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Articolo metodologico

Un modello di coltura cellulare per la produzione di titoli di epatite ad alto tire e virus

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DOI:

10.3791/61373

⸱

26 giugno 2020

 ,  ,  , 
1Molecular and Medical Virology, Ruhr University Bochum

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descritto qui è un metodo efficace su come produrre elevati stock di titro virale del virus dell'epatite E (HEV) per infettare in modo efficiente le cellule dell'epatoma. Con il metodo presentato, sia le particelle virali non avvolte, sia le particelle virali avvolte possono essere raccolte e utilizzate per inoculare varie linee cellulari.

Abstract

Il virus dell'epatite E è la principale causa di cirrosi epatica e insufficienza epatica con crescente prevalenza in tutto il mondo. Il virus dell'RNA a singolo filamento è trasmesso prevalentemente da trasfusioni di sangue, condizioni sanitarie inadeguate e prodotti alimentari contaminati. Ad oggi il farmaco off-label ribavirin (RBV) è il trattamento di scelta per molti pazienti. Tuttavia, resta da identificare un trattamento specifico heV. Finora, le conoscenze sul ciclo di vita e sulla patogenesi HEV sono state gravemente ostacolate a causa della mancanza di un efficiente sistema di coltura cellulare HEV. Un robusto sistema di coltura cellulare è essenziale per lo studio del ciclo di vita virale che include anche la patogenesi virale. Con il metodo qui descritto si possono produrre titer virali fino a 3 x 106 messa a fuoco formando unità/mL (FFU/mL) di HEV non invilita e fino a 5 x 104 FFU/mL di HEV inviluppo. Utilizzando queste particelle, è possibile infettare una varietà di cellule di origini diverse, tra cui cellule primarie e umane, così come linee cellulari animali. La produzione di particelle HEV infettive da plasmidi pone una fonte infinita, il che rende questo protocollo estremamente efficiente.

Introduzione

L'epatite E è una malattia abbastanza sottovalutata con una crescente prevalenza in tutto il mondo. Circa 20 milioni di infezioni provocano più di 70.000 decessi all'anno1. L'agente sottostante, il virus dell'epatite E (HEV), è stato riassegnato di recente ed è ora classificato all'interno della famiglia Hepeviridae tra cui i generi Orthohepevirus e Piscihepevirus. HEV di varie origini sono classificati all'interno della specie Orthohepevirus A-D compresi isolati da esseri umani, suini, conigli, ratti, uccelli e altri mammiferi2. Attualmente, sono stati identificati otto diversi genotipi (GT) del virus dell'RNA a singolo filamento positivo e a filamentosingolo 2. Sebbene differiscano nella loro identità di sequenza, nelle vie di trasmissione e nella distribuzione geografica, la loro struttura genomica è altamente conservata. Più specifico, il genoma HEV da 7,2 kbp è diviso in 3 grandi frame di lettura aperti (ORF1-3). Mentre ORF1 codifica tutti gli enzimi necessari per una replicazione di successo all'interno della cellula ospite, ORF2 codifica la proteina capside, e la proteina ORF3 opera come un canale ionico funzionale necessario per l'assemblaggio e il rilascio di particelle infettive3. Una volta rilasciato nel lume basale o apicale HEV esiste in entrambe, quasiavvolto e non-avvolto/nudo specie a seconda se il virus proviene da sangue o feci, rispettivamente4,5.

Mentre GT1 e GT2 si trovano principalmente nei paesi in via di sviluppo che infettano esclusivamente gli,esseri umani6 attraverso la via fecale-orale, GT3, GT4 e GT7 si verificano prevalentemente nei paesi sviluppati1,7 con una varietà di specie che servono come serbatoi, ad esempio, suini8, ratto9, pollo10,11, cervo12, mangusta13, pipistrello14, coniglio15,16, cinghiale17 e molti altri7,18,19, fornendo prove di zoonosi7,20,21. Oltre a condizioni sanitarie inadeguate23 e prodotti alimentari contaminati12,24,25,26, trasmissione tramite trasfusione di sangue e trapianti di organi è possibile anche27,28. HEV è una causa comune di cirrosi epatica e insufficienza epatica29 soprattutto nei pazienti con malattia epatica preesistente, individui immunocompromessi (genotipo 3, 4 e 7) e donne incinte (genotipo 1). Da notare, ci sono anche manifestazioni extraepatiche come la malattia ematopoietica30,31,32, disturbi neurologici33 e lesioni renali34.

Ad oggi, il farmaco off-label ribavirin (RBV) è il trattamento di scelta per molti pazienti infetti35,36. Tuttavia, sono stati segnalati casi di fallimento del trattamento e scarsi esiti clinici a lungo termine. Il fallimento del trattamento è stato collegato alla mutagenesi virale e all'aumento dell'eterogeneità virale nei pazienti cronicamente infetti37,38,39. Al contrario, un recente studio multicentrico retrospettivo europeo non è stato in grado di correlare le mutazioni della polimerasi al fallimento del trattamento RBV40. Nelle osservazioni cliniche e negli esperimenti in vitro, l'interferone41,42,43, il sofosbuvir44,45, i sali di zinco46 e la silvestrol47,48 hanno anche mostrato effetti antivirali. Ciò nonostante, rimane un trattamento specifico HEV, ostacolato dalla mancanza di conoscenza circa il ciclo di vita HEV e la sua patogenesi. Pertanto, è urgentemente necessario un solido sistema di coltura cellulare per gli studi virologici e lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali49.

Sfortunatamente, come altri virus dell'epatite, HEV è difficile da propagare nelle linee cellulari convenzionali e di solito progredisce molto lentamente portando a bassi carichi virali. Tuttavia, alcuni gruppi sono stati in grado di aumentare i carichi virali con la generazione di subcloni linea cellulare50 o la regolazione dei supplementi multimediali51. Recentemente la generazione di cloni cDNA52 e l'adattamento del paziente primario isola passando53,54 ulteriormente migliorato la propagazione HEV nella coltura cellulare55. In questo protocollo, abbiamo usato il genoma di una coltura cellulare adattata ceppo Dikernow-C1 (noto come p6_WT)54 e un ceppo mutante che ospita una mutazione che migliora la replicazione (indicata come p6_G1634R)37. Kernow-C1 è il ceppo più usato nella coltura cellulare HEV ed è in grado di produrre carichi virali elevati. Valutando i numeri di copia dell'RNA virale, la replicazione HEV può essere monitorata in vitro. Tuttavia, queste tecniche non consentono la valutazione del numero di particelle infettive prodotte. Pertanto, abbiamo stabilito una colorazione immunofluorescenza per determinare le unità di formatura a fuoco (FFU/mL).

Il metodo qui descritto56 può essere utilizzato per produrre particelle virali infettive a tutta lunghezza che sono in grado di infettare una varietà di tipi di cellule provenienti da diverse origini, tra cui cellule primarie e linee cellulari di mammiferi. Questo è un prerequisito fondamentale per decifrare aspetti importanti dell'infezione e del tropismo HEV. Non è necessario l'inoculazione con isolati di pazienti solitamente limitati. La produzione di particelle HEV infettive da plasmidi pone una fonte infinita, il che rende questo protocollo relativamente efficiente. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per la genetica inversa che consente lo studio dell'alterazione del genoma identificato in vivo e il loro impatto sulla replicazione e la forma fisica dell'HEV. Questa tecnica supera molti limiti e, può tracciare la strada per lo sviluppo di farmaci, gli studi di mutagenesi e la valutazione delle interazioni virus-ospite come fattori di restrizione o di ingresso.

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Protocollo

NOTA: tutti gli esperimenti vengono eseguiti in condizioni BSL-2. Tutti i materiali che entrano in contatto con l'RNA del virus dell'epatite E o il virus infettivo devono essere sciacquati correttamente con il 4% di Kohrsolin FF da un contenitore di rifiuti all'interno del cofano prima dello smaltimento.

1. Preparazione plasmide

  1. Inoculare 200 mL Di lB contenente 100 g/mL ampicillina con Escherichia coli JM109 trasformato che incorpora una codifica plasmidper la sequenza full-length HEV gt3 Kernow-C1p6 (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 o pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). Incubare per 16 h a 37 gradi sotto agitazione permanente (170 giri/min).
    NOTA: L'isolamento plasmide è stato effettuato utilizzando un kit di estrazione plasmide (vedere Tabella dei materiali).
  2. Seguendo il protocollo di fabbricazione, girare giù 200 mL di coltura durante la notte a 6.000 x g e 4 gradi centigradi per 10 min e scartare il supernatante. Il pellet batterico può essere congelato e conservato a -20 gradi centigradi.
    1. Risospendere il pellet batterico in 4 mL di resuspension buffer pipetting su e giù con una pipetta sierologica da 10 mL e un uomo pipetta. Inoltre, il vortice rigorosamente.
    2. Aggiungere 4 mL di tampone di lisi preriscaldato (30-40 gradi centigradi). Invertire delicatamente per più volte e incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
    3. Aggiungere 4,8 mL di buffer di neutralizzazione, invertire delicatamente e assicurarsi che il lisa è quantitativamente neutralizzato (vedi descrizione del produttore). Quindi centrifugare a 11.000 x g e 4 gradi centigradi per 20 min.
    4. Mettere un pezzo di mull di 2 cm x 2 cm all'interno di una punta non filtrata da 1 mL, caricare risospeso, sollesiato e neutralizzato in pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere 1 mL di punta con mull alla punta della pipetta sierologica e filtrare il supernatante in un nuovo tubo da 50 mL.
      NOTA: Supernatant può essere conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di 30 min se necessario.
    5. In diverse fasi si applica73 l'uno del supernatale filtrato su un totale di 4 colonne di filtro (fornite nel kit) e centrifuga a 11.000 x g per 30 s. Scartare il flow-through e ripetere questa sequenza fino a quando tutte le colonne del supernatale non vengono applicate sulle colonne del filtro.
    6. Lavare due volte ogni colonna di filtro con 500 luna di lavato preriscaldato (50 gradi centigradi) lavare il tampone AW a 11.000 x g per 30 s e scartare il flusso in seguito.
    7. Lavare ogni colonna di filtro con 600 gradi di tampone di lavaggio A4 centrifugando a 11.000 x g per 30 s. Scartare il flusso attraverso e asciugare le colonne di filtro per centrifugazione a 11.000 x g per 2 min.
    8. Eluire il DNA plasmide da ogni colonna di filtro trasferendo 60 l di tampone di eluizione al centro delle colonne del filtro. Incubare per 1 min a RT e centrifugare a 11.000 x g per 1 min.
    9. Combinare elua e misurare la concentrazione del DNA plasmide estratto utilizzando uno spettrofotometro.

2. Linearizzazione e purificazione del DNA

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Figura 1: Configurazione sperimentale schematica per la linearizzazione plasmide e la purificazione del DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: La linearizzazione aumenta la resa dell'RNA durante la trascrizione in vitro (passaggio 3)

  1. Per linearizzare il DNA plasmide (Figura 1) mescolare 10 g del DNA del modello (estratto al punto 1), 10 L del buffer, 2 L di MluI e regolare ad un volume di 100 L con H2O.
    1. Incubare per 1 h a 37 gradi e confermare la linearizzazione del plasmide mediante elettroforesi gel agarose (ad esempio, caricare DNA plasmide non digerito e digerito [1 LEGA di DNA ciascuno] su un gel di agarose dell'1% ed eseguire l'elettroforesi a una corrente costante di 120 V).
  2. Seguendo il protocollo dei produttori per l'estrazione del DNA (vedere Tabella dei materiali, Figura 1), mescolare 500 l di buffer di legame, fornito nel kit, con 100 l l di DNA linearizzato. Applicare il campione a una colonna di filtro e centrifugare a 17.800 x g per 30 s. Eliminare il flusso attraverso e posizionare le colonne del filtro nello stesso tubo.
    1. Lavare la colonna del filtro aggiungendo 650 luna di lavaggio buffer e centrifugazione a 17.800 x g per 30 s. Scartare il flusso attraverso e posizionare la colonna del filtro nello stesso tubo. Per rimuovere il buffer di lavaggio residuo, centrifugare secco a 17.800 x g per 60 s e posizionare ogni colonna di filtro in un tubo di microcentrifuga pulito da 1,5 mL in seguito.
    2. Elute DNA trasferendo 60 -L di preriscaldato H2O (grado PCR, 70 gradi centigradi) al centro del filtro. Incubare per 1 min a 70 gradi centigradi e centrifugare a 18.000 x g per 1 min. Misurare la concentrazione del DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro.
      NOTA: Conservare il DNA a -20 gradi centigradi fino alla trascrizione in vitro.

3. Trascrizione in vitro del genotipo HEV a lunghezza intera 3 p6 DNA e purificazione dell'RNA

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Figura 2: Configurazione sperimentale schematica per la trascrizione in vitro e la purificazione dell'RNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: la trascrizione in vitro è necessaria per produrre RNA genomico virale dal DNA plasmide.

  1. Per il mix di trascrizione in vitro 20 -L di buffer di trascrizione 5x T7, 10 mM DTT, 100 U di inibitore ribonuclease, 25 mM ATP, CTP e UTP, 12,5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 g di modello di DNA linearizzato e 80 U.U. di RNA polimera. Riempire fino a 100 l con nuclease free H2O, mescolare bene e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi.
    NOTA: L'immagazzinamento a breve termine a -20 gradi centigradi è possibile dopo il passaggio da 3.1 a 3.1.2.
    1. Aggiungete 2 -L di polimerasi di RNA T7, mescolate bene e incubate per altri 2 h a 37 gradi centigradi.
    2. Per digerire il modello di DNA iniziale, aggiungere 7,5 gradi l di DNase (RNase free, 1 U/L), mescolare bene e incubare a 30 min a 37 .
      NOTA: Pulire tutte le superfici e le pipette con detaminante superficiale per RNase quando si lavora con l'RNA per evitare la degradazione. Inoltre, assicurarsi che tutti i tubi di reazione siano privi di RNase e sterili. Utilizzare solo punte con filtri e diluire esclusivamente con acqua sterile e priva di RNase.
  2. Seguendo il protocollo di fabbricazione per l'estrazione dell'RNA (vedere Tabella dei materiali, Figura 2), preparare una premiscissiccia di tampone di lisi e 100% di etanolo mescolando 330 - L di buffer di lisi e 330 - L del 100% di etanolo per ogni reazione di trascrizione in vitro. Aggiungete 660 l di lisi tampone etanolo a 110 -L di RNA e vortice. Caricare il campione su una colonna di filtro e centrifugare a 8000 x g per 30 s. Eliminare il flusso attraverso e posizionare la colonna del filtro nello stesso tubo.
    1. Aggiungere 600 l of Wash buffer e centrifugare a 8000 x g per 30 s. Scartare il flusso attraverso e riposizionare la colonna del filtro nello stesso tubo. Aggiungere 350 l of Wash buffer e centrifugare a 8000 x g per 2 min per rimuovere il buffer di lavaggio residuo. Posizionare ogni colonna di filtro in un tubo di microcentrifuga pulito da 1,5 mL. Aprire il coperchio della colonna del filtro e lasciare asciugare la colonna per 3 min.
    2. Elute RNA mettendo 50 L di RNase libero H2O al centro della colonna del filtro. Incubare per 1 min a RT e successivamente centrifugare a 8.000 x g per 1 min. Controllare l'integrità dell'RNA caricando 1 L di RNA su un gel di agarose e misurare la concentrazione di RNA estratto utilizzando uno spettrofotometro.
      NOTA: Conservare l'RNA a -80 gradi centigradi fino all'elettroporazione ed scongelare esclusivamente l'RNA sul ghiaccio per evitare la degradazione.

4. Preparazione delle cellule HepG2 per la coltura cellulare derivata produzione HEV (HEVcc)

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Figura 3: Configurazione sperimentale schematica per la preparazione delle cellule HepG2 per la produzione HEV derivata derivata dalla coltura cellulare (HEVcc). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: Per evitare la contaminazione, la preparazione di cellule, l'elettroporazione, l'infezione, la raccolta e la fissazione cellulare sono state effettuate in condizioni sterili in un impianto di livello 2 di biosicurezza. Le fasi di incubazione a 37 gradi centigradi che coinvolgono le cellule sono state eseguite in un'incubatrice di CO2 del 5%.

  1. Per preparare le cellule HepG2 per la produzione HEVcc (Figura 3), le cellule di semi in completo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (vedi Tabella 1) su un collagene di 15 cm (vedi tabella 1, filtro sterile PBS - miscela di acido acetico attraverso 0,2 m mesh prima di aggiungere collagene) rivestito piatto di coltura. Incubare a 37 gradi centigradi fino a quando le cellule sono 90% confluente.
    NOTA: Ogni piatto di 15 cm contenente 90% cellule confluenti genererà abbastanza cellule per un massimo di 4 elettroporrità.
  2. Rimuovere delicatamente il mezzo dalla piastra e lavare le cellule una volta con 10 mL di 1x PBS. Orpsinizzare le cellule aggiungendo 3 mL di 0,05% di trypsin-EDTA sulle cellule e incubare a 37 gradi centigradi fino a quando le cellule sono staccate completamente. Risospendere le celle in 10 mL DMEM mezzo completo e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL. Determinare il numero totale di celle.
  3. Poiché ogni elettroporazione richiede 5 x 106 celle, trasferire il volume appropriato in un nuovo tubo da 50 mL e riempire fino ad almeno 35 mL con 1x PBS. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min e scartare con attenzione il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
  4. Lavare le cellule ancora una volta con 35 mL di 1x PBS a 200 x g per 5 min. Posizionare le cellule sul ghiaccio e non rimuovere ancora 1 x PBS, per mantenere le cellule in sospensione.

5. Elettroporazione delle cellule HepG2

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Figura 4: Configurazione sperimentale schematica per l'elettroporazione delle cellule HepG2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Per l'elettroporazione delle cellule HepG2 (Figura 4) preparare 400 -L di Cytomix completo per elettroporazione integrando 384 L di Cytomix (vedi tabella 1) con 2 mM ATP e 5 mM Glutathione. Preparare fresco subito prima dell'uso e posizionare direttamente sul ghiaccio.
    NOTA: una corretta ma rapida esecuzione dei seguenti passaggi è fondamentale. Pertanto, assicurarsi che tutto sia preparato correttamente.
  2. Rimuovere con cautela 1x PBS senza disturbare il pellet cellulare dal passaggio 4.4. Risospendere 5 x 106 cellule in 400 - L di Cytomix complete e aggiungere 5 g di RNA dal passo 3.2.2. Trasferire la soluzione in una cuvette da 4 mm e un impulso una volta con 975 F, 270 V per 20 ms con un sistema di elettroporazione.
    1. Dopo l'elettroporazione trasferire le cellule il più rapidamente possibile con una pipetta Pasteur in 11 mL DMEM completa per elettroporazione.
      NOTA: Per assicurarsi che l'RNA venga trasinfezione correttamente nelle cellule DiepG2, verrà eseguito un controllo della trasparenza (TC). I tassi di trasflessazione previsti variano tra il 40-60% delle cellule ORF2-positive.
  3. Trasferire 10 mL di cellule elettroporate in un piatto di 10 cm coltivato con collagene. Aggiungere 1,3 x 105 cellule elettrofornate (300 zL) in un pozzo di una piastra di 24 microtiti di collagene che trasporta un coperchio di copertura (successivamente utilizzato come controllo della trasfezione). Distribuire le cellule in modo uniforme e incubare a 37 gradi centigradi.
    1. Dopo 24 h, cambiare il mezzo del piatto di 10 cm e sostituire con 10 mL fresco DMEM completo. Non modificare il mezzo del controllo della trasfezione. Incubare per altri 6 giorni a 37 gradi centigradi.
  4. Arrestare il controllo della trasfezione in 24 pocello 5-7 d dopo l'elettroporazione a seconda della densità cellulare continuando con il protocollo di colorazione dell'immunofluorescenza (passaggio 8). L'efficienza della trasfezione viene calcolata contando il numero di celle positive ORF2 normalizzate al numero totale di celle.

6. Raccolta di HEVcc intra ed extracellulare

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Figura 5: Configurazione sperimentale schematica per la raccolta intra ed extracellulare HEVcc. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Per raccogliere HEVcc extracellulare (Figura 5), filtrare il supernatante, ottenuto dal piatto di 10 cm dopo 6 giorni (passaggio 5.3.1), attraverso una rete di 0,45 m per rimuovere eventuali detriti cellulari. Conservare l'HEVcc extracellulare raccolto a 4 gradi centigradi per l'infezione nello stesso giorno, altrimenti conservare a -80 gradi centigradi.
  2. Per raccogliere HEVcc intracellulare (Figura 5), lavare le cellule con 1x PBS e provare aggiungendo 1,5 mL di 0,05% trypsin-EDTA. Incubare a 37 gradi centigradi fino a quando le cellule non vengono staccate completamente. Aggiungere 10 mL di DMEM completo, piastra di scarico per staccare le cellule e trasferire le sospensioni delle cellule in tubo 50 mL. Lavare le cellule due volte con PBS. Centrifuga a 200 x g per 5 min.
    1. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1,6 mL di DMEM completo per elettroporazione. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di reazione da 2 mL.
      NOTA: Non utilizzare volumi più grandi in quanto ridurrebbe drasticamente i carichi virali.
    2. Congelare (in azoto liquido) e scongelare le cellule. Ripetere questa sequenza 3 volte.
      NOTA: Non raggruppare più di un elettroporazione (1,6 mL) per i 3 cicli di congelamento e disgelo in quanto l'efficienza della lisi sarebbe compromessa. Non vorticare la sospensione cellulare tra i cicli. Assicurati di scongelare lentamente le sospensioni delle cellule (ad esempio, temperatura ambiente o sul ghiaccio) per massimizzare i carichi virali.
    3. Centrifugare ad alta velocità le cellule lismicate per 10 min a 10.000 x g per separare i detriti cellulari. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Prendiamo il super-natante per l'infezione, altrimenti conservare a -80 gradi centigradi.
    4. Facoltativamente, concentrare l'HEVcc extra e intracellulare utilizzando un concentratore per aumentare i carichi virali (secondo il protocollo del produttore).

7. Infezione delle cellule EpG2/C3A con HEVcc intra ed extracellulare

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Figura 6: Configurazione sperimentale schematica per l'infezione delle cellule EpG2/C3A con HEVcc intra ed extracellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: L'infezione delle cellule EpG2/C3A deve garantire la produzione di particelle infettive. Inoltre, la titolazione del RACCOLTO HEVcc intracellulare ed extracellulare viene utilizzato per calcolare i titer del virus in FFU/mL. Questo sarà poi indicato come controllo delle infezioni (IC).

  1. Per preparare le cellule HepG2/C3A per l'infezione HEVcc (Figura 6), prewarm Minimal Essential Medium (MEM) completa (vedere la tabella 1) a 37 gradi centigradi.
    1. Seme 2 x 104 cellule /bene in 100 gradi L sul collagene rivestito 96 piastra di microtitolto ben un giorno prima del passo 6. Assicurarsi di riempire i pozzi più esterni con 1x PBS per evitare l'evaporazione del mezzo all'interno dei 60 pozzi interni. Incubare a 37 gradi centigradi per 24 ore.
    2. Infettare con HEVcc extracellulare aggiungendo 50 -L del supernatante (dal passo 6.1) alle cellule HepG2/C3A seminate il giorno prima. Mescolare bene convogliando su e giù e diluire in serie sei volte 1:3 trasferendo 50 l nel pozzo successivo. Eseguire duplicati di diluizione seriale per repliche tecniche.
    3. Infettare con HEVcc intracellulare aggiungendo 25 supernatali (dal passo 6.2.3) alle cellule HepG2/C3A seminate il giorno prima. Mescolare bene convogliando su e giù e diluire in serie sei volte 1:5 trasferendo 25 -L nel pozzo successivo. Eseguire duplicati diluizione seriale per la replica tecnica.
    4. Dopo 7 d interrompere l'infezione continuando con il protocollo di colorazione dell'immunofluorescenza (passaggio 8).

8. Colorazione dell'immunofluorescenza del controllo della trasfezione e delle infezioni

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Figura 7: Configurazione sperimentale schematica per l'colorazione dell'immunofluorescenza della trasfezione e del controllo delle infezioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Per l'colorazione immunofluorescenza (Figura 7), lavare 3x con 1x PBS e fissare le cellule erogando 350 (controllo della trasfezione [TC]) o 50 (controllo delle infezioni [IC]) del 4% soluzione di fissaggio per pozzo. Incubare per 15 min a RT e lavare con cura due volte con 1x PBS in seguito.
    NOTA: Il protocollo può essere sospeso qui per il controllo della trasfezione fino a quando l'infezione delle cellule HepG2/C3A non viene fermata pure. Conservare bene la piastra a 4 gradi centigradi. Sigilla anche il parafilm per prevenire l'evaporazione.
  2. Permeabilize le cellule aggiungendo 350 l (TC) o 50 L (IC) di 0,2% Triton X-100 (in 1o PBS) per 5 min a RT. Quindi lavare con cura due volte con 1x PBS e bloccare con 350 (TC) o 50 (IC) di 5% siero di cavallo (in 1x PBS) per 1 h a RT sotto agitazione costante su uno shaker orbitale (30 rpm).
    NOTA: Preparare un piccolo piatto di plastica (30 mm) posizionando un tessuto umido all'interno e uno strato di pellicola di paraffina sulla parte superiore, creando una camera umida. Quindi trasferire lo slittamento di copertura TC rivolto verso il film di paraffina. I seguenti passaggi per il TC verranno eseguiti nella camera umida.
  3. Aggiungete 70 -L (TC) o 25 L (IC) dell'anticorpo primario anti-ORF2 8282 (siero iperimmune del coniglio specifico per HEV,1:5.000 nel 5% di siero di cavallo) per pozzo e incubare la notte a 4 gradi sotto costante agitazione su uno shaker orbitale (30 rpm).
    1. Lavare con cura due volte con 1x PBS e aggiungere 70 l (TC) o 25 L (IC) di anticorpo secondario capra anti-coniglio 488 (1:1,000 nel 5 % siero di cavallo). Incubare per 1 h sotto agitazione costante su uno shaker orbitale (30 rpm) al buio. Ancora una volta, lavare con cura due volte con 1x PBS
  4. Aggiungere 70 L (TC) o 25 L (IC) di DAPI (1:10,000 in H2O) e2incubare per 1 min. Togliere lo slittamento del coperchio dalla camera umida, montare lo slittamento del coperchio con 6 ll del reagente di montaggio a testa in giù su un vetrino di copertura (solo per TC) e lasciare asciugare il reagente di montaggio per 16 h a RT al buio. Conservare IC in acqua fino a quando non si fa la risonanza e sigillare la piastra con pellicola di paraffina per evitare l'essiccazione dovuta all'evaporazione.
  5. Scatta immagini per confermare la trasfezione e l'infezione di successo.
    NOTA: Risultati comparabili sono stati ottenuti utilizzando l'anticorpo anti-ORF2 1E6 disponibile in commercio57 (1:200 nel 5 % siero di cavallo) e un anticorpo secondario antichiave anti-topo (1:1,000 nel 5 % siero di cavallo)

9. Determinazione della FFU

NOTA: Una FFU è definita come una o più celle ORF2-positive separate da un'altra FFU da almeno tre celle negative.

  1. Per EXTRAcellular HEVcc iniziare a contare tutti i foci ORF2-positivi dei due pozzi nei due diluizioni più basse. Un totale di quattro pozzi dovrebbe essere contato. Le unità di formatura di messa a fuoco (FFU) per millililitri possono essere calcolate con la seguente equazione:

    figure-protocol-8
    NOTA: I comiter previsti variano tra 102 e 5 x 104 FFU/mL.
  2. Per HEVcc intracellulare iniziare a contare tutti i foci ORF2 positivi in pozzi dove si osservano tra 50 A 100 foci. Inoltre, contare i due pozzi nella successiva diluizione superiore. Un totale di quattro pozzi dovrebbe essere contato. Le unità di formatura di messa a fuoco (FFU) per millililitri possono essere calcolate con la seguente equazione:

    figure-protocol-9
    NOTA: Le titole attese variano tra 105 e 3 x 106 FFU/mL. I fattori 20x e 40x sono utilizzati per estrapolare il numero di FFU per 50 e 25 l l a 1 mL e possono essere adattati di conseguenza.

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Risultati

In questo protocollo, descriviamo la produzione di alto titro infettivo HEVcc. Il primo passaggio consiste nell'isolare il DNA plasmide (pBluescript_SK_HEVp654 e pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figura 8a), che viene quindi linearizzato dalla digestione delle restrizioni e purificato per latrascrizionein vitro ( Figura 1 ). Una linearizzazione di successo può essere verificata confrontando il plasmide-DNA non digerit...

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Discussione

A partire dalla preparazione del plasmide, i rendimenti del DNA dovrebbero superare i 150 ng/L per poter eseguire la linearizzazione multipla dallo stesso stock di plasmide, il che riduce al minimo il rischio di mutagenesi indotta da batteri di sequenze di genoma cruciali. Inoltre, è importante controllare il digest di restrizione per la linearizzazione plasmidcompleta completa da elettroforesi gel (Figura 8b). Una mancanza di DNA plasmide linearizzato indurrebbe l'amplificazione del cerchio...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati a Suzanne Emerson per il clone del virus dell'epatite E p6. Il siero iperimmune per conigli operistici per il coniglio È stato gentilmente fornito da Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germania. Inoltre, ringraziamo tutti i membri del Dipartimento di Virologia Molecolare e Medicina della Ruhr University Bochum per il loro sostegno e discussione. Le cifre 1-7 sono state generate con BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,45 & micro; m meshSarstedt83.1826Raccogliere virus extracellulare
4 % HistofixCarlRothP087.4Immunofluorescenza
Acido aceticoCarlRoth6755.1Soluzione di lavoro del collagene
Amicon Ultra-15Merck MilliporeUFC910024Raccolta del virus
AmpicillinaSigma-AldrichA1593Selezione di trasformato batteri
ATPRoche11140965001in vitro trascrizione ed elettroporazione BioRender
BioRenderGenerazione di figure
CaCl2Roth5239.2Cytomix
Collagen R soluzione 0,4 % sterileServa47256.01Soluzione di lavoro del collagene
CTPRoche11140922001in vitro trascrizione
CuvettaBiorad165-2088Elettroporazione
DAPIInvitrogenD21490Immunofluorescenza
DMEMgibco41965-039Coltura cellulare
DNAsePromegaM6101in vitro trascrizione
DTTPromegaP2077in vitro
EGTARoth3054.3Cytomix
Escherichia coli JM109PromegaL2005Trasformazione
Gibcodi siero fetale bovino10270106Coltura cellulare
FluoromountSouthernBiotech0100-01Immunofluorescenza
Sistema di elettroporazione GenePulser XcellBioRad1652660Elettroporazione
Gentamycingibco15710049Coltura cellulare
GTPRoche11140957001in vitro trascrizione
H2OBraun184238001Immunofluorescenza
HepesInvitrogen15630-03Cytomix
Cavallo sierogibco16050122Immunofluorescenza
K2HPO4RothP749.1Cytomix
KCLRoth6781.3Cytomix
KH2PO4Roth3904.2Cytomix
L-Glutamingibco25030081Coltura cellulare
L-Glutatione ridottoSigma-AldrichG4251-5GCytomix
MEMgibco31095-029Coltura cellulare
MEM NEAA (100&volte;)gibco11140-035Coltura cellulare
MgCl2Roth2189.2
Spettrofotometro UV-Vis a microvolume Cytomix NanoDrop OneThermo FisherND-ONE-WConcentrazione di DNA/RNA
MluI enzimaNEBR0198LLinearizzazione
NEB tamponeNEBincluso in R0198LLinearizzazione
Kit di plasmidi NucleoSpinMacherey & Nagel740588.250Preparazione plasmidica
Kit di pulizia dell'RNA nucleoSpinMacherey & Nagel740948.250Purificazione dell'RNA
PBSgibco70011051Coltura cellulare
Pen/StrepThermo Fisher15140122Coltura cellulare
Plasmide che codifica il genoma HEV a lunghezza intera (p6_G1634R)Todt et.alProduzione di virus
Plasmide che codifica il genoma HEV a lunghezza intera (p6_WT)Shukla et al.Iscrizione GenBank n. JQ679013Produzione di virus
Anticorpo primario 1E6LS-BioC67675Immunofluorescenza
Anticorpo primario 8282Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germania
Kit QIAprep Spin MiniprepQiagen27106Estrazione del DNA
Ribo m7G Cap AnalogPromegaP1711in vitro
RNasi viaCarlRothA998.3Purificazione dell'RNasina
(inibitore della RNasi)PromegaN2515in vitro trascrizione
Anticorpo secondario asino anti-topo 488Thermo FisherA-21202Immunofluorescenza
Anticorpo secondario capra anti-coniglio 488Thermo FisherA-11008Immunofluorescenza
Sodio Pyruvatgibco11360070Coltura cellulare
T7 RNA polimerasiPromegaP2077in vitro trascrizione Tampone
trascrizionePromegaincluso in trascrizione P2077in vitro
Triton X-100CarlRoth3051.3Immunofluorescenza
Tripsina-EDTA (0,5 %)gibco15400054Coltura cellulare
IgG ultra-bassegibco1921005PJColtura cellulare
UTPRoche11140949001in vitro trascrizione
incluso nella trascrizione di

Riferimenti

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