Digestione di interi occhi di topo per l'analisi citometrica a flusso multi-parametro dei fagociti mononucleari

Sommario

Questo protocollo fornisce un metodo per digerire interi occhi in una singola sospensione cellulare ai fini dell'analisi citometrica del flusso multi-parametro al fine di identificare specifiche popolazioni fagocitiche mononucleari oculari, inclusi monociti, microglia, macrofagi e cellule dendritiche.

Abstract

Il sistema immunitario innato svolge ruoli importanti nella fisiopatologia oculare tra cui uveite, retinopatia diabetica e degenerazione maculare legata all'età. Le cellule immunitarie innate, in particolare i fagociti mononucleari, esprimono marcatori di superficie cellulare sovrapposti, il che rende l'identificazione di queste popolazioni una sfida. La citometria a flusso multi-parametro consente l'analisi simultanea e quantitativa di marcatori di superficie a più celle al fine di differenziare monociti, macrofagi, microglia e cellule dendritiche negli occhi del topo. Questo protocollo descrive l'enucleazione di interi occhi del topo, la dissezione oculare, la digestione in una singola sospensione cellulare e la colorazione della sospensione a singola cella per marcatori cellulari mieloidi. Inoltre, spieghiamo i metodi appropriati per determinare le tensioni utilizzando controlli a colori singoli e per delineare cancelli positivi utilizzando la fluorescenza meno un controllo. La principale limitazione della citometria a flusso multi-parametro è l'assenza di architettura tissutale. Questa limitazione può essere superata dalla citometria a flusso multi-parametro dei singoli compartimenti oculari o dalla colorazione gratuita dell'immunofluorescenza. Tuttavia, l'immunofluorescenza è limitata dalla sua mancanza di analisi quantitativa e dal numero ridotto di fluorofori sulla maggior parte dei microscopi. Descriviamo l'uso della citometria a flusso multi-parametrico per fornire un'analisi altamente quantitativa dei fagociti mononucleari nella neovascolarizzazione coroiroidale indotta dal laser. Inoltre, la citometria a flusso multi-parametro può essere utilizzata per l'identificazione di sottoinsiemi di macrofagi, mappatura del destino e smistamento delle cellule per studi trascritomici o proteomici.

Introduzione

Il sistema immunitario innato include più tipi di cellule che stimolano l'attivazione e l'infiammazione del complemento. Le cellule immunitarie innate includono cellule killer naturali (NK), mastociti, basofili, eosinofili, neutrofili e fagociti mononucleari. I fagociti mononucleari, che sono composti da monociti, macrofagi e cellule dendritiche, sono stati implicati nella fisiopatologia di molteplici condizioni oftalmiche tra cui uveite, retinopatia diabetica e degenerazione maculare legata all'età (AMD)¹. In questo protocollo, ci concentreremo sull'identificazione dei fagociti mononucleari utilizzando l'analisi citometrica del flusso multi-parametro in un modello di topo di AMD^{2 neovascolare}. Questo protocollo è adattabile per i modelli di topo di retinopatia diabetica e / o uveite, ma è raccomandata una dissezione oculare più estesa a causa della natura sistemica di queste malattie.

I fagociti mononucleari esprimono marcatori di superficie cellulare sovrapposti. Macrofagi e microglia residenti nel tessuto di lunga durata provengono dal progenitore eritemicomieloide derivato dal sacco del tuorlo 3 ,^mentreil riciclaggio di macrofagi e cellule dendritiche si differenzia dal progenitore di cellule dendritiche a midollo osseo⁴. I marcatori di superficie delle celle del mouse comuni a monociti, macrofagi e celle dendritiche includono CD45, CD11b⁵, F4/80⁶, Cx3cr1⁷e il marcatore intracellulare Iba1⁸. Per superare questa sfida, l'analisi trascrittamica di macrofagi, monociti e cellule dendritiche provenienti da più tessuti definisce il CD64 come un marcatore di superficie cellulare specifico del macrofago⁶. I macrofagi sono stati descritti nell'iride, nella coroide, nel corpo ciliare e nel nervo ottico negli occhi sani³. In alternativa, l'identificazione delle cellule dendritiche è più difficile; il metodo più specifico di identificazione delle cellule dendritiche richiede la mappatura del destino utilizzando il mouse reporter Zbtb46-GFP⁹. Indipendentemente da questa linea di reporter, l'espressione di CD11c e MHCII in combinazione con l'assenza di CD64 può identificare potenziali cellule dendritiche^6,10. Le cellule dendritiche sono state identificate in cornea, congiuntiva, iride e coroide negli occhi normali¹¹. Le microglia sono macrofagi specializzati situati nella retina, protetti dalla barriera emato-retinica e derivati dalle cellule progenitrici del sacco tuorlo¹². Di conseguenza, le microglia retiniche possono essere differenziate dai macrofagi derivati dai monociti per i loro livelli fiochi di espressione CD45¹³ e alti livelli di Tmem119, che è disponibile come anticorpo di citometria a^{flusso 14}. All'attivazione delle microglia, tuttavia, CD45 può essere^{regolato 15 e} Tmem119 può essere regolato verso il basso³, dimostrando la complessità della biologia delle microglia e questo è probabilmente rilevante sia nell'AMD che nel suo modello di mouse. Infine, i monociti possono essere divisi in almeno due sottotipi, inclusi classici e non classici. I monociti classici mostrano CCR2⁺Ly6C^altaespressione bassa CX3CR1, e monociti non classici dimostrano CCR2^-Ly6C^bassoCX3CR1^marcatori alti⁵.

A causa della necessità dell'analisi quantitativa dell'espressione marcatore, cioè livelli alti rispetto a bassi/ fiochi, la citometria del flusso multi-parametro è il metodo ideale per la discriminazione tra monociti, macrofagi, microglia e cellule dendritiche nell'occhio e in altri tessuti. Ulteriori vantaggi includono l'identificazione delle sotto-popolazioni, la possibilità di utilizzare lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ordinare le popolazioni cellulari per l'analisi trascri o proteomica e la mappatura del destino. Il principale svantaggio della citometria a flusso multi-parametro è la mancanza di architettura tissutale. Questo può essere superato dalla dissezione oftalmica nei vari sottocomparti oculari: cornea, congiuntiva, iris, lente, retina e complesso coroide-sclera. Inoltre, è possibile eseguire l'imaging di immunofluorescenza di conferma, ma è limitato dal numero di marcatori e dalla mancanza di una quantificazione robusta.

Studi di associazione a livello genomico hanno collegato più geni di complemento con AMD¹⁶. L'attivazione del complemento porta alla produzione di anafilatossina, al reclutamento di leucociti e alla conseguenza infiammazione. Nei topi carenti del recettore del complemento, la lesione laser riduce il reclutamento di fagociti mononucleari e l'area di neovascolarizzazione coroiroidale indotta dal laser (CNV)¹⁷. Allo stesso modo, il recettore della chemiochina con motivo C-C 2 (CCR2) topo knockout, che è carente nel reclutamento di monociti nel tessuto, dimostra sia la diminuzione del reclutamento di fagociti mononucleari che l'area CNV indotta dal laser¹⁸. Questi dati collegano complementi e fagociti mononucleari con CNV sperimentale e possibilmente AMD neovascolare. A sostegno di questa associazione, i recettori del complemento sono disregolati sui monociti del sangue periferico in pazienti con AMD neovascolare^19,20. Questi dati dimostrano una forte associazione tra AMD e fagociti mononucleari.

In questo manoscritto, useremo il modello sperimentale CNV indotto dal laser per caratterizzare le popolazioni di fagociti mononucleari nell'occhio del topo usando citometria a flusso multi-parametro. La CNV indotta dal laser è il modello standard di topo dell'AMD neovascolare, che ha dimostrato l'efficacia dell'attuale terapia amd neovascolare di prima^{linea 21}. Questo protocollo descriverà l'enucleazione degli occhi del topo, la dissezione oculare, la digestione in una singola sospensione cellulare, la colorazione degli anticorpi, la determinazione delle tensioni laser utilizzando controlli a colori singoli e la strategia di gating utilizzando controlli di fluorescenza meno uno (FMO). Per una descrizione dettagliata del modello CNV indotto dal laser, si veda una pubblicazione precedente²². Utilizzando questo protocollo, definiremo microglia, monociti, cellule dendritiche e popolazioni di macrofagi. Inoltre, utilizzeremo MHCII e CD11c per definire ulteriormente sottoinsiemi di macrofagi all'interno del modello CNV indotto dal laser.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Northwestern University. I topi C57BL/6 erano alloggiati in una struttura barriera presso il Center for Comparative Medicine della Northwestern University (Chicago, IL). Tutti gli animali sono stati ospitati in un ciclo chiaro /scuro di 12/12 ore con libero accesso a cibo e acqua.

1. Raccolta del tessuto oculare

1. Sacrifica topi C57BL/6J di 10-12 settimane di entrambi i sessi usando la somministrazione regolamentata di anidride carbonica fino a quando il topo non risponde e non inala più. Eseguire la lussazione cervicale o altro metodo secondario approvato per garantire l'eutanasia.
   NOTA: La perfusione transcardica può essere eseguita per rimuovere i leucociti circolanti che non si trovano nei tessuti oculari. In questo esperimento, la perfusione sistemica non riduce il numero di microglia, monociti, macrofagi o cellule dendritiche rilevate in interi occhi non trattati o trattati al laser. Pertanto, la maggior parte di questi tipi di cellule si trova nei tessuti oftalmici e questo passaggio è facoltativo.
2. Per enucleare gli occhi, spingere verso il basso vicino all'orbita oculare mentre si posiziona un paio di forcette curve delicatamente sotto l'occhio mentre si distingue dalla presa. Pizzicare le plesse chiuse sotto l'occhio senza spremere l'occhio reale. Dislodge l'occhio dalla congiuntiva circostante (si veda la pubblicazione preliminare)²³.
3. Tirare l'occhio lateralmente fino a quando il nervo ottico è l'unica connessione rimasta per staccare l'occhio. Il nervo ottico spesso si taglia con tensione, ma una piccola forbice è talvolta necessaria per tagliare il nervo ottico. Mettere l'occhio in freddo 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) con calcio e magnesio in tubo microcentrifugo da 1,7 ml.

2. Digestione del tessuto oculare

1. Preparare il tampone di digestione contenente 0,1 mg/mL di digestione enzima e 0,2 mg/mL di DNasi in HBSS freddo. Ricostituire inizialmente 5 mg di enzima di digestione in 2 mL di acqua sterile. Preparare una diluizione iniziale di 10 mg/mL di DNasi in HBSS. Per ogni 10 mL del tampone di digestione (sufficiente per 3 animali) mescolare 9,4 mL di HBSS freddo con 0,4 mL di enzima di digestione ricostituito e 0,2 mL di DNasi I diluita.
   NOTA: Queste concentrazioni sono state determinate empiricamente su più esperimenti per fornire livelli ottimali di colorazione degli anticorpi di singole cellule, riducendo al contempo la morte cellulare. La collagenasi D è stata provata come alternativa all'enzima di digestione con ridotta vitalità cellulare e diminuzione delle cellule^CD45 +. Si prega di vedere Discussione per ulteriori dettagli sul processo iterativo per ottimizzare la digestione.
2. Al microscopio sezionato con ingrandimento totale 10x, rimuovere la congiuntiva rimanente e il nervo ottico utilizzando forcep fini e forbici a molla in HBSS freddo.
3. Spostare gli occhi puliti su un piatto di sezionatura asciutta o su una piccola barca di pesatura. Iniettare 0,15-0,20 mL/occhio del tampone di digestione tramite siringa dotata di ago da 30 G nella cavità vitrea dopo che due ferite perforate sono fatte nell'occhio attraverso l'asse visivo e a 90° di distanza da questa prima ferita per l'uscita del tampone di digestione.
4. Tritare gli occhi interi usando forbici a molla e forcep fini con tutti i pezzi più piccoli di 0,5 mm x 0,5 mm. Dissociare il tessuto delle lenti con interruzione meccanica smussata tramite forcep per evitare l'intasamento delle punte delle pipette nei passaggi successivi. Per ogni campione, sciacquare le forcep e le forbici ognuna con 0,75 mL di tampone di digestione in un piccolo piatto. Utilizzare un nuovo piatto per ogni campione.
5. Trasferire il contenuto del piatto in un tubo di dissociazione sul ghiaccio utilizzando pipetta P1000 facendo attenzione a non perdere alcun materiale nel trasferimento della pipetta. Risciacquare il piatto con ulteriori 1,5 ml di tampone di digestione portando il volume totale nel tubo di dissociazione a 3,25-3,50 ml.
6. Posizionare il tubo di dissociazione invertito sul dissociatore elettronico e eseguire il ciclo "m_brain_03_01", costituito da una rotazione unidirezionale di 1 min a 200 giri/min a temperatura ambiente, che è un programma precaricato. Assicurarsi che tutto il tessuto si trova nella parte inferiore del tubo di dissociazione a contatto con il tampone di digestione e il rotore per questo e tutti i passaggi rimanenti.
7. Posizionare il tubo di dissociazione nell'incubatore di scuotimento per 30 minuti a 200 giri/min a 37 °C.
8. Ripetere i passaggi 2.6 e 2.7 una volta in più. Dopo la seconda incubazione di 30 minuti eseguire un'ultima digestione meccanica utilizzando dissociatore elettronico come nella fase 2.6.
9. Interrompere la reazione aggiungendo 10 ml di tampone di flusso freddo e posizionare i tubi sul ghiaccio.

3. Preparazione della sospensione cellulare

1. Per creare una sospensione a cella singola, versare la reazione di digestione oculare interrotta attraverso un filtro da 40 μm posto sulla parte superiore di un tubo di centrifuga conico da 50 ml. Utilizzando lo stantuffo da una siringa da 2,5 ml, spingere tutti i restanti pezzi di tessuto oculare non digerito attraverso il filtro.
2. Lavare il tubo di dissociazione con 10 ml di flow buffer e risciacquare il filtro prima di utilizzare lo stesso pistone per passare nuovamente pezzi di tessuto oculare non digeriti attraverso il filtro.
3. Ripetere il passaggio 3.2 utilizzando 5 mL di Flow buffer.
4. Lavare il tubo di dissociazione e filtrare con un buffer di flusso finale di 10 ml.
   NOTA: Il volume totale della digestione e del buffer di flusso è di circa 38-40 mL per ogni campione.
5. Centrifugare il tubo conico a 400 x g per 10 min a 4 °C. Decantare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
6. Preparare una soluzione di lysing 1x aggiungendo una soluzione di lysing 10x all'acqua sterile. Rompere il pellet sfarfallando il tubo contro un altro tubo. Per lyse globuli rossi, aggiungere 1 mL di soluzione di lysing 1x per 30 s con vorticoso a temperatura ambiente (RT).
7. Interrompere la reazione con 20 mL di flow buffer.
8. Centrifugare il tubo conico a 400 x g per 10 min a 4 °C. Decantare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
9. Dissociare il pellet sfarfallando il tubo contro un altro tubo. Aggiungere 5 ml di HBSS freddo 1x per tubo.
10. Tubi di centrifuga a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspira il supernatante.

4. Colorazione della sospensione cellulare per fagociti mononucleari

1. Preparare 0,5 mL di macchia Viva/Morta per campione diluire il colorante Vivo/Morto 1:5.000 in HBSS freddo.
2. Aggiungere la macchia Live/Dead a ciascun campione utilizzando una pipetta P1000 assicurandosi di dissociare completamente il pellet. Trasferire campioni in tubi microtitolo da 1,2 ml.
3. Prendere una piccola aliquota (10 μL) per contare le cellule usando un emocitometro o un contatore automatico delle celle (vedere 4.4). Incubare campioni con macchia viva / morta per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
4. Contare le celle usando Trypan blue per determinare il numero di celle vive per campione.
   NOTA: In genere, 2 occhi di un topo C57BL/6J di 10-12 settimane contengono meno di 2 x 10^{6 cellule} viventi.
5. Lavare i campioni aggiungendo 400 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
6. Resuspend cellule completamente in 500 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
7. Bloccare fino a 5 x 10^{6 cellule} viventi in 50 μL di blocco F_c (diluizione 1:50 nel tampone di flusso freddo del CD16/CD32 del ratto purificato). Se più di 5 x 10^{6 cellule viventi,} aumentare i volumi in modo appropriato.
8. Aggiungere il blocco F_c al pellet assicurandosi di dissociare completamente il campione. Incubare per 20 min a 4 °C.
9. Aggiungere 50 μL di soluzione di colorazione degli anticorpi (vedere la tabella 1 per la scelta e la quantità di ciascun anticorpo incluso nella soluzione) per 5 x 10^{6 cellule viventi direttamente} alle cellule in blocco F_{c e} mescolare completamente. Incubare per 30 min a 4 °C.
   NOTA: Le quantità di anticorpi dipendono dalla configurazione del citometro del flusso e devono essere titole indipendentemente per ogni laboratorio e strumento. Cfr. tabella 2 per la configurazione dello strumento di filtri e specchi. Per titolare gli anticorpi, inizia con la raccomandazione del produttore e calcola l'indice di colorazione. Eseguire una prova di concentrazioni di anticorpi variabili (sia al di sopra che al di sotto della raccomandazione del produttore) e scegliere la concentrazione più bassa di anticorpi in cui viene mantenuto l'indice di colorazione. Inoltre, assicurarsi che la colorazione positiva sia meno luminosa del controllo monocolore. Utilizzare celle non macchiate per assicurarsi che le celle macchiate negativamente siano in scala e abbiano un picco a o meno di 1 x 10². Utilizzare una fluorescenza meno un controllo per definire le celle macchiate positivamente.
10. Lavare i campioni aggiungendo 700 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
11. Opzionalmente, dopo la colorazione degli anticorpi, i campioni possono essere fissati con 500 μL di paraformaldeide al 2% nel tampone di flusso. Fissare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, eseguire un lavaggio come descritto nella 4.10. Conservare campioni fissi a 4 °C. Le perline di conteggio devono essere aggiunte il giorno della raccolta dei dati della citometria del flusso. I campioni fissi devono essere eseguiti sul citometro di flusso in 1-2 giorni.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è corrosiva e un pericolo per la salute.
12. Lavare nuovamente i campioni utilizzando 500 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare metà del supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
13. Resuspend pellets e trasferire in un pozzo 96, piastra di dosaggio con fondo a U. Piastra di centrifuga a 400 x g per 5 min a 4 °C. Per decantare il supernatante, capovolgere la piastra e in un forte shake sganciare il liquido in un lavandino, senza disturbare il pellet.
14. In un nuovo tubo di micro mento da 1,2 ml, posizionare 50 μL di perline di conteggio ben vortexate.
15. Resuspend pellets in 96 piastra di pozzo in 200 μL di tampone di flusso freddo. Aggiungere la miscela cellulare sulla parte superiore delle perline del passaggio precedente. Eseguire su citometro di flusso in volume totale di 250 μL / micro tubo di formicolio.

5. Raccolta dei dati di citometria del flusso

1. Accendere e preparare il citometro a flusso. Le istruzioni qui elencate sono per un citometro laser modificato(tabella 2).
2. Eseguire un campione di test, che include una piccola aliquota per ogni campione, per assicurarsi che tutte le celle siano in scala per ogni rilevatore. Regolare le tensioni in modo che tutte le celle siano in scala.
3. Eseguire controlli a colori singoli (SCC) per ogni fluoroforo utilizzato nel cocktail di colorazione (Tabella 3). Posizionare il tubo del micro titer in un tubo di polistirolo da 5 ml più grande per posizionarlo sullo stadio del citometro di flusso.
   NOTA: I fluorofori delle radici come BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) e Alexa700 non richiedono lo stesso anticorpo del cocktail (ad esempio, CD19 PE per CD64 PE). Tuttavia, i fluorofori tandem come PE-CF594, PE-Cy7 o APC-Cy7 richiedono lo stesso anticorpo per scc come cocktail a causa della potenziale dissociazione dei fluorofori coniugati.
   1. Creare l'SCC per BV421 aggiungendo 2 gocce di perline di compensazione a un tubo di piastrellatura da 1,2 ml insieme a 1 μL di CD11c BV421 anti-mouse del criceto. Le perline di compensazione sono usate perché CD11c BV421 è un sottotipo lambda IgG piuttosto che kappa come descritto al 5.3.3. Incubare per 15 minuti a 4 °C. Aggiungere 0,2 mL di buffer di flusso.
   2. Crea l'SCC per il colorante Live/Dead aggiungendo una goccia di perline di colorazione positive (cappuccio verde) dalle perline reattive dell'ammina, seguita da 1 μL di colorante Vivo/Morto. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Aggiungere una goccia delle perline negative (tappo bianco) dalle perline reattive dell'ammina. Aggiungere 0,2 mL di buffer di flusso.
   3. Creare i restanti SCC aggiungendo una goccia di perline di colorazione positive (cappuccio verde) dal set di perline Ig kappa anti-ratto e anti-criceto, seguito dalla quantità di anticorpi elencata(tabella 3)in un tubo di tattuccio da 1,2 ml. Incubare per 15 min a 4 °C. Aggiungi una goccia delle perline negative (berretto bianco) dal set di perline Ig kappa anti-ratto e anti-criceto. Aggiungere 0,2 mL di buffer di flusso.
   4. Vortice tutte le miscele di perline completamente. Conservare scc a 4 °C per un massimo di 3 giorni.
      NOTA: L'SCC per topi reporter fluorescenti è cellule non contaminate.
   5. Quando si eseguono SCC, impostare tensioni tali che il campione SCC abbia un picco maggiore di qualsiasi fluorescenza per un campione di celle nello stesso canale del rivelatore. Inoltre, le tensioni devono essere impostate in modo che qualsiasi SCC abbia almeno una differenza di log 0,5 tra il picco dell'istogramma nel canale di interesse rispetto a qualsiasi altro canale (Figura 1).
4. Esegui esempi su eventi di mantenimento "Basso" al secondo sotto 4000. Se la portata non può essere abbassata in modo appropriato, diluire i campioni con un buffer di flusso freddo aggiuntivo. Registrare il volume aggiunto in quanto ciò sarà necessario per il calcolo del conteggio (vedere i risultati rappresentativi).
5. Raccogli almeno 3 x 10^{6 eventi} per esempio. Questo può essere superiore al numero di cellule a causa di granuli di pigmento e detriti che contano come eventi sul citometro.
6. Registrare una fluorescenza Meno Uno (FMO) per ogni fluoroforo diverso da Live/Dead per una corretta strategia di gating nella sezione 6.4. Un FMO è un campione che è stato macchiato con tutti i fluorofori tranne uno.
7. Pulire e arrestare il citometro di flusso secondo le istruzioni del produttore o della struttura.

6. Annotazione dei dati di citometria del flusso

1. Aprire un nuovo foglio di lavoro utilizzando il software di analisi. Importare file FCS dal citometro per tutti i campioni e i controlli a colori singoli.
2. Utilizzare le SCC per creare una matrice di retribuzione.
3. Applicare la matrice di compensazione ai campioni macchiati e alle FMO.
4. Utilizzare le FMO per determinare la colorazione positiva per disegnare cancelli.

Risultati

La figura 1 mostra istogrammi di frequenza non compensati per i CSC e le celle per il laser rosso: Alexa647, Alexa700 e APC-Cy7. Nella figura 1A, la linea magenta raffigurava il picco dell'SCC per Alexa647, mentre la linea ciano mostrava la differenza di log 0,5 prevista. Si noti che il picco in Alexa700 e APC-Cy7 era a sinistra (meno luminoso) della linea ciano. Si noti inoltre che le celle erano tutte a sinistra della linea magenta. Tutte le cellule a destra d...

Discussione

La citometria a flusso multi-parametro consente l'analisi quantitativa di più tipi di cellule in un tessuto complesso. In questo rapporto, descriviamo il rilevamento citometrico del flusso delle popolazioni di fagociti mononucleari, inclusi monociti, cellule dendritiche e sottoinsiemi di macrofagi, dopo lesioni laser nell'occhio del topo. Liyanage et al ha recentemente riportato una strategia di gating simile per rilevare neutrofili, eosinofili, linfociti, PC, macrofagi, macrofagi infiltrati e monociti^2...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per microcentrifuga da 0,6 ml	Fisher Scientific	05-408-120
Provette per microcentrifuga da 1,7 ml	Costar	3620
Pipette da 10 ml Fisher	Scientific	431031
coniche da 15 ml	ThermoFisher	339650
1x HBSS, 500 ml	Gibco	14025-092
Siringa da 2,5 ml	Henke Sass Wolf	7886-1
Soluzione di paraformaldeide al 20%	Microscopia elettronica Sciences	15713-S
Pipette da 25 ml	Fisher Scientific	431032
ago da 30 g	Exel	26437
Siringa luer lock da 3 ml	Fisher Scientific	14955457
piatto di pesata in polistirene 41 x 41 x 8 mm	Fisher Scientific	08-732-112
50 ml conici	Falcon	352070
96 pozzetti, piastra per saggio con fondo a U senza coperchio	Falcon	353910
Perle reattive all'ammina	ThermoFisher	A10628
Software di analisi	FlowJo	v 10
Set di perline Ig kappa anti-ratto e anti-criceto	BD Biosciences	552845
C57BL/6J topi	Jackson Laboratory	664
Contatore di cellule	Invitrogen	AMQAX1000
Vetrini contatore di cellule	Invitrogen	C10283
Perline di compensazione	ThermoFisher	01-1111-42
Perline di conteggio	ThermoFisher	01-1234-42
Pinze curve	Fisher Scientific	16-100-123
Enzima di digestione	Sigma Aldrich	5401020001
Microscopio da dissezione	National Optical and Scientific Instruments, Inc.	DC3-420T
Provette di dissociazione	Miltenyi Biotec	130-096-334
DNase	Roche	10104159001
Dissociatore elettronico	Miltenyi Biotec	130-095-937
FACS Diva software	BD Biosciences
Blocco Fc, ratto anti-topo CD16/CD32	BD Biosciences	553142
Pinze fini	Integra Miltex	17035X
Tampone di flusso	Miltenyi Biotec	130-091-221
Citometro	a flusso BD Biosciences
Tubi di flusso	Falcon	352008
Criceto anti-topo CD11c BV421	BD Biosciences	562782
Secchiello per il ghiaccio	Fisher Scientific	07-210-123
Colorante vivo/morto	ThermoFisher	65-0866-14
Soluzione di lisi, soluzione 10x	BD Biosciences	555899
Micro tubo per titolo e rack	Fisher	Scientific 02-681-380
Topo anti-topo CD64 PE	BioLegend	139304
Topo anti-topo NK1.1 PECF594	BD Biosciences	562864
Puntali per pipette P1000	Denville Scientific	Pipettatore P2404
P1000	Gilson	FA10006M
Puntali per pipetta P2	eppendorf	22491806
Pipettatore P2	Gilson	FA10001M
Pipettatore P20	Gilson	FA10003M
Puntali per pipetta P200	Denville Scientific	P2401
Pipettatore P200	Gilson	FA10005M
Pipet uomo	Fisher Scientific	FB14955202
Rat anti-mouse B220 PECF594	BD Biosciences	562313
Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7	BD Biosciences	557657
Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700	BD Biosciences	557958
Rat anti-mouse CD19 PE	BD Biosciences	553786
Topo anti-topo CD4 PECF594	BD Biosciences	562314
Anti-topo di ratto CD45 FITC	ThermoFisher	11-0451-82
Anti-topo di ratto CD45 PE-Cy7	BD Biosciences	552848
Anti-topo di ratto CD8 PECF594	BD Biosciences	562315
Anti-topo di ratto Ly6C	BD Biosciences
Anti-topo di ratto Ly6G PECF594	BD Biosciences	562700
Anti-topo di ratto MHC II AlexaFluor 700	BioLegend	107622
Anti-topo di ratto Siglec F PECF594	BD Biosciences	562757
Anti-topo di ratto Tim4 AlexaFluor647	BD Biosciences	564178
Incubatrice a scuotimento	Labnet	311DS
Forbici a molla	Fine Science Tools	15024-10
Filtro cellulare sterile, rete di nylon da 40 mm	Fisher Scientific	22363547
Acqua sterile, 500 ml	Gibco	A12873-01
Centrifuga a secchiello oscillante	eppendorf	5910 R
Trypan blue, soluzione allo 0,4%	Gibco	15250061