi adulti Sprague-Dawley senza patologia troppo grave, ognuno del peso compreso tra 300 e 350 g.
- Mantenere tutti i ratti a temperatura ambiente a 22 °C, con 12 ore di cicli di luce e buio prima dell'esperimento.
- Assicurarsi ....
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Risultati
Misurazione della zona infarto
Un test t a campione indipendente ha indicato che 19 ratti sottoposti a MCAO permanente hanno dimostrato un aumento significativo del volume di infarto cerebrale rispetto ai 16 ratti sottoposti a sham (MCAO =7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (cfr. figura 2A)). I dati sono espressi come percentuale media dell'emisfero ± SD.
Misurazio.......
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Discussione
L'obiettivo principale del presente protocollo era quello di dimostrare misurazioni coerenti di tre parametri principali della lesione ischemica: permeabilità IZ, BE e BBB. Studi precedenti in questo campo hanno dimostrato la possibilità di eseguire uno o due di questi parametri insieme nello stesso campione. Oltre alla riduzione dei costi offerta da questo metodo in tre parti, fornisce anche un modello bioetico più desiderabile che limita il numero di animali che devono essere utilizzati e successivamente eutanasiati. C.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko ed Evgenia Goncharyk del Dipartimento di Fisiologia, Facoltà di Biologia, Ecologia e Medicina, Oles Honchar, Università Dnipro, Dnipro, Ucraina per il loro sostegno e contributi utili alle nostre discussioni. I dati ottenuti fanno parte della tesi di dottorato di Ruslan Kuts.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 2 mL | Braun | 4606027V | |
| 2% di clorexidina in soluzione alcolica al 70% | Sigma-Aldrich | 500 cc | Fornisce un'antisepsi generale della pelle in campo operatorio |
| Ago da 27 G con siringa | Braun | 305620 | |
| 3-0 Suture di seta | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Sutura in nylon | 4-00 | ||
| Cervello & Matrici tissutali | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | ||
| Centrifuga Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Bilance analitiche compatte | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Bilancia digitale | Sigma-Aldrich | Rs 4.000 | |
| Forbici | da dissezionePipetta Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| provetta Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Rivelatore di fluorescenza | Tecan, Mä nnedorf Svizzera | Modello: Lettore multimodale Infinite 200 PRO | Opzionale. |
| Rivelatore di fluorescenza | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Lettore di micropiastre multimodale Strumento di base | opzionale. |
| Spugne di garza | Fisher | 22-362-178 | |
| Riscaldatore con termometro | Heatingpad-1 | Modello: HEATINGPAD-1/2 | |
| Microclip emostatiche | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Bracciale per infusione | ABN | IC-500 | |
| Micro pinze | Sigma-Aldrich | ||
| Micro forbici | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscopio | Olympus | ||
| Pinze operatorie | Sigma-Aldrich | ||
| Forbici operative | Sigma-Aldrich | ||
| Scanner ottico | Canon | Cano Scan 4200F | Risoluzione 3200 x 6400 dpi |
| Piastre di Petri | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Il cibo da laboratorio per roditori somministrato a ratti, topi e criceti è un alimento del ciclo di vita che è stato utilizzato nella ricerca biomedica per oltre 5 decenni. Fornito ai ratti ad libitum in questo esperimento. |
| Gabbie per ratti | Techniplast | 2000P | Alloggiamento convenzionale per roditori. Le gabbie sono state utilizzate per alloggiare i ratti durante l'esperimento |
| Lame per bisturi #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 per Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | Il codice sorgente è disponibile gratuitamente. L'autore, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), lavora presso il Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Office 365 ProPlus | Microsoft-Microsoft | Office Excel | |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| Cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% acido tricloroacetico | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Etanolo 96 % | Romico | Liquido infiammabile | |
| blu di Evans 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurano, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
Riferimenti
- Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
- Benjamin, E. J., et al.
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Ristampe e permessi
