Articolo metodologico

Caratterizzazione di cellule immunitarie e mediatori proinfiammatori in ambiente polmonare

DOI:

10.3791/61359

⸱

24 giugno 2020

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive l'uso della citometria a flusso per identificare i cambiamenti nella composizione delle cellule immunitarie, nel profilo delle citochine e nel profilo delle chemochine nell'ambiente polmonare dopo occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media, un modello murino di ictus ischemico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'espansione, l'attivazione e il traffico delle cellule immunitarie ai polmoni, che sono controllati dall'espressione di citochine e chemochine multiple, possono essere alterati da gravi lesioni cerebrali. Ciò è evidenziato dal fatto che la polmonite è una delle principali cause di mortalità nei pazienti che hanno sofferto di ictus ischemico. L'obiettivo di questo protocollo è descrivere l'uso dell'analisi citometrica a flusso multicolore per identificare 13 tipi di cellule immunitarie nei polmoni dei topi, inclusi macrofagi alveolari, macrofagi interstiziali, cellule dendritiche (DC) CD103+ o CD11b+, DC plasmacitoidi, eosinofili, monociti/cellule derivate da monociti, neutrofili, cellule T e B derivate da linfoidi, cellule NK e cellule NKT, a seguito di induzione di ictus ischemico mediante occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media. Inoltre, descriviamo la preparazione di omogenati polmonari utilizzando un metodo di omogeneizzazione delle perle, per determinare i livelli di espressione di 13 diverse citochine o chemochine simultaneamente mediante array di perline multiplex accoppiati con analisi citometrica a flusso. Questo protocollo può anche essere utilizzato per studiare la risposta immunitaria polmonare in altri contesti patologici, come la malattia polmonare infettiva o la malattia allergica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I polmoni sono un organo barriera, esposti all'ambiente esterno e, pertanto, ricevono costantemente sfide immunologiche come agenti patogeni e allergeni1. L'attivazione delle cellule immunitarie residenti nei polmoni e l'infiltrazione delle cellule immunitarie dalla periferia sono necessarie per eliminare i patogeni dall'ambiente polmonare. Inoltre, le cellule immunitarie residenti nei polmoni mantengono la tolleranza ai batteri commensali, suggerendo che queste cellule svolgono un ruolo nella clearance dei patogeni e nel mantenimento dell'omeostasi1. I macrofagi alveolari e interstiziali sono tra le cellule immunitarie sentinella residenti nei polmoni che rilevano i patogeni tramite i recettori di riconoscimento dei modelli e eliminano questi patogeni mediante fagocitosi2. Le cellule dendritiche residenti nei polmoni collegano la risposta immunitaria innata e adattativa attraverso la presentazione dell'antigene3. Inoltre, le cellule immunitarie innate locali attivate producono citochine e chemochine che amplificano la risposta infiammatoria e stimolano l'infiltrazione di cellule immunitarie come monociti, neutrofili e linfociti nei polmoni1. È stato dimostrato che l'ictus ischemico modifica l'immunità sistemica e porta ad una maggiore suscettibilità alle infezioni polmonari; Tuttavia, pochi studi hanno valutato il compartimento polmonare dopo ictus ischemico, anche se alcuni studi lo hanno esaminato durante le condizioni infiammatorie 4,5,6,7,8,9. L'obiettivo dei metodi qui descritti è determinare simultaneamente la patologia polmonare, la composizione delle cellule immunitarie e i livelli di espressione di citochine e chemochine nei polmoni per valutare le alterazioni del compartimento polmonare e valutare potenziali alterazioni della risposta immunitaria polmonare dopo attacco ischemico.

Descritto qui è un protocollo per ottenere sospensioni a singola cellula dai polmoni dei topi per identificare 13 tipi di cellule immunitarie. Questo protocollo si basa sulla digestione dei tessuti con collagenasi D senza la necessità di un dissociatore tissutale automatizzato. Inoltre, abbiamo sviluppato un protocollo per preparare omogenati tissutali che possono essere utilizzati per determinare i livelli di espressione di 13 diverse citochine o chemochine utilizzando array di perline multiplex basati sulla citometria a flusso. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare gli effetti dell'ictus ischemico sull'immunità polmonare e può essere utilizzato anche in altri modelli di malattia.

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Protocollo

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Tutti i protocolli e le procedure eseguite sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della West Virginia University. I topi sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni nel vivaio della West Virginia University.

1. Preparazione delle soluzioni

  1. Preparare tampone di perfusione (soluzione salina tamponata fosfato, PBS). Utilizzare circa due aliquote da 10 ml di PBS ghiacciato per mouse.
  2. Preparare il mezzo delle cellule polmonari/tampone FACS. Il tampone FACS contiene PBS integrato con siero bovino fetale all'1% (FBS). Mantenere il freddo medio per l'intero processo di escissione e trasferimento polmonare. Preparare circa 8 ml per campione polmonare. Preparare un nuovo mezzo / tampone FACS prima degli esperimenti.
  3. Preparare il buffer di dissociazione per l'isolamento di una singola cella. Il tampone contiene 1 mg/mL di collagenasi D e 200 μg/mL di DNasi I nella soluzione salina tamponata di Hank (HBSS). Preparare fresco dalla soluzione madre (100 mg/mL collagenasi D e 10 mg/mL DNasi I) prima degli esperimenti. Sono necessari circa 6 ml per campione polmonare. Assicurarsi che il tampone raggiunga la temperatura ambiente prima dell'uso.
  4. Preparare il tampone di omogeneizzazione per l'omogeneizzazione del tessuto polmonare. Il tampone contiene PBS e 1x cocktail di inibitori della proteinasi e della fosfatasi (stock = 100x). Preparare appena prima degli esperimenti. Mantenere il buffer freddo durante l'intero processo di omogeneizzazione. Circa 200 μL del tampone sono sufficienti per omogeneizzare un singolo lobo destro dei polmoni.

2. Occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media (tMCAO)

NOTA: Le procedure per tMCAO tramite inserimento di monofilamenti nell'arteria cerebrale media sono state documentate in dettaglio in precedenza10. In questi esperimenti, sono stati utilizzati topi maschi C57BL / 6J di 8-12 settimane, del peso di 25-30 g.

  1. In breve, somministrare per via sottocutanea 2 mg/kg di meloxicam ai topi prima dell'intervento chirurgico. Anestetizzare profondamente i topi in una camera di induzione usando isoflurano al 5%. Confermare l'anestesia profonda utilizzando il metodo del pizzico del piede. Mantenere l'anestesia con isoflurano all'1-2% durante l'intervento chirurgico utilizzando un cono nasale. Mantenere la temperatura corporea a 36,5 - 38 °C durante tutta la procedura posizionando una coperta calda sotto i topi. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave un giorno prima dell'intervento.
  2. Rasare e preparare la pelle sul collo ventrale utilizzando etanolo al 70% seguito da scrub alla clorexidina. Somministrare per via sottocutanea 2 mg/kg di bupivacaina sull'area dell'incisione prima di effettuare la prima incisione. Utilizzare unguento per gli occhi per coprire gli occhi per prevenire la secchezza. Fai un'incisione del collo della linea mediana. Allontanare delicatamente i tessuti molli intorno alla trachea.
  3. Identificare l'arteria carotide comune sinistra e l'arteria carotide esterna.
  4. Applicare una sutura temporanea (taglia 6/0) all'arteria carotide comune per arginare il flusso del sangue. Fare un'incisione nell'arteria carotide esterna.
  5. Inserire un monofilamento rivestito di gomma siliconica (taglia 6-0) nell'arteria carotide esterna, quindi far avanzare il monofilamento verso l'arteria cerebrale media. Lasciare il monofilo nell'arteria cerebrale media per 60 minuti (occlusione).
  6. Monitorare la velocità del flusso sanguigno utilizzando Laser Doppler Flowmetry. Una riduzione della portata verso l'arteria cerebrale media che è > l'80% indica un'occlusione riuscita.
  7. Dopo i 60 minuti di occlusione, rimuovere il monofilo per consentire la riperfusione. Chiudere l'incisione.
  8. Nei topi operati fittizi, eseguire i passaggi 2.1-2.6 senza l'inserimento del monofilamento. In questi topi, la velocità del flusso sanguigno deve rimanere costante durante l'intera procedura.
  9. Monitorare i topi quotidianamente e misurare i deficit neurologici utilizzando i criteri di punteggio standard11. 0 – nessun deficit neurologico; 1 – ritrae la zampa anteriore controlaterale quando sollevata dalla coda; 2- cerchi al controlaterale quando sollevato dalla coda; 3- cadere al controlaterale mentre si cammina; 4 – non cammina spontaneamente o è in coma; 5 – morti.
  10. Fornire iniezioni sottocutanee di soluzione salina normale e analgesico (meloxicam, 2 mg / kg) ogni 24 ore per 3 giorni dopo l'intervento.
  11. Isolare i polmoni 24 e 72 ore dopo tMCAO per l'analisi a valle.

3. Raccolta dei tessuti polmonari

  1. Anestetizzare profondamente il topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina. Confermare l'anestesia profonda utilizzando il metodo del pizzico del piede.
  2. Per eseguire la perfusione transcardica di tutto il corpo12, fissare il mouse alla piattaforma chirurgica e bagnare la pelliccia con etanolo al 70% per ridurre la distribuzione della pelliccia nella cavità corporea. Utilizzare le forbici da dissezione fine per fare un'incisione trasversale nell'addome caudale e quindi un'incisione mediana del peritoneo, fermandosi nella cavità toracica prima di perforare il diaframma.
    1. Non tagliare il muscolo / nascondersi nella cavità peritoneale e non continuare l'incisione oltre l'addome.
  3. Interrompere l'incisione non appena la cavità toracica è stata raggiunta prima di perforare il diaframma. Fare attenzione a non danneggiare il cuore e i polmoni che possono compromettere la qualità della perfusione o il recupero cellulare
  4. Usando le forbici per dissezione fine, fai un'incisione mediana del peritoneo fermandosi nella cavità toracica prima di perforare il diaframma.
  5. Afferrare il topo per l'estremità distale dello sterno usando una pinza e sollevare verso l'alto mentre si taglia il diaframma assicurandosi di non danneggiare il cuore, i polmoni o la vascolarizzazione. Una volta che gli organi sono visibili, praticare un'incisione attraverso la gabbia toracica e separare e fissare la custodia toracica in modo che il cuore e i polmoni siano completamente esposti.
  6. Fare con attenzione una piccola incisione nell'atrio destro vicino all'arco aortico. Questo servirà come deflusso per la perfusione.
  7. Subito dopo, inserire delicatamente un ago da 25 G x 5/8 collegato a una siringa riempita con 10 ml di PBS freddo nella superficie superiore distale del ventricolo sinistro. Fare attenzione a non inserire attraverso il setto ventricolare nel ventricolo destro. L'ago dovrebbe essere appena inserito nel ventricolo sinistro.
    NOTA: Se il setto ventricolare viene perforato, il liquido uscirà dal naso del topo. Ciò ridurrà la qualità della perfusione e comporterà la perdita di cellule.
  8. Se lo si desidera, è possibile utilizzare un morsetto per tenere saldamente l'ago in posizione nel ventricolo sinistro durante la perfusione.
  9. Spingere costantemente ma delicatamente 10 ml di PBS freddo nel cuore. Il tessuto del topo dovrebbe iniziare a perfondersi e cancellare il sangue quando il fluido esce dall'atrio destro.
    1. Spingere una seconda aliquota di 10 mL di PBS fino a quando non si è verificata una sufficiente clearance del sangue. Il fegato avrà un aspetto marrone chiaro e i polmoni passeranno da un colore rosa rossastro a un colore prevalentemente bianco.
  10. Utilizzando una pinza e forbici per dissezione fine, rimuovere con cura tutti i tessuti circostanti tra cui cuore, trachea, esofago, timo, tessuto connettivo, linfonodi e bronchi di grandi dimensioni.
  11. Separare i singoli lobi polmonari e posizionare i lobi in una capsula di Petri su ghiaccio contenente un'aliquota di 1-2 ml di mezzo di cellule polmonari fredde.

4. Omogeneizzazione del tessuto polmonare per array di perline multiplex mediante omogeneizzatore di perline

  1. Pre-raffreddare un tubo conico con tappo a vite da 2 ml contenente 3 sfere sterili di zirconia/silice da 2,3 mm. Aggiungere 200 μL di tampone di omogeneizzazione a freddo al tubo.
  2. Pesare il lobo, trasferire il lobo sul tubo conico pre-raffreddato contenente le perle e il tampone di omogeneizzazione.
    NOTA: Circa 50-100 mg di tessuto omogeneizzato in 200 μL di tampone saranno sufficienti per rilevare l'espressione di citochine e chemochine nel campione.
    1. Omogeneizzare il lobo utilizzando un omogeneizzatore a base di perline (vedi Tabella dei materiali) a 4.000 giri / min per 2 minuti.
    2. Assicurarsi che il tessuto sia completamente omogeneizzato. Aumentare il tempo se necessario.
  3. Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare il tubo in una microcentrifuga pre-raffreddata (4 °C) a 15.870 x g per 3 minuti.
  4. Trasferire i surnatanti in un microtubo pre-raffreddato da 1,5 ml.
  5. Porre il campione direttamente sul ghiaccio per un uso immediato o conservare il campione a -80 °C per un uso futuro. Evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento.

5. Dissociazione del tessuto polmonare e isolamento di singole cellule

  1. Versare il mezzo delle cellule polmonari dei lobi polmonari rimanenti per evitare la diluizione del tampone di dissociazione. Quindi, inserire con cautela una siringa da 1 mL con 25G e 5/8 ago contenente 1 mL del tampone di dissociazione nel tessuto polmonare.
  2. Iniettare piccole frazioni (da 1/4 a 1/5di th) del tampone di dissociazione in ciascun lobo polmonare e gonfiare delicatamente.
    NOTA: la maggior parte del tampone uscirà subito dopo il gonfiaggio poiché il lobo è stato asportato.
  3. Ripetere l'iniezione del tampone di dissociazione 1-2x.
  4. Incubare i lobi polmonari con tampone di dissociazione per 2 minuti a temperatura ambiente.
  5. Tritare finemente i lobi polmonari in piccoli pezzi usando le forbici per dissezione fine.
  6. Trasferire i pezzi polmonari tritati con il tampone di dissociazione in una provetta da centrifuga da 15 ml.  Supplemento con tampone di dissociazione aggiuntivo per un totale di 6 ml. Vortice vigorosamente per 1 min.
  7. Incubare il campione per 45 minuti a 37 °C. Vortice vigorosamente ogni 7-8 minuti.
  8. Dopo 45 minuti di incubazione, vortice vigorosamente il campione per 1 minuto per risultati ottimali.
  9. Dissociare ulteriormente il campione passando attraverso un filtro cellulare da 100 μm per rimuovere il tessuto connettivo e interstiziale residuo, indesiderato.
  10. Centrifugare il campione per 10 minuti a 380 x g, scartare il surnatante.
  11. Aggiungere 5 ml di terreno di cellule polmonari fredde al campione. Risospendere il pellet cellulare mediante vortice delicato.
  12. Centrifugare il campione per 10 minuti a 380 x g, scartare il surnatante.
  13. Aggiungere 1 mL di mezzo di cellule polmonari fredde. Risospendere il pellet cellulare mediante vortice delicato.
  14. Passare attraverso un filtro cellulare da 100 μm e contare le cellule.

6. Analisi citometrica a flusso per la nicchia delle cellule immunitarie polmonari

  1. Semina 1-2 x 106 cellule/anticorpo in una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti (3 set in totale). Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .
  2. Risospendere il pellet cellulare in 50 μL di PBS freddo contenente colorazione vivi/morti fissabili. Preparare la macchia secondo le istruzioni del produttore.
  3. Incubare le cellule a 4 °C per 20 minuti al riparo dalla luce. Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .
  4. Risospendere il pellet cellulare con 25 μL di tampone FACS freddo contenente 5 μg/mL di anticorpo CD16/32 anti-topo. Incubare a 4 °C per 10-15 min.
  5. Aggiungere alle cellule 25 μL di tampone FACS freddo contenente combinazioni di anticorpi elencate nella Tabella 1 . Mescolare mediante pipettaggio delicato.
    NOTA: il volume totale del tampone FACS per la colorazione degli anticorpi è di 50 μL. Pertanto, quando si prepara una miscela master di anticorpi in 25 μL, la concentrazione di anticorpi deve essere doppia rispetto alla concentrazione finale.
  6. Incubare le cellule a 4 °C per 20 minuti al riparo dalla luce. Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .
  7. Risospendere le cellule con 100 μL di tampone FACS freddo. Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .
  8. Risospendere le cellule con 100 μL di tampone FACS freddo. Trasferire in un tubo FACS di polistirene a fondo tondo da 5 mL contenente 150 μL di tampone FAC aggiuntivo. Analizzare immediatamente il campione utilizzando un citometro a flusso.
    NOTA: la fissazione delle cellule utilizzando i seguenti passaggi consente di analizzare i campioni in un secondo momento.
  9. Dopo il punto 6.7, risospendere il campione con 100 μL di paraformaldeide all'1% in PBS.
  10. Incubare il campione a 4 °C per 15 minuti al riparo dalla luce. Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .
  11. Risospendere le cellule con 100 μL di tampone FACS freddo. Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .
  12. Risospendere le cellule con 100 μL di tampone FACS freddo. Conservare le celle a 4 °C, al riparo dalla luce. Analizzare il campione entro 72 h.

7. Array di perline multiplex per il rilevamento di citochine e chemochine

NOTA: I pannelli multiplex di chemochine proinfiammatorie e infiammazioni disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali) sono stati utilizzati per determinare l'espressione di chemochine e citochine nei polmoni dopo l'induzione di tMCAO secondo il protocollo del produttore, che è stato descritto in dettaglio13.

  1. In breve, scongelare gli analiti su ghiaccio se sono stati conservati a -80 °C dopo l'omogeneizzazione dei tessuti. Centrifugare il campione a 590 x g per 2 minuti a 4 °C prima dell'uso per rimuovere il tessuto residuo.
  2. Generare una curva standard diluendo in serie il cocktail standard (C7) che è ad una concentrazione nota di 10 ng/mL in 7 standard (C1-6) con l'ultimo standard che è il solo tampone di analisi (C0).
  3. Una volta che tutti i reagenti si sono riscaldati a temperatura ambiente, aggiungere 25 μL di ciascun standard e 25 μL di tampone di dosaggio a una piastra a V inferiore a 96 pozzetti.
  4. A ciascun pozzetto del campione, aggiungere 25 μL di omogenato polmonare (analita) e 25 μL di tampone di dosaggio a una piastra del pozzetto V inferiore a 96 pozzetti
  5. Vortice le sfere pre-rivestite vigorosamente, quindi aggiungere 25 μL di perle pre-rivestite a ciascuno dei pozzetti standard e campione.
  6. Sigillare la piastra e proteggere dalla luce coprendo con un foglio. Agitare la piastra a 110 giri/min per 2 ore a temperatura ambiente.
  7. Centrifugare a 230 x g per 5 min. Aggiungere 200 μL di tampone di lavaggio a 1x (la soluzione madre è 20x, diluire a 1x con acqua). Incubare per 1 min.
  8. Centrifugare a 230 x g per 5 min. Risospendere lo standard e campionare con anticorpi di rilevamento da 25 μL.
  9. Sigillare e coprire la piastra per proteggerla dalla luce. Agitare la piastra a 110 giri/min per 1 h a temperatura ambiente.
  10. Aggiungere 25 μL di streptavidina-ficoeritrina (SA-PE) a ciascun standard e campionare il pozzetto.
  11. Sigillare e coprire la piastra per proteggerla dalla luce. Agitare a 110 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente.
  12. Ruotare la piastra a 230 x g per 5 minuti. Risospendere lo standard e i campioni in 1x tampone di lavaggio.
  13. Trasferire in un tubo FACS da 5 mL di polistirene a fondo tondo ben etichettato contenente ulteriori 150 μL di tampone di lavaggio 1x.
  14. Determinare l'intensità di fluorescenza del segnale PE per gli standard e i campioni utilizzando un citometro a flusso.
  15. Costruire una curva standard per ogni chemochina e citochina utilizzando l'intensità media di fluorescenza (MFI) di PE rispetto alle concentrazioni predeterminate.
  16. Determinare la concentrazione di ciascuna chemochina e citochina utilizzando la curva standard e l'MFI di ciascun campione. Il pannello multiplex fornisce un software di analisi dei dati che può essere utilizzato per determinare la concentrazione di ciascun analita. Il peso del lobo apicale/superiore viene utilizzato per determinare la concentrazione di citochine o chemochine per milligrammo di tessuto.

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Risultati

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Abbiamo recentemente riportato che l'induzione dell'ictus ischemico nei topi altera la composizione delle cellule immunitarie dei polmoni11. In particolare, l'ischemia cerebrale transitoria ha aumentato le percentuali di macrofagi alveolari, neutrofili e DC CD11b +, mentre ha diminuito le percentuali di cellule T CD4 +, cellule T CD8 +, cellule B, cellule NK ed eosinofili nel compartimento polmonare. Inoltre, l'alterazione cellulare corrispondeva a livelli significativamente diminuiti di chemochin...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I protocolli qui descritti consentono l'identificazione dei tipi di cellule immunitarie polmonari e l'espressione di chemochine o citochine nello stesso topo. Se si desidera uno studio istopatologico, un lobo individuale può essere rimosso e fissato a tale scopo prima di procedere alle fasi di isolamento di una singola cellula. Una limitazione di questo metodo è che questo approccio potrebbe non essere adatto in alcuni contesti patologici se si prevede che il cambiamento nella composizione delle cellule immunitarie e l'e...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH P20 GM109098 e dall'Innovation Award Program da Praespero a Edwin Wan. Gli esperimenti di citometria a flusso sono stati eseguiti nella WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, supportata dalle sovvenzioni NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 e P20 GM103434.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
B220-APC, clone RA3-6B2Biolegend103212diluizione 1:200
Beadbug Omogeneizzatore di microsfere a 3 posizioniBenchmark ScientificD1030Omogeneizzatore tissutale
CCR2-BV421, clone SA203G11Biolegend150605diluizione 1:200
CD103-BV421, clone 2E7Biolegend121422diluizione 1:200
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70Biolegend101216diluizione 1:400
CD11c-PE/Cy7, clone N418Biolegend117318diluizione 1:200
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418Biolegend117328diluizione 1:200
CD4-BV421, clone GK1.5Biolegend100443diluizione 1:200
CD45-FITC, clone 30-F11Biolegend103108diluizione 1:200
CD64-APC, clone X54-5/7.1Biolegend139306diluizione 1:200
CD8-PE, clone 53-6.7Biolegend100708diluizione 1:800
Collagenasi DSigma Aldrich11088882001Componente nel tampone di dissociazione
Tubo conico con tappo a viteThermoFisher02-681-344Tubo per omogeneizzazione tissutale
DNasi ISigma Aldrich10104159001Componente del tampone di dissociazione
Blocco Fc Anticorpo CD16/32Biolegend101320Diluizione 1:100
dissociatore genlteMACSMiltenyi Biotec130-093-235Confronto della digestione polmonare con o senza dissociatore meccanico
Tubi gentleMACS CMiltenyi Biotec130-093-237Tubo per la dissociazione dei tessuti con dissociatore genlteMACS
Arresto della proteasi e dell'inibitore della fosfatasi cocktialThermoFisher78442Componente nel tampone di omogeneizzazione
Monitor laser dopplerMoorMOORVMS-LDFMonitoraggio del flusso sanguigno durante il pannello di
chemochine proinfiammatorieBiolegend740451Multiplex bead array
LIVE/DEAD fixable near-IR colorThermoFisherL34976Da utilizzare per l'esclusione di cellule morte durante l'analisi citofluorimetrica
Ly6C-PE, clone HK1.4Biolegend128008diluizione 1:800
Ly6G-BV510, clone 1A8Biolegend127633diluizione 1:200
Sutura MCAO L56 riutilizzabile 6-0 terrenoDoccol602356PK10RetMCAO
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2Biolegend107636diluizione
1:800NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136Biolegend108728diluizione 1:200
Siglec F-PE, clone E50-2440BD Biosciences552126diluizione 1:200
Filo di sutura in seta, misura 6/0Fine Science Tools18020-60tMCAO
Sistema di anestesia SomnoSuiteKent ScientificSS-01Anestetizzazione del topo per tMCAO
TCRb-BV510, clone H57-897Biolegend109234diluizione 1:200
Perle di zirconia/silice, 2,3 mmBiospec11079125zPerle per omogeneizzazione tissutale
tMCAO LEGENDplex

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777(2018).
  3. Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
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  5. Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
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