Approccio genetico in avanti a cellule vive per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo nella chlamydia trachomatis

Sommario

Questo protocollo utilizza promotori-reporter fluorescenti, microscopia a cellule vive e estrazione di inclusione individuale in un approccio genetico diretto in avanti per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo della Chlamydia trachomatis.

Abstract

Il patogeno batterico intracellulare Chlamydia trachomatis subisce un ciclo di sviluppo costituito da due forme di sviluppo morfologicamente discrete. Il corpo elementare non replicativo (EB) avvia l'infezione dell'host. Una volta all'interno, l'EB si differenzia nel corpo reticolato (RB). L'RB subisce quindi più cicli di replica, prima di differenziarsi di nuovo alla forma EB infettiva. Questo ciclo è essenziale per la sopravvivenza del clamidiale in quanto il mancato passaggio da un tipo di cellula all'altro impedisce l'invasione dell'host o la replica.

Le limitazioni nelle tecniche genetiche dovute alla natura intracellulare obbligata della clamidia hanno ostacolato l'identificazione dei meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo del tipo di cellula. Abbiamo progettato un nuovo sistema plasmid dual promoter-reporter che, in combinazione con la microscopia a cellule vive, consente la visualizzazione della commutazione del tipo di cellula in tempo reale. Per identificare i geni coinvolti nella regolazione dello sviluppo del tipo di cellula, il sistema promotore-reporter delle cellule vive è stato sfruttato per lo sviluppo di un approccio genetico in avanti combinando la mutagenesi chimica del ceppo dual reporter, l'imaging e il monitoraggio della clamidia con la cinetica dello sviluppo alterata, seguita dall'isolamento clonale dei mutanti. Questo flusso di lavoro genetico in avanti è uno strumento flessibile che può essere modificato per l'interrogatorio diretto in una vasta gamma di percorsi genetici.

Introduzione

Chlamydia trachomatis (Ctr) è un patogeno intracellulare obbligato che progredisce attraverso un ciclo di sviluppo bifasico che è essenziale per la sua sopravvivenza e proliferazione¹. Questo ciclo è costituito da due forme di sviluppo, il corpo elementare (EB) e il corpo reticolato (RB). L'EB è replica incompetente, ma media l'invasione cellulare attraverso l'endocitosi indotta^{dall'effetto 2}. Una volta nell'host, l'EB matura fino al RB replicativo. L'RB esegue più cicli di replica prima di ri convertirsi all'EB al fine di avviare successivi cicli di infezione.

La gamma limitata di strumenti genetici ha limitato la maggior parte della ricerca clamidiale a studi biochimici o all'uso di sistemi surrogati. Di conseguenza, la chiarimenta della regolazione genica e il controllo del ciclo di sviluppo è stato difficile^3,4. Una delle sfide più importanti nel campo del clamidia è il monitoraggio temporale ad alta risoluzione del ciclo di sviluppo della clamidia e l'identificazione delle proteine coinvolte nella sua regolazione. L'espressione genica durante il ciclo di sviluppo chlamydiale è stata tradizionalmente eseguita da metodi distruttivi "end point", tra cui RNAseq, qPCR e microscopia a cellule fisse^5,6. Anche se questi metodi hanno fornito informazioni preziose, le tecniche impiegate sono laboriose e hanno bassa risoluzione temporale^5,6.

Nell'ultimo decennio, la manipolazione genetica del Ctr è progredito con l'introduzione della trasformazione plasmide e dei metodi per la mutagenesi^7,8,9. Per questo studio, è stato sviluppato un sistema basato su plasmide per monitorare lo sviluppo di clamidiali nelle inclusioni individuali in tempo reale nel corso di un'infezione. È stato creato un trasformatore clamidiale che esprimeva sia un promotrice-reporter specifico di tipo cella RB che EB. Il reporter specifico RB è stato costruito fondendo il promotore del primo gene RB euo a monte della proteina fluorescente Clover. EUO è un regolatore trascrizionale che reprime un sottoinsieme di geni associati alla cecone^{EB 10}. Il promotore di hctB, che codifica una proteina istone-simile coinvolta nella condensazione nucleoide EB, è stato clonato direttamente a monte di mKate2 (RFP) per creare il reporter specifico EB¹¹. La spina dorsale per hctBprom-mKate2/euoprom-Clover era p2TK2SW2⁷. I promotori di hctB ed euo sono stati amplificati dal DNA genomico Ctr-L2. Ogni sequenza di promotore consisteva di 100 coppie di basi a monte del sito di inizio della trascrizione previsto per il gene clamidiale specificato più i primi 30 nucleotidi (10 aminoacidi) del rispettivo ORF. Le varianti di FP fluorescenti sono state ottenute commercialmente come blocchi genivi ottimizzati per il codon Ctr e clonate nel telaio con i primi 30 nucleotidi di ogni gene e promotore clamidiale. Il terminatore incD è stato clonato direttamente a valle di mKate2. Il secondo promotore-reporter è stato inserito a valle del terminatore incD. Il gene di resistenza all'ampicillina (bla) in p2TK2SW2 è stato sostituito con il gene aadA (resistenza alla spectinomicina) da pBam4. Ciò ha portato al costrutto finale p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figura 1A) che è stato trasformato in Ctr-L2⁷. Questo ceppo di reporter RB/EB ha permesso l'osservazione del ciclo di sviluppo all'interno di singole inclusioni utilizzando la microscopia a cellule vive (Figura 1B,C).

Impiegando il nostro costrutto promotore-reporter in combinazione con la mutagenesi chimica, è stato ideato un protocollo per tracciare e isolare singoli cloni che mostravano anomalie dello sviluppo da popolazioni mutagenate di Ctr sierovar L2. Questo protocollo consente il monitoraggio diretto delle singole inclusioni clamidiali, il monitoraggio dei profili di espressione genica nel tempo, l'identificazione dei cloni clamidiali che esprimono un modello di espressione genica dello sviluppo alterata e l'isolamento clonale della clamidia dalle singole inclusioni.

Anche se questo protocollo è stato creato appositamente per l'identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo del clamidiale, potrebbe essere facilmente adattato per interrogare qualsiasi numero di vie genetiche clamidiali.

Protocollo

Tutti gli script Python utilizzati in questo protocollo sono disponibili su Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Mutagenare Reporter Chlamydia

NOTA: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/ euo prom-Clover EB sono stati direttamente mutati utilizzando metanosulfonato etilo (EMS) nel supporto assonale CIP-1 in quanto questo supporto supporta ilmetabolismoEB e il mantenimento dell'infettività EB¹².

1. Scongelare un brodo di clamidia su ghiaccio contenente 3 x 10⁷ EB trasformati con il pre2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover reporter plasmid e pellet a >14,000 x g per 30 min a 4 .
   NOTA: gli organismi di clamidia utilizzati per questi esperimenti sono stati purificati e congelati a -80 gradi centigradi nel buffer 1x saccarosio-fosfato-glutammato (SPG).
2. Scartare il supernatante e risuspendere il pellet EB in 100 L di tampone CIP-1 con sonicazione su ghiaccio al 10% di potenza per 10 s. Dividere i 100 L di sospensione EB in due aliquot da 50 L per campioni trattati mutagenati e finti.
3. Preparare 20 mg/mL della soluzione EMS-CIP-1 in un tubo di microcentrifuge separato da 1,5 mL. A tale scopo, aggiungere 6,8 L di EMS in 375 L volume totale.
4. Aggiungere 50 L della soluzione EMS-CIP-1 in uno degli aliquot clamidiali per la mutagenesi e 50 L di CIP-1 solo all'altro aliquot di clamidia per la mutagenesi simulata.
   NOTA: la concentrazione finale dello SME è di 10 mg/mL. L'angolo di clamidiale, la concentrazione di EMS e il tempo di esposizione utilizzato in questo protocollo portano a una riduzione di circa il 60-80% della progenie infettiva. Questo livello di riduzione corrisponde a 5-20 lesioni del DNA per genoma clamidiale⁸.
5. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Gli EB mutagenati saranno utilizzati direttamente per infettare i monostrati nella sezione 2.
   CAUTION: EMS è un noto cancerogeno. Tutte le attrezzature e i materiali che entrano in contatto con EMS devono essere immersi in 1 M NaOH per 24 h prima dello smaltimento, i guanti devono essere utilizzati in ogni momento durante il protocollo e la pulizia dei materiali EMS.

2. Imaging di Ctr mutante

1. Coltura cellulare ospitante per l'imaging e l'isolamento del Ctr mutagenato
   1. Seme di una piastra inferiore in vetro 6 con 6 x 10⁵ cellule Cos-7 (ATCC) per pozzo in 2 mL di supporto completo (RPMI-1640 integrato con 10% siero bovino fetale e 10 mg/mL gentamicin). Utilizzare questa lastra di fondo in vetro per l'imaging del Ctr mutagenato.
   2. Semina una piastra di polistirolo ben 24 con 1 x 10⁵ celle Cos-7 (ATCC) per pozzo in 1 mL supporto completo. Utilizzare questa piastra di polistirolo per la reinfezione della clamidia isolata di interesse.
   3. Incubare entrambe le piastre al 5% di CO₂, 37 gradi centigradi per circa 18 h. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, sostituire i supporti con supporti completi integrati con 1 g/mL di cicloheximide e incubare durante la notte.
2. Infettare la coltura delle cellule host con Ctr mutagenato
   1. Infettare 5 pozzetti della piastra di fondo in vetro con 6 x 10⁵ MB mutagenati in HBSS a 1,5 mL/ben ghiacciato. Ciò si tradurrà nel MOI di 0,3 dollari, poiché si prevede un tasso di mortalità del 70% a causa della mutagenesi.
   2. Infettare il pozzo rimanente con 2 x 10⁵ EBs finti mutagenati in HBSS freddo di 1,5 mL/well ice. Senza mutagenesi, aspettatevi meno mortalità, quindi un terzo dell'inoculum viene utilizzato per raggiungere il MOI di 0,3 dollari.
      NOTA: IL MOI di 0,3 assicura che le cellule host siano infettate da un singolo EB e consente una separazione sufficiente tra le cellule infette per l'isolamento clonale.
   3. Incubare la piastra per 15 minuti, con dondolo, a 37 gradi centigradi.
   4. Lavare le cellule ospitanti infette con HBSS preriguero (37 gradi centigradi) contenente 1 epatina mg/mL seguita immediatamente da un risciacquo HBSS. Ripetere il lavaggio dell'epatina, risciacquare immediatamente 2x con HBSS per garantire che l'epatina venga rimossa.
      NOTA: L'eparla inibisce e può invertire le prime interazioni elettrostatiche tra la cellula ospite e gli EB¹³. I lavaggi di epatina rimuovono gli EB che devono ancora entrare nelle cellule host, sincronizzando l'infezione. Quando le celle di lavaggio lo fanno delicatamente per evitare di spostare le cellule dalla superficie dei pozzi. Le soluzioni HBSS ed epaina contengono EMS residuo e devono essere collocate in un becher contenente 1 M NaOH per 24 h prima dello smaltimento.
   5. Sostituite l'HBSS con 4 mL/pozzo di supporti di imaging preriscaldato (37 gradi centigradi) (supporto completo, cicloheximide 1 g/mL, 20 mM HEPES e nessun rosso fenolo).
   6. Riempire gli spazi interwell con preriguermed (37 gradi centigradi) deionized H₂O per aiutare nel controllo della temperatura e ridurre l'evaporazione. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi con 5% CO₂ per 10 h.
3. Configurazione e imaging al microscopio
   NOTA: l'imaging fluorescente a cellule vive multicolore multicolore viene utilizzato per raccogliere immagini time-lapse per identificare mutanti clamidiali che differiscono nelle dinamiche dell'espressione genica dello sviluppo. Questo protocollo utilizza il pacchetto software open source di Manager per il controllo automatizzato del microscopio¹⁴.
   1. Iniziare la configurazione del microscopio 10 h dopo l'infezione. Impostare l'incubatrice di fase del microscopio su 5% CO₂, 37 gradi centigradi. Collocare la piastra inferiore in vetro 6 nell'incubatrice di fase e inserire il termore del campione nell'interwell H₂O.
   2. Calibrare lo stage XY utilizzando il plug-in High Content Screening (HCS). Fare clic su Plugins Strumenti di acquisizione Generatore di siti HCS nel software di controllo del microscopio di Manager (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
   3. Selezionare il modello di piastra a 6 well e generare un elenco di posizione di imaging costituito da 12 campi di visualizzazione (FOV) per pozzo all'interno del plug-in HCS (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Aprite l'Elenco posizione stage e impostate manualmente la posizione iniziale per ogni FOV utilizzando il plug-in Controllo stage (JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Regolare le coordinate XY di qualsiasi FOV che contiene celle mancanti o non contiene un monostrato uniforme.
      NOTA: A causa del tempo necessario per l'immagine da acquisire, è possibile acquisire un numero massimo di 72 FOV per ogni intervallo di 30 minuti.
   4. Utilizzare un obiettivo 20x per l'imaging. Questo ingrandimento consente di eseguire l'immagine di 8 inclusioni per FOV, pur fornendo la risoluzione desiderata.
   5. Salvare l'elenco delle posizioni in quanto verrà utilizzato per individuare le inclusioni di interesse dopo l'analisi dei dati (JoVE61365_screenfile7).
   6. Utilizzare l'opzione Messa a fuoco automatica nel software di imaging per impostare la messa a fuoco per l'imaging automatico (JoVE61365_screenfile8).
   7. Usa le selezioni e i valori seguenti per produrre i risultati dello stato attivo più coerenti usando la messa a fuoco automatica basata sull'immagine in . Nella finestra delle proprietà Messa a fuoco automatica selezionare OughtaFocus dal menu a discesa e utilizzare le impostazioni seguenti. OughtaFocus-SearchRange_m: 350, OughtaFocus-Tolerance_m: 0,5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Yes, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Channel:
      NOTA: la riduzione della finestra di imaging di messa a fuoco automatica riducendo il fattore di ritaglio consente una messa a fuoco automatica più coerente. Se si seleziona Sì per OughtaFocus-ShowImages, l'utente può visualizzare l'immagine di messa a fuoco automatica.
   8. Catturare la cinetica del ciclo di sviluppo mediante l'imaging per 24 h con intervalli di tempo di 30 minuti (JoVE61365_screenfile9). L'imaging tra 12-36 HPI assicura che La clamidia completi il ciclo di sviluppo ma non lyse la cella ospite.
   9. Immagine dei monostrati cellulari con un'esposizione di 250 ms con un'intensità del 4% e del 18% rispettivamente nei canali GFP e RFP(JoVE61365_screenfile10). Rileva il segnale del trifoglio (GFP) per eccitazione a 470 nm con un filtro per le emissioni del bandpass da 514/30 nm. Rilevare il segnale mKate2 (RFP) per eccitazione a 595 nm e con un filtro per le emissioni del bandpass da 641/75 nm.
      NOTA: Ridurre al minimo l'intensità dell'eccitazione è fondamentale per ridurre al minimo la fotovoltaia del fluoroforo e la fototossicità alla Clamidia. L'intensità minima di eccitazione per generare un'immagine risolta con un'esposizione di 200-300 ms deve essere determinata empiricamente negli studi pilota.
   10. Catturate più sezioni z con un intervallo di messa a fuoco che termina su entrambi i lati della sezione in-focus. In questo esperimento, con un ingrandimento 20x, questo è stato ottenuto con 4 fette a 10 gradini(JoVE61365_screenfile11).
   11. Selezionare Relativo per l'imaging di più sezioni nella finestra di acquisizione. L'opzione relativa , utilizza la posizione del piano di stampa salvata nell'elenco delle posizioni di imaging come punto di partenza per l'intervallo di tempo successivo. Immettere i valori di offset z appropriati per i canali di imaging a fluorescenza (JoVE61365_screenfile12).
       NOTA: Il sistema di messa a fuoco basato su immagini è imperfetto e in un periodo di imaging di 24 h questo porta alla deriva di messa a fuoco. Si è scoperto che catturando 3-4 piani focali per ogni punto di tempo è stata mantenuta un'immagine a fuoco. Per correggere le differenze nei piani focali tra i canali di immagine fluorescenti e il canale DIC, è necessario correggere l'offset z. Sarà necessaria la determinazione empirica di questo offset z.
   12. Salvare le immagini selezionando la directory radice e assegnando un nome all'esperimento. Utilizzate l'opzione file stack immagine di Manager per salvare le immagini come file di stack tiff (JoVE61365_screenfile13).
   13. Registrare i dettagli sperimentali nella casella Commenti acquisizioni della finestra Acquisizione multiD (JoVE61365_screenfile13). vale a esempio, Bene A1: Controllo non trattato. Bene A2-3 e B1-3: Mutanti EMS. Immagine: 12-36HPI. Avviare l'acquisizione dell'immagine a 12 HPI.
       NOTA: se si utilizza il comando , lasciare il programma, la configurazione sperimentale e l'hardware del microscopio in esecuzione al termine dell'esperimento. I siti di imaging saranno riviti per l'isolamento dell'inclusione una volta completata l'analisi della popolazione mutagenata.

3. Identificare e isolare la clamidia mutagenata con fenotipi dello sviluppo alterati

1. Creazione di una pila di immagini in primo tempo
   1. Estrarre l'immagine più attiva dalle pile di z utilizzando i dati dell'immagine salvati che contengono 4 sezioni per punto di tempo. Utilizzare l'opzione di misurazione della curtosi ( Misurare) in ImageJ/FIJI per identificare automaticamente la sezione più a fuoco - sezione (punteggio di curtosi più alto) e creare una nuova pila di immagini con solo queste immagini in-focus. Uno script Python è incluso come file supplementare (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) per automatizzare questo processo.
2. Quantificare l'espressione di fluorescenza nelle singole inclusioni
   NOTA: per quantificare la cinetica dell'espressione dei due reporter utilizzare l'applicazione di analisi delle immagini open source ImageJ/FIJI e il plugin Trackmate¹⁵. Trackmate identifica i "punti" (corrispondenti alle inclusioni in questo caso) e li segue attraverso uno stack di immagini time-lapse che registra la posizione X,Y e l'intensità del segnale per ogni inclusionenel tempo( JoVE61365_screenfile14 ). Queste informazioni vengono salvate come file CSV e verranno importate in un blocco appunti Python personalizzato per l'analisi.
   1. Aprire la pila di immagini ridotta a fuoco in ImageJ/FIJI utilizzando l'utilità di importazione dei formati bio facendo clic su Plugins . Bio-Formati Importatore di bio-formati. Selezionare Hyperstack e Composito (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
   2. Sottrarre lo sfondo dell'immagine facendo clic su Processo Sottrarre lo sfondo utilizzando un raggio della sfera di rotolamento di 50,0 pixel e migliorare il contrasto dell'immagine allo 0,3% per i pixel saturi (Processo Migliora contrasto). Moltiplicare i valori dell'immagine per 10,0 (Processo Proprietà Math . Moltiplica) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
   3. In Trackmate (Plugins Proprietà Tracking . Trackmate), selezionare un diametro del BLOB stimato di 48 pixel (determinato empiricamente in base alle dimensioni dell'inclusione alla fine dell'imaging). Produrre tracce di inclusione non frammentate selezionando una distanza massima di collegamento e una distanza massima di chiusura di 8,0 pixel e uno spazio massimo di frame di chiusura gap di 1 ( JoVE61365_screenfile23- JoVE61365_screenfile25).
      NOTA: Per migliorare la capacità di Trackmate di identificare e tenere traccia delle inclusioni nell'intero ciclo, viene creato un canale immagine separato aggiungendo i canali del prom euoprom e hctButilizzando la funzione matematica dell'immagine in ImageJ/FIJI. Questo canale viene quindi utilizzato da Trackmate per identificare e seguire le inclusioni nel tempo. I valori fluorescenti dei canali di prom euo e hctBprom vengono quindi registrati nei canali 2 e 3.
   4. Registrare le tracce che soddisfano una durata continua minima: Durata della traccia: 20 (JoVE61365_screenfile26). Analizzare le tracce e salvare i punti nelle statistiche traccia come file CSV (JoVE61365_screenfile27).
      NOTA: questo processo è stato automatizzato utilizzando uno script Python personalizzato fornito nei dati supplementari (TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
3. Identificare le tracce di inclusione con profili di sviluppo alterati
   NOTA: per identificare le inclusioni contenenti Chlamydia con profili di sviluppo alterati, ogni traccia di inclusione è stata visualizzata utilizzando il notebook Python. Queste visualizzazioni consentono l'identificazione di inclusioni con profili di espressione genica cinetica che differivano dalla popolazione trattata in modo fittizio. Il notebook Python utilizzato per l'identificazione delle inclusioni con programmazione dello sviluppo alterata è fornito nei dati supplementari (EMS_Screen-Markdown).
   1. Importa i dati della traccia di inclusione dai file CSV delle statistiche Spot in tracks in Pandas utilizzando la cella Import nel EMS_Screen-Markdown Python Notebook.
   2. La linea di base corregge ogni traccia sottraendo il valore minimo di ogni traccia dal resto dei valori della traccia utilizzando le celle Sottrai linea di base. Salvare i valori risultanti come file di sottaceto utilizzando la cella Salva come sottaceto. In questo modo i valori del canale verranno salvati in modo permanente dopo la sottrazione della linea di base per un successivo recupero.
      NOTA: la sottrazione della linea di base imposta l'intensità fluorescente iniziale di ogni inclusione su zero.
   3. Eliminare le tracce dalle inclusioni vicino ai bordi del FOV utilizzando la cella Filtra bordi poiché i profili fluorescenti potrebbero non essere completamente acquisiti; queste tracce possono produrre profili di sviluppo falsi positivi.
   4. Calibrare i valori del fotogramma (totalFrames) dalle sezioni dell'immagine ai valori di tempo (startTime, interval) con la cella Time-lapse Calibration utilizzando l'ora di inizio sperimentale e l'intervallo di tempo di imaging. Escludere le letture di inclusione parziale filtrando le tracce che non si estendono negli ultimi 20 h dell'esperimento (16-36 HPI) utilizzando la cella Filtro durata traccia.
   5. Separare le tracce in singoli frame di dati in base alla condizione sperimentale con la cella Assegna trattamento. Filtrare le inclusioni che presentano una crescita sufficiente utilizzando la cella Filtro per crescita. Nella cella Filtro per crescita, impostare empiricamente la soglia di intensità di fluorescenza per il canale del prom euomodificando i valori all'interno delle ultime due righe di codice. Questo scenografo Chlamydia che non è cresciuto.
      NOTA: quando si impostano i filtri di soglia, se il filtro è troppo basso, i grafici a dispersione risultanti saranno rumorosi, ma se il filtro è impostato su mutanti importanti troppo alti potrebbero essere eliminati.
   6. Calcolare la mortalità percentuale causata da EMS dividendo il numero di tracce mutagenizzate/bene per il numero di tracce/tracce trattate in modo fittizio/bene. Moltiplicare il numero di tracce trattate in modo fittizio per il fattore di diluizione iniziale di 3 per calcolare il numero di tracce/ben trattate in modo fittizio. Utilizzare le celle Conteggio tracce di inclusione e Calcola mortalità percentuale per eseguire questa attività.
   7. Calcolare il tempo a espressione semi-massima per i giornalisti in anticipo e in ritardo per ogni traccia utilizzando la cella Calcola. Questi valori saranno utilizzati per confrontare popolazioni mutagene e fittizie per identificare i mutanti dello sviluppo.
   8. All'interno della cella Half-Max Plot utilizzare il pacchetto di plottaggio bokeh per visualizzare il tempo a metà-max espressione di ogni promotore, grafico il tempo di prom euoa espressione semi-massima rispetto a quella del prom hctB. Identificare le inclusioni dalla popolazione mutante che non rientrano nella nube di dispersione trattata in modo fittizio utilizzando l'esploratore id traccia interattivo bokeh. Prendere nota delle coordinate FOV e XY delle inclusioni di interesse (Figura 2).
      NOTA: selezionare le inclusioni candidate che non rientrano visivamente nel cloud di controllo come verifica e valutazione statistica di ogni clone verranno eseguite successivamente.
   9. All'interno della cella Grafico animato visualizzare le modifiche nella cinetica dell'espressione promoter in modo dinamico nel tempo, rappresentando graficamente le intensità di espressione di euoprom rispetto al prom hctButilizzando lo strumento di stampa Plotly¹⁶. La funzione scatter di Plotly viene utilizzata per animare l'espressione genica nel tempo (Video 1).
   10. Visualizzare uno snapshot dal grafico animato Plotly nella cella Inclusion Locator, tracciando l'espressione delprom euo prom e hctBin un momento specifico (ad esempio 28 HPI) utilizzando il pacchetto bokeh (Figura 3). Identificare le inclusioni dalla popolazione mutante come descritto nel passaggio 3.3.8.
       NOTA: Questa analisi deve essere eseguita rapidamente (<4 h) poiché le inclusioni sono ancora in espansione e inizierà a lyse cellule host 48 h dopo l'infezione.
4. Isolare i mutanti dello sviluppo dalle inclusioni di interesse
   NOTA: Per isolare la clamidia dalle inclusioni che sono state determinate per visualizzare la regolazione genica alterata è stato impiegato un micromanipolatore con aghi capillari. Le coordinate Well ID, FOV e X,Y delle inclusioni di interesse sono state determinate utilizzando la visualizzazione dei dati nella sezione 3.3.
   1. Preparare gli aghi capillari tenendo il centro del tubo capillare in una fiamma e tirando entrambe le estremità del tubo capillare fino a quando non si è separato. Creare un'apertura nell'ago capillare tirato rompendo la punta tirata su un scivolo al microscopio. Per rompere l'ago, posizionare la punta chiusa sulla porzione smerigliata del farse al microscopio ad angolo e applicare la pressione.
      NOTA: le specifiche dei tubi capillari erano 1,0 mm D.D., 0,5 mm I.D.
   2. Controllare che l'apertura dell'ago sia approssimativamente delle dimensioni di un'inclusione al microscopio, obiettivo 20x.
   3. Prepull 25-30 aghi capillari per l'isolamento delle inclusioni dei candidati (un ago per inclusione).
   4. Riempire il microiniettore con olio minerale assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.
   5. Attaccare un ago capillare di vetro al microiniettore ed espellere l'olio sulla punta dell'ago, espellendo eventuali bolle d'aria. Posizionare l'ago capillare in un supporto completo e disegnare i supporti a metà strada. Riempire l'ago capillare con supporti previene la contaminazione dell'olio nel pozzo.
   6. Utilizzando l'elenco delle posizione salvate in 2.3.5, eseguire la migrazione al pozzo e foV di un'inclusione di interesse identificata nel blocco appunti di visualizzazione Python.
   7. Utilizzare il joystick del micromanipulatore per localizzare l'ago capillare alle coordinate XY dell'inclusione di interesse.
   8. Utilizzare il canale di eccitazione di 595 nm per visualizzare gli EB per l'estrazione e il canale di luce bianca phase/DIC per la visualizzazione dell'ago. Manovra l'ago capillare per l'inclusione, rompere l'inclusione e poi disegnare gli EBs nell'ago capillare utilizzando il microiniettore.
   9. Espellere gli EB dall'ago capillare in un unico pozzo della piastra di polistirolo preparata al punto 2.1.2. Rimuovere l'ago capillare e sostituirlo con un ago capillare fresco per la prossima estrazione di inclusione. Ripetere la sezione 3.4 per tutte le inclusioni candidate.
      NOTA: per l'espansione e per garantire un titer abbastanza alto per la ri-imaging, incubare isolati mutanti in un incubatore di CO₂, 37 gradi centigradi fino a quando la maggior parte delle cellule ospitanti sono infettate (1 settimana). I pozzi dovrebbero essere monitorati attentamente in quanto diversi isolati possono presentare tassi di crescita diversi.
5. Raccogliere isolati mutanti
   1. Sul ghiaccio, interrompere il monostrato infetto raschiando con una punta di micropipetta da 1 mL. Trasferire i supporti, i detriti delle cellule e la Chlamydia rilasciata in un tubo microcentrifuge da 1,5 mL.
   2. Pellet Chlamydia per centrifugazione per 30 min a 4 gradi centigradi, >14.000 x g. Rimuovere il pellet supernatant e resuspend in 75 L di ghiaccio freddo 1x SPG. Aliquot in tre tubi microcentrifuge a vite da 1,5 mL. Conservare a -80 gradi centigradi.

4. Verifica dei fenotipi isolari mutanti

1. Coltura cellulare host per l'imaging di isolati mutagenati
   1. Semina una piastra inferiore in vetro 96 con 1,6 x 10⁴ celle Cos-7 (ATCC) per pozzo in 100 l di supporti completi. Incubare al 5% CO₂, 37 . Le cellule dovrebbero raggiungere la confluenza in circa 24 h. Dopo che le cellule sono confluenti, sostituire i supporti con supporti completi integrati con cicloheximide 1 g/mL, incubare durante la notte.
2. Infettare le cellule con isolati candidati per la verifica fenotipico
   1. Thaw cloni mutanti e chlamydia wildtype sul ghiaccio.
   2. Nella piastra del pozzo preparato 96, eseguire una diluizione seriale su due volte degli isolati mutanti, utilizzando una colonna per isolato (11 colonne). Iniziare con una diluizione iniziale di 1:20 in HBSS 100.
      NOTA: la diluizione seriale della clamidia viene eseguita per garantire che i campioni mutanti siano immagini in un MOI < 1.
   3. Infettare la colonna rimanente (12a) con Chlamydia wildtype a MOI 0,5.
      NOTA: Wildtype Chlamydia viene utilizzato come controllo per il confronto con gli isolati mutageni.
   4. Incubare per 15 minuti a dondolo a 37 gradi centigradi.
   5. Lavare le cellule ospitanti infette con HBSS preriguersato (37 gradi centigradi) con 1 mg/mL di eparla e HBSS come specificato nella sezione 2.2.
   6. Sostituirlo con 200 L per pozzo di supporti di imaging prebellico (37 gradi centigradi).
   7. Riempire gli spazi interwell con preriguermed (37 gradi centigradi) deionized H₂O.
   8. Incubare al 5% CO₂, 37 c per 10 h.
3. Configurazione del microscopio
   NOTA: fare riferimento alla sezione 2.3 per la configurazione del microscopio, questa sezione conterrà solo le modifiche di installazione necessarie.
   1. Selezionare il modello di piastra 96 bene dal plugin HCS.
   2. Determina empiricamente i pozzi corrispondenti a un MOI < 1 per ogni isolato mutante. L'espressione del trifoglio sotto il controllo del promotore euo è osservabile a 10 HPI rendendo possibile la visualizzazione anticipata delle inclusioni ( Figura1B).
   3. Selezionare tre pozzetti per isolata mutata che corrispondono a un MOI < 1 e generare un elenco di posizione di imaging costituito da due FOV per pozzo.
      NOTA: solo 72 immagini possono essere prese per intervallo di tempo a causa di vincoli hardware, questo equivale a tre diluizioni (pozzi) per ceppo utilizzando due siti di imaging per pozzo se vengono 12 campioni.
   4. Registrare il ciclo di sviluppo di ogni isolato mutante per 36 h a intervalli di tempo di 30 minuti a partire da 12 HPI.
   5. Registrare i dettagli sperimentali nella casella Commenti acquisizioni. vale a i., ad esempio, ben ABC1: controllo wildtype. Bene ABC2: ceppo mutante 1, ABC3: ceppo mutante 2, ecc ... Immagini: 12-48 HPI.
   6. Avviare l'acquisizione dell'immagine a 12 HPI.

5. Analisi dei dati per la verifica dell'isolamento

1. Creare pile di immagini in-focus e quantificare l'espressione di fluorescenza nelle singole inclusioni
   1. Generare tracce di intensità fluorescente per ogni inclusione come specificato nella sezione 3.1 - 3.2.
2. Verificare gli isolati mutagenati Ctr
   NOTA: per verificare i profili di sviluppo alterati degli isolati mutanti, i relativi profili di espressione vengono confrontati con il profilo dell'espressione wildtype utilizzando il blocco appunti Python. Il notebook Python utilizzato per la verifica dei cloni mutanti con programmazione dello sviluppo alterata è disponibile nei dati supplementari (clone_check-Markdown).
   1. Importare e filtrare i dati di traccia di inclusione nel blocco appunti python clone_check-Markdown come descritto nella sezione 3.3.
   2. Calcolare la media e la deviazione standard (STD) dalle tracce di ogni popolazione di controllo isolato e wildtype utilizzando la cella Calcola media e STD.
   3. Con la tabella Graph Iso vs WT, tracciare la media e l'errore standard della media (SEM) di ogni clone mutante rispetto al controllo wildtype per determinare se la cinetica dell'espressione mutante è divergente rispetto al campione wildtype (Figura 4).
   4. Determinare se la popolazione mutante isolata è clonale tracciando le tracce mutanti e confrontandole con le tracce di inclusione wildtype utilizzando un grafico a dispersione come illustrato nella sezione 3.3 (passaggi 3.3.7-3.3.10) (Figura 2, Figura 3). Se l'isolato è una popolazione mista, il grafico mostrerà una popolazione sovrapposta a wildtype e una seconda popolazione distinta al di fuori della nube di dispersione wildtype. Se la popolazione sembra mista, il mutante può essere nuovamente isolato utilizzando la procedura originale descritta nella sezione 3.4.
      NOTA: Per determinare se il profilo di sviluppo di un isolato è statisticamente diverso da wildtype, le curve per ogni isolato devono essere confrontate con wildtype utilizzando ANOVA.

Risultati

La mutagenesi diretta dello SME del nostro ceppo clamidiale promotore-reporter ha comportato una riduzione dell'infettività del 75%. Utilizzando il protocollo di imaging a cellule vive descritto, sono state registrate e monitorate 600 inclusioni in un periodo di 24 ore. La cinetica dell'espressione fluorescente di entrambi i reporter in ogni inclusione è stata vista utilizzando script di notebook Python personalizzati. Sono stati implementati due approcci di visualizzazione per identificare la clamidia mutagenata can...

Discussione

La dissezione dei meccanismi che controllano il ciclo dello sviluppo della clamidia è stata ostacolata dalle limitazioni degli strumenti genetici attualmente disponibili. Impiegando il nostro promotore-reporter Chlamydia in combinazione con la microscopia automatizzata a cellule vive, è stato costruito un sistema che consente il monitoraggio dello sviluppo del tipo di cellula nelle singole inclusioni in un periodo di 24 ore. Questo sistema, in combinazione con la mutagenesi chimica e l'isolamento diretto dell'in...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre in polistirene a 24 pozzetti	Corning	3524	Crescita di colture cellulari per la reinfezione di isolati
Piastre con fondo in vetro a 6 pozzetti	Cellvis	P06-1.5H-N	Crescita di colture cellulari per l'imaging
Piastre con fondo in vetro a 96 pozzetti	Nunc	165305	Crescita di colture cellulari per l'imaging
Unità CO2 Bold line	OKO Labs	CO2 UNIT BL	Controllo CO2 dell'incubatore a stadi
Bold line T Unit	OKO Labs	H301-T-UNIT-BL-PLUS	Controllo della temperatura dell'incubatore a tavolino
capillari in vetro borosilicato	Sutter Instrument	B1005010	Tubi capillari
Filtro per le emissioni passa-banda BrightLine (514/30nm)	Semrock	FF01-514/30-25	Cubo filtrante fluorescente
Filtro per le emissioni passa-banda BrightLine (641/75nm)	Semrock	FF02-641/ 75-25	Cubo filtrante fluorescente
CellTram Vario	Eppendorf	5196000030	Microiniettore
Chlamydia trachmatis sierotipo L2	ATCC	VR-577	Chlamydia trachomatis
CIP-1 media	In house	NA	Axenic media. IPB integrato con l'1% di FBS, 25 μ Amminoacidi M, 0,5 mM G6P, 1,0 mM ATP, 0,5 mM DTT e 50 μ M GTP, UTP e CTP. (Omsland, A. 2012) realizzato internamente.
Cellule Cos-7 (ATCC)	ATCC	CRL-1651	Cellula renale di scimmia verde africana (cellule ospiti)
Cicloesimide	MP Biomedicals	194527	Inibitore della crescita delle cellule ospiti
Etilmetansulfonato, 99%	Acros Organics	AC205260100	Mutagen
Fetal Plex	Gemini Bio-Products	100-602	Integratore per terreni di crescita di base
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/Fiji	NA	Software di analisi delle immagini. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S Incubatore a CO2	Eppendorf	CO1700100X	Blocchi di incubazione per colture cellulari
(varianti FP fluorescenti: Clover e mKate2)	DNA Technologies	NA	gblock ORF di varianti FP ottimizzate per Ctr per la clonazione in p2TK2SW2
Gentamycin 10mg/ml	Gibco	15710-064	Antibiotico per terreni di crescita
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)	Corning	21-020-CM	Risciacquo delle cellule ospiti
Eparina sodica	Amersham Life Science	16920	inibisce e inverte le prime interazioni elettrostatiche tra la cellula ospite e gli EB
HEPES 1M	GE Life Sciences	SH30237.01	Tampone pH per terreni di crescita
InjectMan	Eppendorf	5179 000.018	Micromanipolatore
Jupyter Notebook	https://jupyter.org/	NA	Visualizzazione delle tracce di inclusione. https://jupyter.org/
Lambda 10-3	Sutter Instrument	LB10-3	Controllo della ruota portafiltri
Oko Touch	OKO Labs	Oko Touch	Interfaccia per controllare la linea Bold T e l'unità CO2
Prima della fase XY	Prior	H107	Tavolino per microscopio XY motorizzato
Centrifuga PrismR	Labnet	C2500-R	Microcentrifuga a temperatura controllata
Problot Forno di ibridazione Labnet		H1200A	Incubatore a dondolo per infezione da Chlamydia
Proscan II	Prior	H30V4	XYZ controllore di tavolino per microscopio
Purificatore Classe 2 Cabina di biosicurezza	Labconco	362804	Lavoro di coltura cellulare
RPMI-1640 (senza rosso fenolo)	Gibco	11835-030	Terreni di crescita di base per l'imaging
RPMI-1640 (rosso fenolo)	GE Life Sciences	SH30027.01	Terreno di crescita di base
oscilloscopioLED di eccitazione LED (470nm, 595nm)	oscilloscopio LED	F140	Luce di eccitazione
Dismembratore sonico Modello 500	Fisher Scientific	15-338-550	Sonicatore, pellet di clamidia risoluto
Incubatore a tavolino	OKO Labs	H301-K-FRAME	Camera di incubazione della piastra a pozzetti a grappolo
tampone saccarosio-fosfato-glutammato 1X (SPG)	Tampone di	della	clamidia NA interno. (10 mM di fosfato di sodio [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM di saccarosio, 0,50 mM di acido L-glutammico; pH 7,4)
Fiasche T-75	Thermo Scientific	156499	Crescita cellulare Microscopio
invertito TE 300	Microscopio Nikon	16724
THOR LED	Thor Labs	LEDD1B	Luce bianca
Tripsina	Corning	25-052-CI	Rimuove le cellule ospiti dal pallone per la semina in piastre
Zyla sCMOS	Andor	ZYLA-5.5-USB3
µ Manager 2.0gamma	https://github.com/micro-manager/micro-manager	NA	Pacchetto software per il controllo automatizzato del microscopio a fonti aperte