Method Article

Multiplexing di campioni automatizzato utilizzando l'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT)

DOI:

10.3791/61342

⸱

December 18th, 2020

 , 
1Department of Chemistry, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Memory & Alzheimer's Center, Vanderbilt University Medical Center, 3Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University Medical Center, 4Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT) è una strategia avanzata di multiplexing del campione in grado di aumentare il numero di campioni che possono essere analizzati contemporaneamente ai tag isobarici disponibili. L'incorporazione di una piattaforma robotica ha notevolmente aumentato la produttività sperimentale, la riproducibilità e l'accuratezza quantitativa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo introdotto un flusso di lavoro di proteomica quantitativa ad alta produttività, etichettatura isotopica precursore combinata e tagging isobarico (cPILOT) in grado di multiplexare fino a 22 o 24 campioni con tag di massa tandem o tag isobarici N,N-dimetil leucine isobarici, rispettivamente, in un singolo esperimento. Questo multiplexing del campione migliorato riduce notevolmente i tempi di acquisizione della spettrometria di massa e aumenta l'utilità dei costosi reagenti isobarici commerciali. Tuttavia, il processo manuale di gestione dei campioni e le fasi di pipettazione nella strategia possono richiedere molto lavoro, richiedere molto tempo e introdurre la perdita di campioni e l'errore quantitativo. Queste limitazioni possono essere superate attraverso l'incorporazione dell'automazione. Qui abbiamo trasferito il protocollo cPILOT manuale a un dispositivo di movimentazione automatica dei liquidi in grado di preparare grandi numeri di campione (cioè 96 campioni) in parallelo. Nel complesso, l'automazione aumenta la fattibilità e la riproducibilità di cPILOT e consente un ampio utilizzo da parte di altri ricercatori con dispositivi di automazione comparabili.

Introduction

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La proteomica basata sulla spettrometria di massa (SM) è uno strumento di ricerca indispensabile per identificare biomarcatori specifici della malattia, comprendere la progressione della malattia e creare lead per lo sviluppo terapeutico. Questo può essere ottenuto da una serie di campioni clinici correlati alla malattia come siero del sangue / plasma, fluidi prossimali e tessuti1,2. La scoperta e la convalida del biomarcatore proteomica hanno recentemente guadagnato una considerazione significativa a causa della potenza delle strategie di multiplexing delcampione 3,4. Il multiplexing del campione è una tecnica che consente il confronto simultaneo e la quantificazione di due o più condizioni del campione all'interno di una singola iniezione MS5,6. Il multiplexing del campione si ottiene codificando peptidi o proteine da più campioni con tag chimici, enzimatici o metabolici e ottenendo informazioni sulla SM da tutti i campioni in un singolo esperimento MS o MS / MS. Tra i tag isobarici disponibili ci sono reagenti di tagging isobarico (iTRAQ), tag di massa tandem commerciali (TMT) e reagenti isobarici sintetizzati internamente N,N-dimetil leucina (DiLeu) con capacità fino a 16-plex7 e 21-plex8, rispettivamente.

L'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT) sono una tecnologia avanzata di multiplexing del campione. cPILOT combina l'etichettatura isotopica del peptide N-termini con isotopi leggeri [−(CH3)2] e pesanti [−(13C2H3)2] a basso pH (∼2.5), che mantiene disponibile il residuo di lisina per la successiva etichettatura isobarica ad alto pH (8,5) utilizzando TMT, DiLeu, o tag iTRAQ3,9,10,11,12,13,14. Lo schema di doppia etichettatura della strategia cPILOT è descritto nella Figura 1 supplementare con due campioni che utilizzano un peptide di esempio. L'accuratezza e la precisione della quantificazione basata su TMT a livello ms2 possono essere compromesse a causa della presenza di ioni co-isolati e co-frammentati contaminanti definiti come effetto di interferenza15. Questa limitazione nei rapporti di ioni reporter imprecisi può essere superata con l'aiuto di spettrometri di massa Orbitrap tribridi. Ad esempio, l'effetto di interferenza può essere superato isolando un picco in una coppia dimetilata al livello MS1 nello spettrometro di massa, sottosottenendo il picco leggero o pesante alla frammentazione MS2 nella trappola ionica lineare e quindi sottosottenendo il frammento MS2 più intenso per HCD-MS3 per ottenere informazioni quantitative. Al fine di aumentare le possibilità di selezionare i peptidi senza ammine di lisina disponibili per generare ioni reporter, è possibile utilizzare anche un'acquisizione selettiva di MS3 basata sul frammento y-1 ed è un approccio che può comportare una maggiore percentuale di peptidi quantificabili con cPILOT9. La combinazione di etichettatura leggera e pesante aumenta le capacità di multiplexing del campione di un fattore 2 volte superiore a quello ottenuto con i singoli tag isobarici. Recentemente abbiamo utilizzato cPILOT per combinare fino a 24 campioni in un unico esperimento con reagenti DiLeu16. Inoltre cPILOT è stato utilizzato per studiare le modifiche ossidativi post-traslatori14 tra cui nitrazione proteica17, altri proteomi globali9, e ha dimostrato applicazioni su più campioni di tessuto in un topo del morbo di Alzheimermodello 11.

La robusta preparazione del campione è un passaggio critico in un esperimento cPILOT e può richiedere molto tempo, laboriosa ed estesa. Il multiplexing del campione migliorato richiede un'ampia pipettazione e personale di laboratorio altamente qualificato, e ci sono diversi fattori che possono influenzare pesantemente la riproducibilità dell'esperimento. Ad esempio, è necessaria un'attenta manipolazione dei campioni per garantire tempi di reazione simili per tutti i campioni e per mantenere un pH tampone appropriato per campioni dimetilati leggeri e pesanti. Inoltre, la preparazione manuale da decine a centinaia di campioni può introdurre un elevato errore sperimentale. Pertanto, per ridurre la variabilità della preparazione del campione, migliorare l'accuratezza quantitativa e aumentare la produttività sperimentale, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro cPILOT automatizzato. L'automazione si ottiene utilizzando un dispositivo robotico di movimentazione dei liquidi in grado di completare molti aspetti del flusso di lavoro (Figura 1). La preparazione del campione dalla quantificazione delle proteine all'etichettatura peptidica è stata eseguita su un gestore liquido automatizzato. Il gestore automatico del liquido è integrato con un apparato a pressione positiva (PPA) per lo scambio tampone tra le piastre di estrazione in fase solida (SPE), lo shaker orbitale e un dispositivo di riscaldamento / raffreddamento. La piattaforma robotica contiene 28 posizioni di coperta per ospitare piastre e buffer. Ci sono due baccelli con pinza per trasferire le piastre all'interno delle posizioni del ponte: una testa di pipettazione a volume fisso a 96 canali (5-1100 μL) e sonde a volume variabile a 8 canali (1-1000 μL). La piattaforma robotica è controllata utilizzando un software. L'utente deve essere addestrato professionalmente prima di utilizzare il gestore liquido robotico. Il presente studio si concentra sull'automazione del flusso di lavoro cPILOT manuale, che può essere laborioso per l'elaborazione di più di 12 campioni in un singolo batch. Al fine di aumentare la velocità effettiva dell'approccio cPILOT11, abbiamo trasferito il protocollo cPILOT a un gestore di liquidi robotici per elaborare più di 10 campioni in parallelo. L'automazione consente anche reazioni simili per ogni campione in parallelo durante varie fasi del processo di preparazione del campione, che ha richiesto agli utenti altamente qualificati di ottenere durante il cPILOT manuale. Questo protocollo si concentra sull'implementazione del dispositivo di movimentazione automatica dei liquidi per eseguire cPILOT. Il presente studio descrive il protocollo per l'utilizzo di questo sistema automatizzato e ne dimostra le prestazioni utilizzando un'analisi "proof-of-concept" a 22 plex degli omogeneati epatici del topo.

Protocol

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Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Pittsburgh. Un topo di controllo maschile (C57/BLJ) è stato acquistato commercialmente e ospitato nella Division of Laboratory Animal Resources dell'Università di Pittsburgh. I topi venivano nutriti con chow ad libitum di laboratorio di roditori standard e tenuti in un ciclo chiaro/scuro di 12 ore. Il tessuto epatico è stato raccolto e conservato a -80 °C.

1. Estrazione di proteine

NOTA: questi passaggi vengono eseguiti manualmente.

  1. Lavare il fegato di topo (100 mg) con soluzione salina e omogeneato con 500 μL di urea da 8 M utilizzando un omogeneizzatore meccanico che utilizza la matrice di liscivia A per 4 m/s per 20 s.
    NOTA: In questo studio, gli inibitori della proteasi o della fosfatasi non sono stati aggiunti, ma possono essere aggiunti al tampone se necessario, sulla base dell'esperimento. Inoltre, le fasi di estrazione delle proteine possono essere regolate di conseguenza per vari tipi di campioni.
  2. Trasferire l'omogeneato tissutale in un nuovo tubo di microcentrifugo, risciacquare e combinare i tubi di lisciviatura con 100-500 μL di PBS con urea da 8 M.
  3. Centrifugare i tessuti omogeneizzati (12.800 x g,4 °C e 15 min) e raccogliere il supernatante.
    NOTA: Il resto dei passaggi viene eseguito sul gestore di liquidi robotici disponibile nel laboratorio dell'utente. Il gestore del liquido deve essere in grado di aspirare e erogare buffer da e verso i tipi di piastra specificati ANCI, con una partecipazione minima dell'operatore.
  4. Determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio di acido bicinchoninico (BCA) secondo le istruzioni del produttore.
  5. Accendere il PPA, il dispositivo di riscaldamento/raffreddamento e le pompe per vuoto e collegare tutti gli accessori con il gestore del liquido. Il gestore del liquido mostra una luce blu una volta collegato al computer e pronto per l'esercizio.
  6. Alla piastra di reagente 1 (piastra del pozzo 96), aggiungere 30 μL di 25 mM 1,4-ditiothreitol (DTT), 25 mM 30 μL di cisteina e 25 mM 30 μL di iodoacetamide (AIA) alle file 1, 2 e 3, rispettivamente.
  7. Aggiungere 8 M urea e 20 mM Tris con 10 mM CaCl2 (pH 8.2) a una piastra del serbatoio. Aggiungere 500 μL di acido formico al 5% di acido formico a 2 mL di piastra del pozzo profondo, 20 μL di triptina alla riga 1 della piastra di tripside e posizionarlo nella posizione del ponte come specificato dal metodo.
    NOTA: IAA e tripside sono stati aggiunti alla piastra del pozzo 96 prima dell'aggiunta al campione.
  8. Aliquota 300 μL dell'omogeneato epatico in un tubo da 500 μL e posizionare su una piastra di pozzo profondo 2 ml e posizionarsi a 4 °C fino all'inizio del protocollo. Per questo esperimento, 22 aliquote sono state generate dal singolo omogeneato epatico.
    NOTA: Aggiungere uno standard interno di controllo della qualità (ad esempio, caseina alfa bovina o altre proteine esogene) con lo standard di rapporto 1 μg: campione proteico di 100 μg.
  9. Definire il volume di buffer da aggiungere agli esempi in base ai nomi e al valore delle variabili in base alla tabella 1. In base al BCA, immettere il volume del campione e del buffer di normalizzazione (8 M urea) in un foglio di calcolo e allegare al software(tabella 2).
    NOTA: Un'ulteriore diluizione con tampone può essere necessaria se la concentrazione proteica è troppo elevata. Le concentrazioni risultanti per il campione del tessuto epatico sono state di 10 μg/μL. Il volume dei tamponi è stato ottimizzato per la proteina 100 μg.
  10. Rimuovere i tubi campione da 4 °C, posizionarsi sulla posizione del ponte specificata del gestore automatico del liquido e lasciare riscaldare per 10 minuti.
  11. Aprire il metodo e seguire le istruzioni per posizionare i suggerimenti richiesti (1070, 90 e 230 μL) e il labware nelle posizioni desiderate. Una volta che tutti i labware e le punte sono a posto, controlla con il layout del mazzo finale e fai clic su Avanti per continuare il protocollo.
    NOTA: la configurazione guidata informa l'utente di aggiungere un volume di buffer richiesto al labware specifico a seconda del protocollo e della posizione del deck da mantenere.

2. Riduzione del campione, alchilazione e digestione

  1. Caricare 230 μL di punte e aspirare 90 μL di urea da 8 M dal serbatoio e erogare alla fila 1 della piastra nera del pozzo profondo 2 mL. Scaricare i suggerimenti. Ripetere questo passaggio fino ad aggiungere 8 M di urea a tutti i pozzi corrispondenti ai 22 campioni.
    NOTA: Il tampone di denaturazione srotola la struttura tridimensionale della proteina per produrre la struttura primaria in modo che la tripparina possa agire e rompere efficacemente la proteina. La pipetta a 8 canali può aspirare diversi volumi per gli 8 canali e può erogare in diverse posizioni nel labware. In questo passaggio tutti i canali aspiravano lo stesso volume definito nel software.
  2. Dopo aver aggiunto il tampone di denaturazione, caricare le punte da 90 μL e aspirare 10 μL (corrisponde a 100 μg) di omogeneato di fegato di topo utilizzando la pipetta a 8 canali nella piastra nera del pozzo profondo 2 mL. Scaricare i suggerimenti. Ripetere questo passaggio fino al trasferimento di tutti i 22 campioni.
  3. Dopo ogni trasferimento, eseguire un passaggio di miscelazione per aspirare e erogare tre volte 50 μL del contenuto del pozzo per garantire la miscelazione della proteina con il tampone per mostrare un rapporto 1:1.
    NOTA: Rimuovere il campione omogeneizzato di magazzino e posizionarsi in -80 °C.
  4. Per ridurre le proteine denaturate, caricare una fila di punte da 90 μL e aspirare 3 μL di DTT dalla piastra del reagente 1. Distribuire DTT alle file 1 e 2 della piastra nera da 2 mL e scaricare le punte.
    NOTA: La proteina: Il rapporto molare DTT è mantenuto a 1:40 per la riduzione dei legami disolfuro. Il calcolo del rapporto molare si basa sulla massa proteica dell'albumina siere bovina (BSA), che è 66,5 x 103 g/mol.
  5. Sigillare la piastra del campione con un foglio di alluminio e incubare a 37 °C per 600 s a 300 giri/min.
  6. Aggiungere 30 μL di 0,25 M IAM alla riga 3 della piastra di reagente 1 poco prima dell'uso e posizionare sul ponte. Sconsituare la piastra campione e tornare al ponte.
    NOTA: L'IAM è sensibile alla luce.
  7. Caricare una fila di punte da 90 μL, aspirare 6 μL di IAM dalla piastra del reagente 1 alla riga 3 e erogare alla riga 1 della piastra del campione. Scaricare i suggerimenti.
    NOTA: Il rapporto molare proteina: IAM viene mantenuto a 1:80 per ogni campione. Questa reazione deve essere fatta al buio.
  8. Sigillare la piastra campione e incubare a 4 °C per 30 min a 300 giri/min sul dispositivo di riscaldamento/raffreddamento.
    NOTA: La sigillatura della piastra viene eseguita per evitare che il campione si leggeri, evapori e si consegni dal pozzo.
  9. Smacchiare la piastra del campione e caricare una fila di punte da 90 μL e aspirare 5 μL di cisteina dalla piastra del reagente 1 alla riga 2. Distribuire alle righe 1 e 2 della piastra campione e scaricare le punte. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
    NOTA: La proteina: Il rapporto molare L-cisteina viene mantenuto a 1:40.
  10. Posizionare la piastra campione sullo shaker orbitale per eseguire una scossa a tempo di 1800 giri/min per 30 minuti.
  11. Aggiungere 800 μL di tampone Tris da 20 mM con cacl2 da 10 mM (pH 8,2) a ciascun pozza di piastra del campione per diluire la concentrazione di urea a 2 M. Scaricare le punte.
    NOTA: L'attività della tripsiderina è ostacolata a concentrazioni di urea più elevate e quindi deve essere ridotta a meno di 2 M. Questo studio è stato eseguito con un rapporto molare proteina-tripside di 50: 1 per 14 h.
  12. Aggiungere 20 μL di tripina alla riga 1, colonna 1-12 di una piastra di pozzo 96 e posizionare in una posizione specificata sul ponte.
  13. Caricare una fila di punte da 90 μL, aspirare 2 μL di tripside dalla fila della piastra di tripina 1 e erogare alle file 1 e 2 della piastra del campione. Scaricare i suggerimenti.
  14. Sigillare la piastra e incubare per 14 ore a 37 °C a 600 giri/min sul dispositivo di riscaldamento/raffreddamento.
  15. Dopo l'incubazione, smastrare la piastra del campione e aggiungere il 5% di acido formico alla riga 3, colonna 1- 12 di una piastra di raccolta del pozzo profondo e posizionarla sul ponte specificato.
  16. Interrompere la digestione aggiungendo 150 μL di acido formico al 5% dalla riga 3 della piastra dell'acido formico e erogare per campionare la piastra alle file 1 e 2. Scaricare i suggerimenti.

3. Desalting fase 1

  1. Desalt i peptidi con piastra SPE contenente 20 mg di materiale Targa C-18. Fissare il volume per ogni scambio tampone come 600 μL e fissare la pressione a 100 mbar.
  2. Caricare punte da 1070 μL e aspirare 600 μL di acetonitrile e erogare alle file 1 e 2 della piastra SPE. Posizionare la piastra SPE su PPA e applicare pressione.
  3. Utilizzando le stesse punte, aspirare 600 μL di acetonitrile e erogare alle file 1 e 2 di piastra SPE. Posizionare la piastra SPE su PPA e applicare pressione.
    NOTA: Il flusso può essere scaricato per i rifiuti utilizzando una pompa di aspirazione.
  4. Caricare punte da 1070 μL e aspirare 600 μL di tampone A (100 % di acqua in acido formico allo 0,1 %) e erogare alle file 1 e 2 di lamiera SPE. Posizionare la piastra SPE su PPA e applicare pressione.
    NOTA: Se il volume del buffer non si riduce significativamente provare ad aumentare la pressione o il tempo.
  5. Caricare 2 file di punte da 1070 μL, aspirare 534 μL di campioni digeriti e erogare alle file 1 e 2 di lamiera SPE. Posizionare la piastra SPE su PPA e applicare pressione. Ripetere questo passaggio fino al caricamento di tutti i campioni.
    NOTA: Poiché il volume totale dopo l'aggiunta di acido formico sarà di 1068 μL e i campioni sono stati aggiunti in due passaggi.
  6. Caricare 2 file di punte da 1070 μL usate, aspirare 600 μL di tampone A e erogare alle file 1 e 2 della piastra SPE. Posizionare la piastra SPE su PPA e applicare pressione.
  7. Ripetere il passaggio precedente una volta per pulire il campione.
  8. Caricare 1 fila di punte da 1070 μL, aspirare 600 μL di ACN: Acqua (60:40) e erogare alle file 1 e 2 di piastra SPE. Posizionare la piastra SPE sopra una piastra di raccolta per elutare i peptidi utilizzando PPA e applicare pressione.
  9. Ripetere il passaggio precedente per elutare i peptidi nella piastra di raccolta. Asciugare la piastra di raccolta a secco e conservare a -80°C fino a ulteriore lavorazione.

4. Etichettatura della dimetilazione (peptide N-termini)

  1. Posizionare i suggerimenti richiesti (1070, 90 e 230 μL) e il labware nelle posizioni desiderate nel software. Una volta che tutti i labware e le punte sono a posto, controlla con il layout del mazzo finale e fai clic su Avanti per continuare il protocollo.
  2. Per la piastra reagente 2, aggiungere 450 μL di acido acetico 1%, formaldeide leggera da 50 μL (CH2O), 50 μL di formaldeide pesante (13CD2O) e 150 μL di acido formico rispettivamente alle file 1, 2, 3 e 4.
  3. Per la piastra reagente 3 aggiungere 50 μL di CB leggero, 50 μL di CB pesante, alle file 1 e 2 e 50 μL di ammoniaca alle file 3 e 4.
  4. Caricare 2 file di punte da 230 μL e aspirare 100 μL di acido acetico all'1% dalla riga 1 della piastra di reagente 2 ed erogare ai peptidi essiccati nella piastra campione 2 (piastra di raccolta dalla fase di dissallamento) le file 1 e 2 ed eseguire uno scuotimento a tempo per 5 minuti a 1800 giri/min.
  5. Caricare 90 μL di punte e aspirare 16 μL di 60 mM (4%) CH2O (37% wt/v) dalla riga 2 della piastra di reagente 2 e erogare alla riga 1 della piastra del campione. Scaricare i suggerimenti.
  6. Caricare 1 fila di punte da 90 μL e aspirare 16 μL di 60 mM (4%) 13 la commissione per i CD2O (20% wt/v) dalla riga 3 della piastra di reagente 2 e erogare alla riga 2 della piastra campione. Scaricare i suggerimenti.
    NOTA: In questo studio la riga 1 corrisponde alla luce e la riga 2 corrisponde a campioni dimetilati pesanti (cfr. figura 1).
  7. Caricare 2 file di punte da 90 μL e aspirare 16 μL di 24 mM NaBH3CN e 24 mM NaBD3CN dalla riga 1 e 2 della piastra di reagente 3 e erogare alle righe 1 e 2, rispettivamente della piastra del campione.
  8. Scaricare le punte ed eseguire una scossa a tempo per 15 minuti a 1800 giri/min utilizzando lo shaker orbitale.
    NOTA: L'aggiunta di cianoboroidro di sodio avvia la reazione quindi a ridurre la variabilità tra gli esperimenti questo passaggio viene eseguito una volta per lotto.
  9. Caricare 2 file di punte da 90 μL e aspirare 32 μL di ammoniaca all'1% (~28-30% v/v) dalle file 3 e 4 della piastra di reagente 3 e erogare rispettivamente alle file 1 e 2 della piastra campione 2. Scaricare i suggerimenti.
    NOTA: L'aggiunta di ammoniaca interrompe la reazione, quindi per ridurre la variabilità tra gli esperimenti questo passaggio viene eseguito una volta per lotto.
  10. Combina volumi uguali di peptidi dimetilati leggeri e pesanti (1:1) a una nuova piastra di pozzo profondo 2 mL per la dissalazione.
    NOTA: In questo studio 90 μL del contenuto del pozzo della riga 1 sono stati combinati con 90 μL di fila 2 dalla piastra campione 2 a una nuova piastra di raccolta da 2 mL (piastra campione 3). Il rapporto di luce: la miscelazione pesante dipende dal protocollo sperimentale, in questo studio è stato utilizzato un rapporto 1:1.
  11. Caricare 2 file di punte da 230 μL e aspirare 32 μL di acido formico al 5% sui campioni combinati ed eseguire uno scuotimento a tempo per 30 s a 1800 giri/min.
    NOTA: L'efficienza della dimetilazione dipende dal pH della miscela di reazione e qualsiasi cambiamento nel pH tampone si tradurrà in un'etichettatura incompleta del peptide N-termini. L'efficienza della dimetilazione dovrebbe essere superiore al 97% se cercata come modifica dinamica al peptide N-termini. In questo studio l'efficienza di etichettatura dei peptidi leggeri e pesanti era rispettivamente del 99,7% e del 99,5%.

5. Desalting fase 2

  1. Eseguire la desalinizzazione del campione in modo simile al passaggio 1 del desalt per i campioni combinati.
  2. Asciugare i campioni nella piastra del campione utilizzando un vac di velocità e conservare a -80 °C fino a un'ulteriore lavorazione.

6. Etichettatura isobarica (residui di Lys)

  1. Seguire la configurazione guidata del labware e posizionare le punte richieste (1070, 90 e 230 μL), con buffer appropriati. Una volta che tutti i labware e le punte sono a posto, controlla con il layout del mazzo finale e fai clic su Avanti per continuare il protocollo.
  2. Aggiungere 250 μL di bicarbonato di ammonio trietilico da 100 mM (TEAB), 30 μL di idrossilammina (10% w/v) alle file 1 e 2 di piastra reagente 4. Posizionare i tubi TMT sulla piastra profonda da 2 ml come da foglio di calcolo nella tabella 3.
  3. Tenere un tubo vuoto da 1,5 ml in un portatubi per mettere in comune i peptidi etichettati. Posizionare la piastra campione essiccata a P9 e la piastra di lavorazione TMT su P14.
  4. Per ricostituire i peptidi, caricare punte da 230 μL e aspirare 100 μL di tampone di bicarbonato di trietile ammonio da 100 mM (TEAB) (pH ~8,5) dalla riga 1 alla piastra TEAB e erogare ai peptidi essiccati alla riga 3 della piastra campione 3. Posizionare la piastra sullo shaker orbitale per 30 s a 1800 giri/min.
    NOTA: Ricostituire 100 μg di peptidi dimetilati ad una concentrazione di 1 μg/μL.
  5. Caricare punte da 90 μL e aspirare 10 μL di acetonitrile anidro da H12 della piastra TMT e erogare in ciascuno dei tubi TMT essiccati.
  6. Rimuovere i tubi TMT, il vortice e far girare rapidamente i tubi e tornare a deck in una piastra profonda.
  7. Caricare 1 fila di punte da 90 μL e aspirare 12,5 μL dei peptidi dimetilati combinati e erogare alla riga 1 della piastra di lavorazione TMT. Scaricare i suggerimenti.
    NOTA: Il rapporto TMT: peptidico è stato mantenuto a 1:8 per questo esperimento.
  8. Caricare 1 fila di punte da 90 μL e aspirare 10 μL di TMT e erogare alla riga 1 della piastra di lavorazione TMT. Scaricare le punte, eseguire una scossa a tempo per 1 ora a 1800 giri/min.
  9. Caricare 1 fila di punte da 90 μL e aspirare 8 μL di idrossilammina (10% w/v) dalla riga 2 alla piastra TEAB e distribuire alla riga 1 della piastra di lavorazione TMT. Scaricare le punte, eseguire uno scuotimento a tempo per 15 minuti a 1800 giri/min.
  10. Unire 30,5 μL dei peptidi etichettati TMT dalla piastra di lavorazione TMT al tubo da 1,5 ml. Scaricare i suggerimenti dopo ogni trasferimento.
  11. Rimuovere il tubo con i campioni raggruppati e asciugare per evaporare l'acetonitrile. Ricostituire peptidi in 0,2 mL di acqua nello 0,1 % di acido formico e tornare sul ponte.
    NOTA: Anche l'efficienza di etichettatura dell'etichettatura isobarica è specifica del pH e l'efficienza di etichettatura deve essere superiore al 98% per le istruzioni del produttore. In questo studio l'efficienza di etichettatura TMT dei peptidi leggeri e pesanti terminati con lisina è stata rispettivamente del 99,4% e del 99,5%.

7. Passo di desalinizzazione

  1. Eseguire la desalinizzazione del campione simile al desalt 1 per un campione.
  2. Asciugare i campioni e conservare in -80 °C fino all'analisi.

8. Cromatografia liquida-Spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e MS3

  1. Ricostituire i peptidi in acqua di grado MS con 0,1% di FA per ottenere una concentrazione di ~1 μg/μL. Filtrare campioni con tubi a microcentrifugo contenenti un filtro da 0,65 μm. Centrifugare peptidi a 12.000 x g per 3 minuti e posizionare il flusso attraverso una fiala autocampatore.
    NOTA: La concentrazione di peptidi può essere confermata in questa fase, se lo si desidera. I peptidi dovrebbero essere ricostituiti in acqua di grado LC-MS e sottoposti a un test peptidico BCA. In questo studio, il test BCA peptidico non è stato eseguito e tutte le quantità di peptidi erano basate sul test BCA della proteina iniziale.
  2. Preparare i buffer di fase mobile come segue: acqua 100% (v/v) con 0,1% FA (A) e 100% ACN con 0,1% FA (B).
  3. Iniettare 1 μL di campione su una colonna trappola imballata con 2 cm di materiale C18 (3 μm, 100 Å pore size).
    NOTA: La pulizia del campione sulla trappola è la seguente: 10 min, 100% A; 2 μL/min utilizzando un sistema di cromatografia liquida 2D.
  4. Eseguire il metodo di separazione analitica. Utilizzare una colonna capillare di silice fusa a punta tirata laser da 100 μm i.d. x 26 cm imballata con materiale C18 (2,5 μm, 100 Å). La pendenza è: 0-10 min, 10% B; 10-30 min, 10-15% B; 30-75 min, 15-30% B; 75-88 min, 30-60% B; 88-92 min, 60-90% B; 92-99 min, 90% B; 99-100 min, 90-10% B, 100-120 min, 10% B; 300 nL/min, 120 min.
  5. Eseguire l'acquisizione dei dati per lo spettrometro di massa mentre è in esecuzione il metodo di separazione analitica.
    1. Utilizzare i seguenti parametri per la scansione del rilevamento MS: 375-1.500 m/z,risoluzione 120.000, tempo ciclo 3 s (velocità massima), controllo automatico del guadagno (AGC) obiettivo 4.0e5, tempo massimo di iniezione 50 ms.
    2. Utilizzare i seguenti parametri per CID-MS/MS con trappola ionica: scansioni DDA (Data Dependent Acquisition) per risultato, larghezza di isolamento 2 m/z, 35% di energia di collisione normalizzata (NCE), 0,25 attivazione q, tempo di attivazione di 10 ms, 1,0e4 AGC, tempo massimo di iniezione di 100 ms.
    3. Utilizzare i seguenti parametri per HCD–MS3 SPS 10: intervallo di scansione 100-400 m/z, numero di scansioni dipendenti 10, AGC 5.0e4, tempo massimo di iniezione 118 ms, energia di collisione HCD 55%, finestra di isolamento MS2 2.

9. Analisi dei dati

  1. La ricerca ha generato file RAW per l'elenco di proteine e peptidi utilizzando un software di analisi proteica su un database appropriato.
    NOTA: i file RAW generati in questo studio sono stati cercati su un database Uniprot del mouse.
  2. Poiché in un file RAW è presente un'etichettatura leggera e pesante, cercare in ogni file con due flussi di lavoro peptidi dimetilati leggeri e pesanti.
  3. Cercare i file RAW sul database Uniprot del mouse (13/07/2019) con sequenza 53035 con i seguenti parametri: scissione della tripina con un massimo di due scollatura persa, peptide con una lunghezza minima di 6 aminoacidi, tolleranza di massa genitore di 15 ppm, 1 tolleranza alla frammentazione Da Modifiche statiche: dimetilazione leggera (+28.031, peptide N-terminale) o dimetilazione pesante (+36.076 Da, peptide N-terminale), carbamidometile (+57.021 Da, C), Modifiche dinamiche: ossidazione (+15.995 Da, M), tag isobarico 11-plex (229.163 Da, K), 1% FDR, quantificazione degli ioni reporter con 30 ppm di tolleranza di integrazione di picco, centroide più sicuro per il metodo di integrazione.
    NOTA: Il picco dimetilato pesante include anche un'altra modifica che è ~7 Da (+35.069 Da, peptide N-terminus) dal picco dimetilato leggero e quindi un altro nodo di ricerca dovrebbe essere incorporato per includere anche questa modifica.
  4. Eseguire la quantificazione degli ioni reporter in base all'intensità, alla corrispondenza di massa SPS del 65%, al rapporto medio S/N 10, alla correzione isotopica, alla normalizzazione e al ridimensionamento.
    NOTA: La normalizzazione e il ridimensionamento possono essere eseguiti in base alla quantità totale di peptidi o a una proteina specifica aggiunta al campione. I campioni qc possono anche essere inclusi nei canali per la normalizzazione tra batch o intra-batch in base a un ridimensionamento di riferimento interno a due code18. Le contaminazioni isotopiche di diversi canali TMT non sono state fornite alla ricerca, si consiglia agli utenti di aggiungere la contaminazione isotopica di diversi ioni reporter.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figura 2 mostra i dati MS rappresentativi di un peptide identificato in tutti i 22 canali di ioni reporter da un esperimento cPILOT a 22 plex, incluse le repliche del flusso di lavoro. La figura 2 (in alto) raffigura una coppia di picchi doppiamente carica separata da una spaziatura da 4 Da m/z che indica un singolo gruppo dimetile incorporato nel peptide. Le coppie di picco dimetilate leggere e pesanti erano isolate e frammentate indipendentemente per produrre la sequenza del peptide. La sequenza del peptide è G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) e corrisponde alla proteina Betaina-omocisteina S-metiltransferasi. Gli ioni di frammento più intensi per i picchi dimetilati leggeri e pesanti(non mostrati ) sono stati ulteriormente isolati per la frammentazione ms3 e gli ioni reporter(m/z 126-131) sono mostrati nella figura 2 (in basso). Le intensità degli ioni reporter sono direttamente proporzionate all'abbondanza peptidica nel campione. L'abbondanza peptidica dei campioni implica che la capacità di pipettazione della piattaforma robotica è abbastanza uniforme tra i 22 campioni. Nel complesso, questo esperimento cPILOT a 22 plex ha portato a 1326 (1209-luce/1181-pesanti) identificazioni di proteine risultanti da peptidi 3098 (6137-leggeri/5872-pesanti)(tabella 4). La figura 3 mostra il box plot tra l'abbondanza di log10 e le intensità totali degli ioni reporter su tutti i 22 canali che mostrano una minore variabilità inter-bene/intercampione. La valutazione dell'automazione totale è stata effettuata esaminando l'errore nell'abbondanza di ioni reporter in ciascuna proteina nei 22 campioni. La figura 4 mostra che l'elaborazione del campione con la piattaforma robotica ha portato a valori CV molto bassi. In particolare, nei 3098 peptidi identificati, il CV medio nell'abbondanza di ioni reporter era rispettivamente del 12,36 % e del 15,03 % per i peptidi dimetilati leggeri e pesanti. Tra questi peptidi il 2032 di questi peptidi aveva un segnale di ioni reporter al di sopra della soglia minima e sono stati ritenuti quantificabili.

figure-results-1
Figura 1. Flusso di lavoro sperimentale per elaborare 22 campioni in parallelo con un protocollo cPILOT automatizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2. Quantificazione dei peptidi su 22 campioni. Esempio di spettri MS (in alto) e MS3 (in basso) del peptide G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) quantificati in esperimenti cPILOT automatizzati a 22 plex per picchi leggeri dimetilati (in basso a sinistra) e pesanti dimetilati (in basso a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3. Box plot delle intensità totali degli ioni reporter rispetto all'abbondanza log10 di 22 campioni utilizzando lo scopritore di proteoma 2.3. Il file RAW è stato cercato due volte per peptidi leggeri e pesanti, ID proteine separatamente con TMT come modifica dinamica, dimetilazione leggera (+28.031 Da) e pesante (+36.076 e +35.069 Da) dimetilazione al peptide N-termini come modifica statica. Una ricerca combinata con tutte le modifiche di cui sopra è stata eseguita utilizzando Proteome Discover 2.3 per ottenere l'abbondanza log 10 di intensità peptidiche su tutti i canali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4. Trame per violino di co-efficiente della variazione dell'abbondanza peptidica dalle intensità di ioni reporter sommate attraverso i canali 126-131 m / z. Il peptide è stato quantificato con un valore medio CV di 12,36 e 15,03 per peptidi quantificabili leggeri (2373) e pesanti (2533). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1. Illustrazione del cPILOT con un singolo peptide. Mostrando l'etichettatura isotopica di due diversi campioni e l'etichettatura isobarica con TMT126, la miscela risultante è stata iniettata a MS per LC-MS3. Clicca qui per scaricare questo file.

Nome variabileValoreDescrizione
DesaltSamp11065Volume da utilizzare per la desalt fase 1
DesaltSamp2392Volume da utilizzare per la desalt fase 2
DesaltSamp3100Volume da utilizzare per la desalt fase 3
DevmodeFalseFalse taglierà i tempi di incubazione a 30sec- True seguirà i tempi di incubazione nel protocollo.
DTTVol3Volume di DTT
Piastra filtroTargaPiastra utilizzata per la dissalezione
FilterPlateVol600Volume per la desalinizzazione
HAWaterWashesFalseNumero di lavaggi d'acqua sulla piastra SPE
IAMVol2Volume di iodoacetamide
PeptideTMTVol12.5Volume di peptide per l'etichettatura TMT
Pressione100pressione mbar a PPA
TempOffSet1Variazione della temperatura
TMTVol10Volume di tag isobarici da aggiungere
TrisVol800Volume per diluire il campione prima della digestione
TrypsinVol2Volume di tripside
UsePopTimerVeroTrue visualizza le opzioni per applicare la pressione sulla piastra, se necessario

La tabella 1. Elenco di variabili utilizzate nel protocollo cPILOT automatizzato.

DilSourceDilWellDestDestWellDilVolumeOrigine stockStockwellRuota campioneID campione
8M_Urea1CampioniA190Stock_SamplesA1101
8M_Urea1CampioniA290Stock_SamplesA1102
8M_Urea1CampioniA390Stock_SamplesA1103
8M_Urea1CampioniA490Stock_SamplesA1104
8M_Urea1CampioniA590Stock_SamplesA1105
8M_Urea1CampioniA690Stock_SamplesA1106
8M_Urea1CampioniA790Stock_SamplesA1107
8M_Urea1CampioniA890Stock_SamplesA1108
8M_Urea1CampioniA990Stock_SamplesA1109
8M_Urea1CampioniA10 A1090Stock_SamplesA11010
8M_Urea1CampioniA1190Stock_SamplesA11011
8M_Urea1CampioniA1290Stock_SamplesA11012
8M_Urea1CampioniB190Stock_SamplesA11013
8M_Urea1CampioniB290Stock_SamplesA11014
8M_Urea1CampioniB3 b) La commissione per i90Stock_SamplesA11015
8M_Urea1CampioniB4 b) La commissione per i90Stock_SamplesA11016
8M_Urea1CampioniB5 B590Stock_SamplesA11017
8M_Urea1CampioniB6 b) La commissione per i90Stock_SamplesA11018
8M_Urea1CampioniB7 b) La commissione per i90Stock_SamplesA11019
8M_Urea1CampioniB8 B890Stock_SamplesA11020
8M_Urea1CampioniB9 B9 b) la commissione90Stock_SamplesA11021
8M_Urea1CampioniB10 B1090Stock_SamplesA11022
8M_Urea1CampioniB11 B190Stock_SamplesA11023
8M_Urea1CampioniB12 B1290Stock_SamplesA11024

La tabella 2. Volume di omogenato di fegato di topo e urea da 8 M.

SourceWellSourceWell2Reporter IonDestWell1DestWell2VolumeID campione
A1C1126A1E1101
A3C3127NA2E2102
A5C5127CA3E3103
A7C7128NA4E4104
A9C9128CA5E5105
A11C11129NA6E6106
B2D2129CA7E7 A107
B4 b) La commissione per iD4130NA8E8108
B6 b) La commissione per iD6130CA9E9109
B8 B8D8131NA10 A10E101010
B10 B10D10131CA11E111011

La tabella 3. Numero totale di peptidi, proteine e partite spettrali peptidiche (PS).

CPILOT automatizzato
LeggeroPesante
Proteine12091181
Peptidi61375872
Psm1494816762

La tabella 4. Barcodifica delle etichette isobariche con i campioni etichettati leggeri e pesanti.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT è una strategia di multiplexing avanzata in grado di analizzare fino a 24 campioni in un singolo esperimento. La capacità di multiplexing dipende dal numero di combinazioni di tagging isotopico e isobarico disponibili. L'introduzione del TMTpro7, in grado di contrassegnare 16 campioni in un singolo esperimento, può spingere i limiti di cPILOT a 32-plex. cPILOT è costituito da più passaggi di pipettazione e richiede un'ampia cura e abilità dell'utente per eseguire la preparazione del campione. Anche con un utente esperto, gli errori manuali sono inevitabili, il che invita l'uso di piattaforme robotiche per elaborare campioni nella strategia cPILOT. Poiché cPILOT utilizza l'etichettatura dipendente dal pH dei peptidi, il pH deve essere mantenuto per la luce e il pesante set di campioni dimetilati. Il pH leggermente acido-basico può provocare la dimetilazione dei residui di N-termini e lisina. Un vantaggio di cPILOT è che richiede solo la metà dei tag isobarici poiché il peptide N-termini è occupato con i gruppi dimetil. Ciò offre un maggior numero di campioni da etichettare a metà del costo. La gestione di numeri di campione più grandi richiede che i tempi di esposizione dei reagenti siano simili per il primo e l'ultimo campione di un lotto. Un distributore di pipette in grado di ospitare fino a 32 campioni in parallelo può essere raggiunto al meglio con l'uso di dispositivi robotici di movimentazione dei liquidi.

Per elaborare più campioni tramite cPILOT, il flusso di lavoro manuale è stato modificato per incorporare l'automazione. Il gestore liquido robotico utilizzato in questo studio ha due pod con capacità di pipettazione a 96 canali e a 8 canali, con una pinza per posizionare le piastre nelle 28 posizioni del ponte disponibili. Il gestore del liquido è integrato con un apparato a pressione positiva, uno shaker orbitale e un dispositivo per riscaldare / raffreddare i campioni nella piastra del pozzo 96. L'apparato a pressione positiva aiuta a eseguire scambi tampone nelle piastre SPE durante la pulizia, mentre lo shaker orbitale aiuta a vortice / mescolare i campioni. La piattaforma robotica è stata programmata per aspirare e erogare buffer e campioni a piastre da 96 pozzi, incubare, campioni di vortice e piastre di trasferimento. I liquidi con viscosità diverse, come acetonitrile e acqua, richiedono specifiche considerazioni di pipettazione che possono anche essere programmate nel metodo.

Il flusso di lavoro cPILOT, a partire dalla quantificazione proteica da parte di BCA all'etichettatura dei peptidi con tag isobarici (cioè TMT), è stato eseguito sul sistema di gestione dei liquidi. Il protocollo completo è stato scalato per utilizzare 96 piastre di pozzo profondo che possono contenere 2 mL per pozzo. I tamponi sono stati preparati prima dell'inizio dell'esperimento e aggiunti alla piastra del pozzo 96 in modo da consentire l'elaborazione parallela del campione. Nel presente studio, 22 repliche del flusso di lavoro dell'omogeneato epatico del topo sono state aggiunte alle piastre del pozzo profondo e prese attraverso il protocollo cPILOT. Infine, un singolo campione costituito dai peptidi taggati al fegato di topo equimolare da 22 plex è stato iniettato allo spettrometro di massa. Le intensità degli ioni reporter corrispondenti all'abbondanza di peptidi nei campioni hanno dimostrato che i campioni elaborati con il gestore del liquido hanno CV inferiori rispetto al protocollo manuale(dati non mostrati). La piattaforma robotica ha anche notevolmente migliorato la riproducibilità dell'elaborazione del campione. Riproducibilità e robustezza sono fattori molto importanti durante l'elaborazione di un gran numero di campioni. Gli errori di pipetting possono portare a una completa interpretazione errata dei dati e qui la piattaforma robotica ha fornito una bassa variazione tra campioni. Anche l'utilizzo della piattaforma robotica per cPILOT ha ridotto il tempo necessario per preparare i campioni. Ad esempio, dopo aver sviluppato il metodo automatizzato, è stato necessario 2,5 ore per elaborare 22 campioni rispetto a 7,5 ore per il cPILOT manuale. Sono in corso esperimenti nel nostro laboratorio per valutare ulteriormente i confronti dei flussi di lavoro cPILOT manuali e automatizzati. Sulla base di precedenti rapporti del nostro laboratorio, i CV%s di intensità ioniche di reporter proteico nel cPILOT manuale erano in media del 20% con alcuni outlier che superavano questo valore12.

cPILOT è una strategia di derivatizzazione chimica a livello peptidico, che può essere utilizzata per qualsiasi tipo di campione come cellule, tessuti e fluidi corporei. cPILOT offre un multiplexing dei campioni migliorato e con l'incorporazione dell'automazione può facilitare il multiplexing del campione ad alta produttività nella proteomica. Questa produttività è necessaria per far progredire ulteriormente la malattia e la comprensione biologica e la scoperta del biomarcatore.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori riconoscono vanderbilt University Start-up Funds e NIH award (R01GM117191) a RASR.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette Eppendorf da 0,6 mL, confezione da 500Fisher Scientific05-408-120Qualsiasi marca di provette Eppendorf da 0,6 mL è sufficiente
0,65 &; micro; m Unità filtranti centrifughe Ultrafree MC DVEMD MilliporeUFC30DV00
1,5 mL di provette eppendorf, 500 pkFisher Scientific05-408-129Qualsiasi marca di provette eppendorf da 1,5 mL è sufficiente
ml di piastra nera a pozzetti profondiAnalytical Sales and Services, Inc.59623-23BKGCQualsiasi marca di piastra nera a 96 pozzetti è sufficiente
2 ml di piastra a pozzetti profondi trasparenteVWR75870-796
Acido aceticoJ.T. Baker9508-01
Acetonitrile - MS GradeFisher ScientificA955-44 L quantità non è necessaria
Agilent 500µ Piastra LAgilent203942-100Piastra reattiva per l'aggiunta di tamponi
Formiato di ammonioAcros Organics208-753-9
Soluzione di idrossido di ammonio (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Bilancia analiticaMettler ToledoAL54
Kit per il dosaggio delle proteine BCAPierce Thermo Fisher Scientific23227
Biomek i7 ibridoBeckmannQualsiasi dispositivo di manipolazione dei liquidi con la capacità di utilizzare la pressione positiva, il riscaldamento/raffreddamento e il vortice dei campioni.
Materiale di imballaggio C18 (2,5 & micro; m, 100 Å)BrukerQuesto articolo non è più disponibile da Bruker. Sarà sufficiente un materiale di imballaggio alternativo con le specifiche elencate
Centrifuga con rotore a piastreThermo Scientific69720
Micro 21R CentrifugaSorval5437
Dionex 3000 UHPLCThermo ScientificQuesto modello non è più disponibile. Qualsiasi nano LC con un autocampionatore è sufficiente.
Ditiotreiotolo (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Soluzione di formaldeide (13CD2O); 20 % in peso in D2O, 98 atomi % D, 99 atomi % 13CSigma Aldrich, Chimica596388-1G
Soluzione di formaldeide (CH2O); 36,5 - 38% in H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Acido formicoFluka Analytical94318-250ML-F
Fusione Lumos Mass Spettrometro Thermo ScientificQuesto modello non è più disponibile. Possono essere utilizzati altri strumenti ad alta risoluzione (ad esempio Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion o Orbitrap Fusion Lumos).
Idrossilammina cloridratoSigma Aldrich, Chimica255580-100G
Iodoacetammide (IAM)Acros Organics144-48-9
Kit di etichettatura isobarica (TMT 11-plex)Thermo Fisher Scientific90061
L-1-tosylamido-2 feniletiltilcholormetlketone (TPCK) Tripsina trattata dal pancreas bovinoSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
L-cisteinaSigma Aldrich, Chimica168149-25G
Omogeneizzatore meccanico (ad es. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
tampone pH 10Fisher Scientific06-664-261Qualsiasi marca di tampone pH 10 è sufficiente
tampone pH 7Fisher Scientific06-664-260Qualsiasi marca di tampone pH 7 è sufficiente
pHmetro (Tris compatibile)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Qualsiasi marca di pHmetro è sufficiente
Software proteico (ad es. Proteome Discoverer)Thermo Scientific
Piastra di riserva 200mlAgilent204017-100
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CPSigma Aldrich, Chimica190020-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagente grado, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Speed-vacThermo ScientificSPD1010qualsiasi marca di aspiratore rapido in grado di ospitare una piastra a pozzetti profondi è sufficiente
Piastra di agitazioneVWR12365-382Qualsiasi marca di piastre di agitazione è sufficiente
Targa 20 mg Piastre SPENest Group, Inc.HNS S18VSi tratta di cartucce C18
Tampone di bicarbonato di trietilammonio (TEAB)Sigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
TrisBiorad161-0716
Biomek Supporto per rack per provette a 24 postiBeckmann373661
UreaBiorad161-0731
Acqua - Grado MS FisherScientificW6-4Non è necessaria una quantità di 4 L
2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).">Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
  2. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).">Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
  3. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).">Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
  4. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).">Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  5. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).">Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
  6. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).">Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).">Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
  8. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).">Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
  9. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).">Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  10. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).">Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  11. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406(2017).">King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406(2017).
  12. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).">King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
  13. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).">Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  14. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).">Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
  15. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).">Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  16. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).">Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
  17. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).">Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  18. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227(2020).">Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227(2020).

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