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Articolo metodologico

Creazione di coppie di modelli in vivo/in vitro derivati dal paziente abbinate di organoidi derivati da PDX e PDX per la ricerca farmacologica sul cancro

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DOI:

10.3791/61382

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5 maggio 2021

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1Crown Bioscience Inc., Changping District, Beijing, China, 2Crown Bioscience Inc., Taicang, Jiangsu, China, 3Crown Bioscience Inc., San Diego, CA, USA

In questo articolo

Sommario

Viene descritto un metodo per creare organoidi utilizzando xenoinnesti derivati dal paziente (PDX) per lo screening in vitro, con conseguente coppie abbinate di modelli in vivo/in vitro. I tumori PDX sono stati raccolti/trasformati in piccoli pezzi meccanicamente o enzimaticamente, seguiti dal metodo clevers per far crescere organoidi tumorali che sono stati passaggi, crioconservati e caratterizzati contro il PDX originale.

Abstract

Gli xenografti tumorali derivati dal paziente (PDX) sono considerati i modelli preclinici più predittivi, in gran parte ritenuti guidati da cellule staminali tumorali (CSC) per la valutazione convenzionale dei farmaci antitumorali. Una vasta libreria di PDX riflette la diversità delle popolazioni di pazienti e consente quindi studi preclinici basati sulla popolazione ("Studi clinici sul topo simili alla fase II"); tuttavia, pdx ha limitazioni pratiche di bassa produttività, costi elevati e lunga durata. Gli organoidi tumorali, essendo anche modelli guidati dal CSC derivati dal paziente, possono essere considerati come l'equivalente in vitro del PDX, superando alcune limitazioni PDX per trattare grandi librerie di organoidi o composti. Questo studio descrive un metodo per creare organoidi derivati dalla PDX (PDXO), risultando così in modelli accoppiati per la ricerca farmacologica in vitro e in vivo. I tumori PDX-CR2110 trapiantati per via sottocutanea sono stati raccolti da topi portanti di tumore quando i tumori hanno raggiunto i 200-800 mm3, secondo una procedura di autopsia approvata, seguita dalla rimozione dei tessuti non tumorali adiacenti e dissociazione in piccoli frammenti tumorali. I piccoli frammenti tumorali sono stati lavati e passati attraverso un colino cellulare di 100 μm per rimuovere i detriti. I grappoli cellulari sono stati raccolti e sospesi in soluzione di estratto di membrana basale (BME) e placcati in una piastra da 6 po 'come una goccia solida con mezzi liquidi circostanti per la crescita in un incubatore di CO2. La crescita organoide è stata monitorata due volte alla settimana sotto microscopia ottica e registrata dalla fotografia, seguita da una variazione media liquida 2 o 3 volte a settimana. Gli organoidi coltivati furono ulteriormente passaggi (7 giorni dopo) con un rapporto di 1:2 interrompendo gli organoidi incorporati BME usando la cesoia meccanica, aiutati dall'aggiunta di tripina e dall'aggiunta di 10 μM Y-27632. Gli organoidi sono stati crioconservati in crio-tubi per la conservazione a lungo termine, dopo il rilascio dal BME per centrifugazione, e anche campionati (ad esempio, DNA, RNA e blocco FFPE) per un'ulteriore caratterizzazione.

Introduzione

I tumori sono una raccolta di diversi disturbi genetici e immunologici. Lo sviluppo riuscito di trattamenti efficaci dipende fortemente da modelli sperimentali che prevedono efficacemente i risultati clinici. Grandi librerie di xenoinnesti ben caratterizzati di origine paziente (PDX) sono state a lungo viste come il sistema trascizionale in vivo di scelta per testare terapie chemio- e / o mirate grazie alla loro capacità di ricapitolare le caratteristiche tumorali del paziente, l'eterogeneità e la risposta del farmaco delpaziente 1, consentendo così agli studi clinici sul topo di fase II di migliorare ilsuccesso clinico 2,3. I PDX sono generalmente considerati malattie delle cellule staminali tumorali, con stabilità genetica, in contrasto con gli xenoinnesti derivati dalla lineacellulare 2. Negli ultimi decenni, grandi collezioni di PDX sono state create in tutto il mondo, diventando oggi il cavallo di battaglia dello sviluppo di farmaci antitumorali. Sebbene ampiamente utilizzati e con un grande valore trasdizionale, questi modelli animali sono intrinsecamente costosi, dispendiosi in termini di tempo e bassa produttività, quindi inadeguati per lo screening su larga scala. La PDX è anche indesiderabile per i test di immuno-oncologia (IO) a causa di una natura immuno-compromessa4. Non è quindi pratico sfruttare appieno la grande libreria disponibile di PDX.

Recenti scoperte, pioniere del laboratorio5di Hans Clevers, hanno portato alla creazione di colture in vitro di organoidi generati da cellule staminali adulte nella maggior parte degli organi umani di origine epiteliale5. Questi protocolli sono stati ulteriormente perfezionati per consentire la crescita di organoidi da cSC presunti in carcinomi umani di varieindicazioni 6,7. Questi organoidi derivati dal paziente (DOP) sono genomicamente stabili8,9 e hanno dimostrato di essere altamente predittivi degli esiti del trattamentoclinico 10,11,12. Inoltre, la natura in vitro delle DOP consente lo screening ad alta produttività (HTS)13, offrendo così potenzialmente un vantaggio rispetto ai modelli in vivo e sfruttando grandi librerie organoidi come surrogato della popolazione del paziente. Le DOP sono pronta a diventare un'importante piattaforma di scoperta e traduzione, superando le numerose limitazioni dei PDX sopra descritte.

Sia la DOP che la PDX sono modelli derivati dal paziente e guidati dal CSC, con la capacità di valutare le terapie nel contesto di un trattamento personalizzato o di un formato di sperimentazione clinica. Le grandi librerie esistenti di PDX, come la collezione proprietaria di >3000 PDX14,15,16,17, sono quindi adatte per la rapida generazione di librerie di organoidi tumorali (organoidi derivati da PDX, o PDXO), dando vita a una libreria abbinata di modelli PDX e PDXO accoppiati. In questo report viene descritta la procedura per creare e caratterizzare il cancro colorettale PDXO-CR2110 in relazione al suo PDX-CR2110 parentalemodello 16.

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Protocollo

Tutti i protocolli e le modifiche o le procedure che prevedono la cura e l'uso degli animali sono stati rivisti e approvati dal Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) prima di condurre gli studi. La cura e l'uso degli animali è stato condotto in conformità con le linee guida internazionali AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) come riportato nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, Consiglio Nazionale delle Ricerche (2011). Tutte le procedure sperimentali per animali erano in condizioni sterili presso strutture SPF (specifiche esenti da agenti patogeni) e condotte in stretta conformità con la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio di diverse istituzioni governative (ad esempio, Gli Istituti Nazionali di Salute). I protocolli sono stati approvati dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali presso l'istituzione della struttura (ad esempio, comitato istituzionale IACUC).

1. Preparazione per il trapianto di tumore

  1. Alloggiamento per animali
    1. Topi nudi House Balb/c (n=5) in gabbie ventilate individuali, a 20-26 °C, umidità del 30-70% e un ciclo di illuminazione di 12 ore di luce/12 ore scure, con lettiera a pannocchie di mais cambiata settimanalmente e cibo sterilizzato in granulo secco e ad libitum di acqua potabile sterile.
  2. Preparazione dei frammenti tumorali del donatore
    1. Monitorare da vicino i topi donatori contenenti tumore per il peso corporeo (BW, tramite bilancia di pesata) e il volume tumorale (TV, mediante misurazione della pinza).
    2. Quando la TV raggiunge gli 800-1000 mm3, eutanasia gli animali portatumorali in un cappuccio a rischio biologico.
      1. Mettere i topi in una camera di eutanasia con un coperchio che fornisce gasCO 2 nella camera. Scarica gas nella camera ad una portata che produce una rapida incoscienza con un minimo disagio per l'animale. La portata ottimale per la CO2 è di circa 2-2,5 Lpm.
      2. Garantire l'eutanasia osservando che gli animali non riprendono conoscenza.
      3. Dopo l'apparente morte clinica, mantenere il flusso di gas >1 min per ridurre al minimo la possibilità che un animale possa riprendersi.
    3. Sterilizzare la pelle intorno al tumore usando tamponi iodoforici. Raccogliere i tumori rimuovendo i tessuti non tumorali adiacenti e posizionandoli in una piastra di Petri contenente 20 mL di PBS, pre-refrigerata (4 °C) prima dell'eutanasia.
    4. Lavare i tumori con PBS in un'altra piastra di Petri per rimuovere i componenti del sangue seguita dal taglio a metà e dalla rimozione di qualsiasi pelle, vasi sanguigni, calcificazione e / o necrosi extra.
    5. Posizionare solo pezzi di tumore intatti in un tubo di centrifuga sterile da 50 ml con 20 ml di PBS, prima di trasportarlo in una stanza separata per il trapianto.

2. Crescita del tumore sottocutaneo

  1. Inoculazione sottocutanea del pezzo tumorale in topi immunocomprominati
    1. Tagliare il tumore PDX in pezzi da 2 mm con un bisturi e posizionare ciascuno in trocar per l'impianto sottocutaneo (SC).
    2. Anestetizzare gli animali riceventi con il 5% di isoflurane (mantenuto da un cono nasale all'1%). Gli animali si rilassano, perdendo il loro riflesso di destra e alla fine diventando immobili, fino a quando non rispondono al dolore. Fissare i topi anestetizzati su una scheda di esperimento nella giusta posizione laterale e sterilizzare con tamponi iodoforici, in particolare le aree che circondano il sito di inoculazione tumorale.
    3. Sulla pelle del fianco sinistro appena cranica all'anca, fare un'incisione di 0,5 cm con un bisturi e creare un tunnel sotto la pelle verso l'articello, 2-3 cm, usando forcette smussate.
    4. Trasferire aseticamente un cubo di frammento tumorale per sito di inoculazione dal mezzo e posizionarlo in profondità all'interno del tunnel sottocutaneo. Confermare visivamente la posizione del frammento prima della chiusura della ferita con clip della ferita.
    5. Monitorare i topi impiantati dal tumore (5) fino a quando non diventano coscienti per mantenere la reclinata sternale, e quindi riportarli nella loro gabbia solo dopo il loro pieno recupero dall'anestesia.
  2. Monitoraggio dello stato dei topi portanti di tumore
    1. Controllare il consumo di acqua e cibo ogni giorno e registrare il peso corporeo settimanalmente.
    2. Controllare i topi durante il monitoraggio di routine. Registra eventuali effetti sulla mobilità, la respirazione, la toelettatura e l'aspetto generale, il consumo di cibo e acqua, il guadagno / perdita di BW, gli asciti, ecc.
    3. Misurare la TV due volte alla settimana usando pinze ed esprimere in mm3 per: TV = 0,5 a × b2, dove a e b sono rispettivamente la lunghezza e la larghezza del tumore.
    4. Sacrificare gli animali per raccogliere campioni quando compaiono uno dei seguenti segni: perdita di BW >20%; mobilità ridotta (non in grado di mangiare o bere); incapace di muoversi normalmente a causa di ascite significative o addome ingrossato; sforzo nella respirazione; morte.

3. Necropsia e raccolta tumorale

  1. Quando il volume tumorale ha raggiunto i 200-800 mm3, eutanasiare i topi per protocolli approvati (vedere fase 1.2.2).
  2. Raccogliere i tessuti tumorali rimuovendo i tessuti non tumorali adiacenti, seguiti posizionando il tessuto in un tubo di plastica da 50 ml con AD+++ (sul ghiaccio) prima della dissociazione.

4. Preparazione per la coltura organoide derivata da PDX

NOTA: Tutti i seguenti passaggi sono stati eseguiti all'interno di un armadio di biosicurezza per linee guida standard per la coltura tissutale. Conservare le scorte preri warmed di piastre da 96, 24 e 6 po', in un incubatore a 37 °C prima dell'uso.

  1. Preparazioni per reagenti
    1. Preparare la soluzione di estratto di membrana basale (BME) (fattore di crescita ridotto, senza fenolo rosso). Conservare 10 mL di BME in frigorifero a 4 °C durante la notte. Una volta scongelato, ruotare la bottiglia BME per garantire la dispersione.
    2. Preparare il supporto di base/buffer di lavaggio AD+++. Aggiungere 5 mL di 200 mM L-glutammina, 1 M HEPES e Pen/Strep ai supporti DMEM/F12 avanzati con pipetta con pipetta da 5 mL.
    3. Preparare il mezzo organoide del colon come descritto da Sato et al.18 attraverso l'integrazione di supporti di base con N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Nicotinammide (10 mM), SD202190 (10 nM), R-spondidina (500 ng/mL), L-glutammina (2 mM), HEPES (10 μM), penicillina-streptomicina (1x) e Y-27623 (10 μM)19.
    4. Preparare il mezzo di digestione AD+++: 10 mL di 1x mezzi di coltura organoide con 500 μL di collagenasi di tipo II (20 mg/mL) e 10 μL di RhoKI Y-27632 (10 mM).
  2. Dissociazionetumorale 20
    1. Trasferire il tumore in un tubo di plastica da 50 ml in una piastra di Petri di 10 cm. Scatta una fotografia macroscopica insieme a un righello e registra una descrizione delle sue condizioni (ad esempio, dimensioni, tessuti adiposi, vascolarizzazione, necrosi, ecc.).
    2. Rimuovere l'AD+++ in eccesso per aspirazione e tagliare il tessuto tumorale a piccoli pezzi con forbici seguite da un trasferimento di 1-2 pezzi in un microtubo da 2 mL per il congelamento a scatto sul ghiaccio secco. Conservare a -80 °C per la profilazione genomica. Tritare i pezzi rimanenti in pezzi più fini con le forbici prima del trasferimento in un tubo di plastica da 50 ml utilizzando AD+++.
    3. Lavare il tessuto tritato 2-3 volte di 35 mL di AD+++, seguito dall'aggiunta di 10 mL di mezzo di digestione (vedi fase 4.1.4) e posizionamento su uno shaker orbitale a 4 x g per 1 h a 37 °C.
    4. Omogeneizzare il tessuto digerito tubazione su e giù utilizzando una pipetta di plastica sterile da 5 mL, seguita dall'aggiunta di 20 mL di AD+++ e dalla filtrazione di 100 μm di filtro cellulare.
    5. Lavare il pass-through due volte con AD+++ (girare a 450 x g per 5 min), seguito da resuspensione in BME (aggiungere 4x volume di BME al pellet per la sospensione) e tenere sul ghiaccio19.
  3. Preparazione della cultura organoide
    1. Aggiungere la sospensione cellulare BME in una piastra a 6 po po' in gocce multiple per un totale di 200 μL per pozzo.
    2. Trasferire la piastra in un incubatore a 37 °C. Dopo 30 minuti, le gocce di gel si solidificano.
    3. Aggiungere 2 mL di mezzi organoidi ad ogni pozzo, con le gocce rappresentative registrate dalla fotografia microscopica prima di trasferirsi in un incubatore (37 °C e 5% DI CO2).
    4. Mantenere le colture organoidi con cambiamento medio ogni 3-4 giorni e passare con un rapporto 1:2 ogni 7 giorni o a seconda della loro crescita e densità.

5. Istopatologia e analisi del sequenziamento di nuova generazione (NGS)

  1. istopatologia
    1. Raccogliere gli organoidi dal pozzo con il mezzo esistente utilizzando una pipetta P1000, seguita da centrifugazione (spin a 450 x g per 5 min), lavaggio con PBS e fissazione in formalina al 10% per 1 h.
    2. Posizionare gli organoidi fissi in gelatina al 100% sul fondo del tubo conico da 50 ml, seguito da lavorazione e incorporamento dei tessuti di routine.
    3. Eseguire colorazione ematossilina-eosina (H&E) utilizzando protocolli standard su sezioni di paraffina da 4 mm.
  2. RNAseq e sequenziamento dell'esoma intero
    1. Raccogliere gli organoidi dal pozzo con il mezzo di coltura esistente utilizzando una pipetta P1000, seguita da centrifugazione utilizzando un microcentrifugo alla velocità massima (12.000 x g)per 5 min a 4 °C.
    2. Raccogliere il pellet rimuovendo il supernatante medio per assicurarsi che non fosse presente alcun BME visibile, seguito dal congelamento a scatto in un microtubo (ghiaccio secco) e quindi trasferito in un congelatore a -80 °C.
    3. Estrarre RNA o DNA utilizzando la procedura standard dai produttori ed eseguire analisi NGS sia per RNAseq che per il sequenziamento dell'esoma intero (WES).

6. Saggio IC50 20

  1. Semina organoide in piastra da 384 pozzi per test IC50
    1. Dissociare gli organoidi in gocce di BME da ogni pozzo (digerendo BME) aggiungendo 20 μL di soluzione di dispasi 100x ad ogni pozzo (piastra a 6 pozzetti), che conteneva 2 mL di mezzo organoide, seguito da 10 minuti di incubazione a 37 °C.
    2. Gli organoidi digeriti pipetta da tutti i pozzi attraverso un filtro da 70 μm in un tubo di plastica da 50 ml per raccogliere gli organoidi.
    3. Contare gli organoidi in microscopia per la determinazione della concentrazione organoide. Sospendere gli organoidi utilizzando il mezzo di coltura, prima di aggiungere BME per raggiungere la concentrazione finale del 5% (v/v) sul ghiaccio.
    4. Aggiungere 50 μL della sospensione organoide in ogni piastra da 384 poggiali con il distributore di liquidi, secondo la mappa della piastra con una densità di semina di 200 PDXO CR2110 per pozzo nel corrispondente mezzo di coltura organoide.
  2. Trattamento cisplatino e irinotecano
    1. Utilizzare cisplatino (con la massima concentrazione di 100 μM) e "irinotecan" (con la concentrazione più alta di 10 μM). Aggiungere SN-38 (un metabolita di irinotecan, al contrario dell'irinotecan che viene solitamente utilizzato per studi in vivo) a ciascun pozzo secondo lo schema di diluizione del farmaco per 9 dosi, in diluizione seriale da dispener digitale.
    2. Creare la platemap utilizzando lo strumento software del distributore digitale. Includere un veicolo di controllo negativo con vitalità al 100% e controllo postivo di 5 μM di starurosporina, che ha mostrato una vitalità dello 0%.
    3. Riposizionare le piastre a 384°C trattate con farmaci in un'incubatrice a 37 °C.
  3. Determinazione della vitalità delle cellule organoidi dopo il trattamento farmacologico
    1. Al termine dei 5 giorni di trattamento farmacologico, determinare la vitalità delle cellule organoidi utilizzando reagenti di vitalità cellulare luminescenti secondo la procedura raccomandata dal produttore. Aggiungere il reagente luminescente in ogni pozzo con il dispener liquido e mescolare per 5 minuti su uno shaker di piastra, seguito da un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
    2. Registrare il segnale luminescente su un lettore di piastre multi-pozzo a luminescenza.
    3. Calcola le viabilità normalizzate di ogni pozzo utilizzando le letture grezze del lettore di piastre e crea una curva dose-risposta e valori IC50 con raccordi curvi non lineari.

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Risultati

Morfologia dei PDXO, tipica degli organoidi sotto microscopia leggera, e coerente con la colorazione PDX parentale per H&E
In microscopia ottica, PDXO-CR2110 dimostra la tipica morfologia cistica (Figura 1A), come descritto in precedenza per gli organoidi derivati dal paziente (DOP), prove a sostegno della somiglianza tra PDXO e DOP nelle stesse condizioni di coltura.

L'esame istopatologico da parte della colorazione H&E rivela che le s...

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Discussione

I dati preliminari per PDX-/PDXO-CR2110 in questo rapporto supportano l'equivalenza biologica tra PDX e il suo derivato, PDXO, per quanto riguarda la genomica, l'istopatologia e la farmacologia, poiché entrambi i modelli rappresentano le forme di malattia derivate dal CSC originale del paziente. Entrambi i modelli sono modelli di malattia derivati dal paziente, potenzialmente predittivi della risposta clinicadei pazienti 10,11,12,

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Dichiarazioni

Tutti gli autori sono gli attuali dipendenti a tempo pieno di Crown Bioscience, Inc.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano la Dott.ssa Jody Barbeau, Federica Parisi e Rajendra Kumari per la lettura critica e la modifica del manoscritto. Gli autori ringraziano anche il crown bioscience oncology in vitro e il team in vivo per i loro grandi sforzi tecnici.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Avanzato DMEM/F12Life Technologies12634028Terreno di base
DMEMHycloneSH30243.01Terreno di lavaggio
Collagenese di tipo IIInvitrogen17101015Digerire il tumore
MatrigelCorning356231Matrice di coltura di organoidi (estratto di membrana basale, fattore di crescita ridotto)
N-AcSigmaA9165Terreno di coltura per organoidi
A83-01Tocris2939Terreno di coltura per organoidi
B27Life Technologies17504044Terreno di coltura per organoidi
EGF PeprotechAF-100-15Terreno di coltura per organoidi
NogginPeprotech120-10CTerreno di coltura per organoidi
NicotinamideSigmaN0636Terreno di coltura di organoidi
SB202190SigmaS7076Terreno di coltura per organoidi
GastrinSigmaG9145Terreno di coltura per organoidi
RspondinPeprotech120-38-1000Terreno di coltura per organoidi
L-glutamminaLife Technologies35050038Terreno di coltura per organoidi
HepesLife Technologies15630056Terreno di coltura per organoidi
penicillina-streptomicinaLife Technologies15140122Terreno di coltura per organoidi
Y-27632AbmoleM1817Terreno per coltura di organoidi
DispaseLife Technologies17105041Test di screening
CellTiter-Glo 3DPromegaG9683Test di screening (indicatore ATP luminescente)
Dispenser multidropThermo FisherMultidrop combiOrganoidi di placcatura/CellTiter-Glo Aggiunta 3D
Dispensatore digitaleTecanD300eAggiunta di composti
Envision Lettore di piastrePerkin Elmer2104Lettura della luminescenza
Balb/c topi nudiBeijing HFK Bio-Technology Co
RNAeasy Mini kitQiagen74104kit di purificazione
del tRNADNAeasy Sangue & Kit di tessutiQiagen69506Kit di purificazione del DNA
HistogelThermo FisherHG-4000-012Inclusione di organoidi

Riferimenti

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