Caratterizzazione di cellule immunitarie e mediatori proinfiammatori in ambiente polmonare

Summary

Questo protocollo descrive l'uso della citometria a flusso per identificare i cambiamenti nella composizione delle cellule immunitarie, nel profilo delle citochine e nel profilo delle chemochine nell'ambiente polmonare dopo occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media, un modello murino di ictus ischemico.

Abstract

L'espansione, l'attivazione e il traffico delle cellule immunitarie ai polmoni, che sono controllati dall'espressione di citochine e chemochine multiple, possono essere alterati da gravi lesioni cerebrali. Ciò è evidenziato dal fatto che la polmonite è una delle principali cause di mortalità nei pazienti che hanno sofferto di ictus ischemico. L'obiettivo di questo protocollo è descrivere l'uso dell'analisi citometrica a flusso multicolore per identificare 13 tipi di cellule immunitarie nei polmoni dei topi, inclusi macrofagi alveolari, macrofagi interstiziali, cellule dendritiche (DC) CD103+ o CD11b+, DC plasmacitoidi, eosinofili, monociti/cellule derivate da monociti, neutrofili, cellule T e B derivate da linfoidi, cellule NK e cellule NKT, a seguito di induzione di ictus ischemico mediante occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media. Inoltre, descriviamo la preparazione di omogenati polmonari utilizzando un metodo di omogeneizzazione delle perle, per determinare i livelli di espressione di 13 diverse citochine o chemochine simultaneamente mediante array di perline multiplex accoppiati con analisi citometrica a flusso. Questo protocollo può anche essere utilizzato per studiare la risposta immunitaria polmonare in altri contesti patologici, come la malattia polmonare infettiva o la malattia allergica.

Introduction

I polmoni sono un organo barriera, esposti all'ambiente esterno e, pertanto, ricevono costantemente sfide immunologiche come agenti patogeni e allergeni¹. L'attivazione delle cellule immunitarie residenti nei polmoni e l'infiltrazione delle cellule immunitarie dalla periferia sono necessarie per eliminare i patogeni dall'ambiente polmonare. Inoltre, le cellule immunitarie residenti nei polmoni mantengono la tolleranza ai batteri commensali, suggerendo che queste cellule svolgono un ruolo nella clearance dei patogeni e nel mantenimento dell'omeostasi¹. I macrofagi alveolari e interstiziali sono tra le cellule immunitarie ....

Protocol

Tutti i protocolli e le procedure eseguite sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della West Virginia University. I topi sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni nel vivaio della West Virginia University.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare tampone di perfusione (soluzione salina tamponata fosfato, PBS). Utilizzare circa due aliquote da 10 ml di PBS ghiacciato per mouse.
2. Preparare il mezzo delle cellule polmonari/tampone FACS. Il tampone FACS contiene PBS integrato con siero bovino fetale all'1% (FBS). Mantenere il freddo medio per l'intero proce....

Results

Abbiamo recentemente riportato che l'induzione dell'ictus ischemico nei topi altera la composizione delle cellule immunitarie dei polmoni¹¹. In particolare, l'ischemia cerebrale transitoria ha aumentato le percentuali di macrofagi alveolari, neutrofili e DC CD11b +, mentre ha diminuito le percentuali di cellule T CD4 +, cellule T CD8 +, cellule B, cellule NK ed eosinofili nel compartimento polmonare. Inoltre, l'alterazione cellulare corrispondeva a livelli significativamente diminuiti di chemochin.......

Discussion

I protocolli qui descritti consentono l'identificazione dei tipi di cellule immunitarie polmonari e l'espressione di chemochine o citochine nello stesso topo. Se si desidera uno studio istopatologico, un lobo individuale può essere rimosso e fissato a tale scopo prima di procedere alle fasi di isolamento di una singola cellula. Una limitazione di questo metodo è che questo approccio potrebbe non essere adatto in alcuni contesti patologici se si prevede che il cambiamento nella composizione delle cellule immunitarie e l'e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B220-APC, clone RA3-6B2	Biolegend	103212	diluizione 1:200
Beadbug Omogeneizzatore di microsfere a 3 posizioni	Benchmark Scientific	D1030	Omogeneizzatore tissutale
CCR2-BV421, clone SA203G11	Biolegend	150605	diluizione 1:200
CD103-BV421, clone 2E7	Biolegend	121422	diluizione 1:200
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70	Biolegend	101216	diluizione 1:400
CD11c-PE/Cy7, clone N418	Biolegend	117318	diluizione 1:200
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418	Biolegend	117328	diluizione 1:200
CD4-BV421, clone GK1.5	Biolegend	100443	diluizione 1:200
CD45-FITC, clone 30-F11	Biolegend	103108	diluizione 1:200
CD64-APC, clone X54-5/7.1	Biolegend	139306	diluizione 1:200
CD8-PE, clone 53-6.7	Biolegend	100708	diluizione 1:800
Collagenasi D	Sigma Aldrich	11088882001	Componente nel tampone di dissociazione
Tubo conico con tappo a vite	ThermoFisher	02-681-344	Tubo per omogeneizzazione tissutale
DNasi I	Sigma Aldrich	10104159001	Componente del tampone di dissociazione
Blocco Fc Anticorpo CD16/32	Biolegend	101320	Diluizione 1:100
dissociatore genlteMACS	Miltenyi Biotec	130-093-235	Confronto della digestione polmonare con o senza dissociatore meccanico
Tubi gentleMACS C	Miltenyi Biotec	130-093-237	Tubo per la dissociazione dei tessuti con dissociatore genlteMACS
Arresto della proteasi e dell'inibitore della fosfatasi cocktial	ThermoFisher	78442	Componente nel tampone di omogeneizzazione
Monitor laser doppler	Moor	MOORVMS-LDF	Monitoraggio del flusso sanguigno durante il pannello di
chemochine proinfiammatorie	Biolegend	740451	Multiplex bead array
LIVE/DEAD fixable near-IR color	ThermoFisher	L34976	Da utilizzare per l'esclusione di cellule morte durante l'analisi citofluorimetrica
Ly6C-PE, clone HK1.4	Biolegend	128008	diluizione 1:800
Ly6G-BV510, clone 1A8	Biolegend	127633	diluizione 1:200
Sutura MCAO L56 riutilizzabile 6-0 terreno	Doccol	602356PK10Re	tMCAO
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2	Biolegend	107636	diluizione
1:800NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136	Biolegend	108728	diluizione 1:200
Siglec F-PE, clone E50-2440	BD Biosciences	552126	diluizione 1:200
Filo di sutura in seta, misura 6/0	Fine Science Tools	18020-60	tMCAO
Sistema di anestesia SomnoSuite	Kent Scientific	SS-01	Anestetizzazione del topo per tMCAO
TCRb-BV510, clone H57-897	Biolegend	109234	diluizione 1:200
Perle di zirconia/silice, 2,3 mm	Biospec	11079125z	Perle per omogeneizzazione tissutale