Articolo metodologico

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

DOI:

10.3791/61315

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2 aprile 2021

 ,  ,  ,  , 
1ITAV-CNRS, Université de Toulouse, CNRS, Toulouse, France, 2LAAS-CNRS, Université de Toulouse, CNRS, Toulouse, France, 3ENCB, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Mexico City, Mexico, 4TBI, Université de Toulouse, CNRS, INRA, INSA, Toulouse, France, 5CIC, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Mexico City, Mexico

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo mira ad automatizzare le misurazioni AFM su centinaia di cellule microbiche. In primo luogo, i microbi vengono immobilizzati nelle microstrutture di francobolli PDMS e quindi le misurazioni della spettroscopia di forza vengono eseguite automaticamente su centinaia di cellule immobilizzate.

Abstract

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Il metodo presentato in questo documento mira ad automatizzare gli esperimenti Bio-AFM e la registrazione delle curve di forza. Utilizzando questo metodo, è possibile registrare automaticamente le curve di forza su 1000 celle in 4 ore. Per mantenere un tempo di analisi di 4 ore, il numero di curve di forza per cella viene ridotto a 9 o 16. Il metodo combina un programma basato su Jython e una strategia per assemblare celle su modelli definiti. Il programma, implementato su un Bio-AFM commerciale, può centrare la punta sulla prima cella dell'array e quindi spostarsi, automaticamente, da cella a cella durante la registrazione delle curve di forza su ogni cella. Utilizzando questa metodologia, è possibile accedere ai parametri biofisici delle cellule come la loro rigidità, le loro proprietà adesive, ecc. Con l'automazione e il gran numero di celle analizzate, si può accedere al comportamento della popolazione cellulare. Si tratta di una svolta nel campo bio-AFM, dove finora sono stati registrati dati solo su poche decine di cellule.

Introduzione

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Questo lavoro fornisce una metodologia per eseguire misurazioni automatiche della forza su centinaia di cellule viventi utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM). Fornisce anche un metodo per immobilizzare i microbi su un timbro microstrutturato PDMS compatibile con gli esperimenti AFM condotti in un ambiente liquido.

Bio-AFM è una tecnologia altamente specializzata concepita per applicazioni in biologia e poi utilizzata per studiare le cellule viventi. Richiede un ingegnere addestrato in grado di analizzare una cella alla volta. In queste condizioni, il numero di cellule diverse che possono essere analizzate è piuttosto piccolo, tip....

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Protocollo

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1. Coltura cellulare microbica

  1. Ravvivare le cellule da un calcio di glicerolo.
    NOTA: Gli albicani C. sono conservati a -80 °C in scorte di glicerolo, su marmi.
    1. Raccogliere un marmo nel ceppo di -80 °C e strofinarlo sull'agar peptone destrosio di lievito (YPD). Coltivare le cellule per 2 giorni a 30 °C, prima della coltivazione liquida.
  2. Preparare colture liquide.
    1. Riempire un tubo di coltura con 5 ml di brodo sterile YPD e aggiungere una singola colonia di cellule C. albicans, coltivate sulla piastra di agar YPD.
    2. Coltivare la coltura in condizioni statiche a 30 °C per 20 ore prima della rac....

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Risultati

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Abbiamo usato il protocollo descritto per analizzare l'effetto della caspofungina sulle proprietà biofisiche dell'agente patogeno umano opportunistico C. albicans nella sua forma di lievito. Caspofungin è un'ultima molecola antimicotico utilizzata quando altri farmaci sono inefficaci a causa dei meccanismi di resistenza che le cellule sviluppano verso gli antifungini. Il suo meccanismo d'azione si basa sull'inibizione della subunità Fks2 del complesso fks1/Fks2 responsabile della sintesi ß glucano. Poiché i gluc.......

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Discussione

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Il principale miglioramento fornito da questa metodologia è un aumento significativo del numero di cellule misurate in un determinato lasso di tempo. La controparte è una riduzione del numero di punti misurati per cella. Significa che questo metodo non è progettato per fornire un'analisi dettagliata di una singola cella. Il metodo si applica solo alle celle che possono essere adatte ai pozzi del timbro PDMS. Il timbro è abbastanza versatile, mentre contiene pozzi di 1,5 x 1,5 μm2 fino a 6 x 6 μm2. T.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Vogliamo riconoscere FONCYCYT di CONACYT (Messico), il Ministero degli Affari Esteri della Francia e l'Université Paris 13, anche se il supporto finanziario del progetto collaborativo internazionale ECOS-NORD ha nominato Nano-palpazione per la diagnosi, n. 263337 (Messico) e MI5P02 (Francia). AMR desidera ringraziare il sostegno finanziario di SIP-IPN attraverso il progetto n. 20195489. SPC è supportata da una borsa di dottorato di CONACYT (n. 288029) e IPN attraverso l'accordo cotutelle per ottenere un doppio certificato di dottorato (IPN-UPS). ED e CFD sono ricercatori del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AFM cantileverBruker AFM sondeMLCTI cantilever utilizzati erano i etichettati " C” con frequenza di risonanza da 7 a 10 kHz e k: 0,01 N/m
Analisi dei dati AFMJPK-BrukerJPK Versione di elaborazione dati minimo 5.1.8Può essere scaricato da un utente JPK-Bruker acount
AFM Piastre di PetriWPIFluoroDish FD35-100Il riscaldatore è stato utilizzato per monitorare le variazioni di temperatura durante l'esperimento
Microscopio a forza atomica (AFM)JPK-BrukerNanowizard II o IIIl'AFM deve essere montato su un microscopio ottico invertito con tavolino motorizzato
CaspofunginSigma-AldrichSML0425-5MGCaspofungin è stato utilizzato con una concentrazione di 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)
Editor di codiceMicrosoftVisual Studio Code versione 1.40.1https://code.visualstudio.com/
CryobeadsIFUCB12
Essiccatore/Degasaggio cameraFisherbrand15594635L'apparecchiatura viene utilizzata per degassare i timbri PDMS per circa 50 minuti, qualsiasi essiccatore accoppiato con una pompa a vuoto andrà bene.
Riscaldatore per piastre PetriJPK-BrukerPetriDishHeaterQuesto è un componente aggiuntivo del JPK/Bruker AFM. Il riscaldatore è stato utilizzato per monitorare le variazioni di temperatura durante l'esperimento
Tampone acetato di sodio pH 5.2Sigma-AldrichS7899La soluzione contiene 18 mM di acetato di sodio, 1 mM di CaCl2 e 1 mM di MnCl2. Regolare il pH con acido acetico glaciale. La soluzione può essere conservata a 4 gradi C per 2 mesi
Linguaggio di analisi statisticahttps://www.r-project.orgR versione 3.6.1R è un linguaggio e un ambiente per il calcolo statistico e la grafica. Si tratta di un progetto GNU che è simile al linguaggio S e all'ambiente
Software di analisi statisticahttps://rstudio.comR studio versione 1.1.463collaborazione tra la R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP e altri. RStudio e Shiny sono progetti affiliati della Foundation for Open Access Statistics
Sylgard 184Sigma-Aldrich761028Polidimetilsilossano (PDMS) e agente indurente in un unico set
Lievito Peptone D BrodoDifco242820
YPD AgarDifcoDF0427-17-6

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  2. Dague, E., et al.

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