L'obiettivo di questo protocollo è mostrare l'assemblaggio di una nanomatrice biomimetica (NM) con nanotubi di base Janus (JBNT) e fibronectina (FN). Quando sono co-coltivate con cellule staminali mesenchimali umane (hSPC), le TM mostrano un'eccellente bioattività nell'incoraggiare l'adesione degli HMSC.
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Articolo metodologico
Fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per l'adesione delle cellule staminali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una MN biomimetica è stata sviluppata per fungere da impalcatura biologica di ingegneria tissutale, che può migliorare l'ancoraggio delle cellule staminali. La MN biomimetica è formata da JBNT e FN attraverso l'auto-assemblaggio in una soluzione acquosa. I JBNT misurano 200-300 μm di lunghezza con canali cavi idrofobici interni e superfici idrofile esterne. I JBNT sono caricati positivamente e le FN sono addebitate negativamente. Pertanto, quando iniettati in una soluzione acquosa neutra, vengono legati insieme tramite incollaggio non covalente per formare i fasci di MN. Il processo di auto-assemblaggio viene completato in pochi secondi senza alcun iniziatore chimico, fonte di calore o luce UV. Quando il pH della soluzione NM è inferiore al punto isoelettrico delle FN (pI 5.5-6.0), i bundle nm si auto-rilasciano a causa della presenza di FN caricato positivamente.
La MN è nota per imitare morfologicamente la matrice extracellulare (ECM) e quindi può essere utilizzata come impalcatura iniettabile, che fornisce un'eccellente piattaforma per migliorare l'adesione hMSC. L'analisi della densità cellulare e gli esperimenti di imaging a fluorescenza hanno indicato che gli NMS hanno aumentato significativamente l'ancoraggio degli HMS rispetto al controllo negativo.
Introduzione
Le cellule staminali mesenchimali umane (hSPC) hanno mostrato il potenziale di auto-rinnovamento e auto-differenziazione lungo diversi lignaggi mesenchimali, il che aiuta nella rigenerazione e nel mantenimento dei tessuti1. In base al potenziale di differenziazione, gli hMSC sono considerati candidati per lesioni mesenchimali del tessuto e terapia del disturbo ematopoietico2. hSPC hanno dimostrato la capacità di promuovere la guarigione delle ferite aumentando la riparazione dei tessuti, l'angiogenesi e riducendo l'infiammazione3. Tuttavia, senza assistenza biochimica o biomateriale, l'efficienza ....
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Protocollo
1. Sintesi dei JBNT
NOTA: Il monomero JBNT è stato preparato come pubblicato in precedenza11.
- Sintesi del composto A1
- Preparare una soluzione contenente 8,50 g di acido 2-cianoacetico e 9,80 g di etilcarbamato in 25 mL di toluene e 2,5 mL di N, N-dimetilformamide. Aggiungere 4,90 mL di cloruro di fosforile dropwise. Quindi scaldare la miscela a 70 °C e continuare a mescolare per 1,5 ore.
- Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente e versare 100 g di acqua ghiacciata. Estrarre lo strato acquoso con acetato di etile (3 x 250 mL) e lavare con 100 mL di salamoia. Asciugare lo st....
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Risultati
I nostri studi hanno scoperto che la formazione della MN di JBNT e FN è veloce, cosa che è avvenuta in 10 secondi. Come illustrato nella figura 2, il floccule bianco è stato ottenuto quando la soluzione JBNT è stata miscelata con la soluzione FN e pipettata più volte. Il processo di formazione della MN è completamente biomimetico. Non sono necessari stimoli esterni. Il processo di fabbricazione è molto più facile di quello di alcuni biomateriali emergenti, che si basa sulla luce ultraviolett.......
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Discussione
In questo studio, abbiamo sviluppato una MN biomimetica auto-assemblata, che è stata formata con JBNT e FN ispirati al DNA. Durante la preparazione della soluzione JBNT, la polvere liofilizzata JBNT deve essere sciolta nell'acqua al posto del PBS perché pbs causerà l'agglomerazione di JBNT, che inibisce il loro assemblaggio. Inoltre, la MN dovrebbe anche essere assemblata in acqua se vogliamo osservare le strutture nano-fibrille della MN, perché il sale in PBS si impacchelerà con le fibre nm, il che può ridurre notevolme.......
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Dichiarazioni
Il Dr. Yupeng Chen è co-fondatore di NanoDe Therapeutics, Inc.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto finanziariamente da NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) e University of Connecticut.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-dicloroetano | Alfa Aesar | 39121 | |
| acido 2-cianoacetico | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-dimetilamminopiridina | TCI America | D1450 | |
| 8 pozzetti Coverglass a camera | Thermo Fisher | 155409 | |
| piastra a 96 pozzetti | Corning | 353072 | |
| etanolo | assolutoThermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allilamina | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Detergente al plasma di base | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citrico | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrato acido cloridrico | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Acqua deionizzata | Thermo Fisher | 15230147 | |
| diclorometano | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| etere etilico | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-terz-butil dicarbonato | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| acetato di etile | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| etilcarbammato | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectina | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Soluzione fissativa (4% formaldeide preparata in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinio cloridrato | Alfa Aesar | A13543 | |
| esani | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| umano cellule staminali mesenchimali | Lonza | PT-2501 | |
| metanolo | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| ioduro di metile | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-diisopropiletilammina | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimetilformammide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-metilmorfolina N-ossido | Alfa Aesar | A19802 | |
| Tetraossido di osmio | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Soluzione tampone fosfato | Thermo Fisher | 20012050 | |
| cloruro di fosforile | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| Carbonato di potassio | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| colonna di fase inversa | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Budamina Falloidina | Thermo Fisher | R415 | |
| gel di silice | TCI America | S0821 | |
| bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| etossido di sodio | Alfa Aesar | L13083 | |
| periodide di sodio | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| solfato di sodio | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| solfito di sodio | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| triacetossiboroidruro di sodio | Alfa Aesar | B22060 | |
| spettrofotometro (NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| BulletKit | Lonza PT-3001 | ||
| tetraidrofurano | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| tioanisolo | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| trietilammina | Alfa Aesar | A12646 | |
| acido trifluoroacetico | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Soluzione di tripsina-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 |
Riferimenti
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E.
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Ristampe e permessi
