Articolo metodologico

Valutazione PCR in tempo reale quantitativa delle espressioni di microRNA nel rene del topo con ostruzione ureterale unilaterale

DOI:

10.3791/61383

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27 agosto 2020

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1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un metodo per valutare l'espressione del microRNA nei reni dei topi con ostruzione ureterale unilaterale (UUO) mediante reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa quantitativa. Questo protocollo è adatto per studiare i profili di espressione del microRNA renale nei topi con UUO e nel contesto di altre condizioni patologiche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I microRNA (miRNA) sono singole molecole di RNA non codificanti che in genere regolano l'espressione genica a livello post-trascrizionale legandole a siti bersaglio parzialmente complementari nella regione non tradotta (UTR) dell'RNA messaggero (mRNA), che riduce la traduzione e la stabilità dell'mRNA. I profili di espressione miRNA in vari organi e tessuti dei topi sono stati studiati, ma i metodi standard per la purificazione e la quantificazione del miRNA nel rene del topo non sono stati disponibili. Abbiamo stabilito un metodo efficace e affidabile per estrarre e valutare l'espressione del miRNA nel rene del topo con fibrosi interstiziale renale mediante reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR). Il protocollo richiedeva cinque fasi: (1) creazione di topi finti e unilaterali di ostruzione ureterale (UUO); (2) estrazione di campioni renali dai topi UUO; (3) estrazione dell'RNA totale, che include il miRNA, dai campioni di rene; (4) sintesi del DNA complementare (cDNA) con trascrizione inversa dal miRNA; e (5) qRT-PCR utilizzando il cDNA. Utilizzando questo protocollo, abbiamo confermato con successo che rispetto ai controlli, l'espressione di miRNA-3070-3p è stata significativamente aumentata e quelli di miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p sono stati significativamente diminuiti nei reni di un modello murino di fibrosi interstiziale renale. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare l'espressione di miRNA nei reni dei topi con UUO.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I microRNA (miRNA) - gli RNA corti e non codificanti che causano la degradazione e l'inibizione trascrizionale dell'RNA messaggero (mRNA)1 - hanno dimostrato di regolare l'espressione di vari mRNA che hanno ruoli cruciali sia nella fisiologia che nella malattia (ad esempio, infiammazione, fibrosi, disturbi metabolici e cancro). Alcuni dei miRNA possono quindi essere candidati nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici per una varietà di malattie2,3,4,5. Anche se i profili di espressione del miRNA negli organi murini e nei tessuti, tra cui cervello, cuore, polmone, fegato e rene sono statidescritti 6,7,8,9,10, non ci sono stati metodi standard per l'estrazione e la valutazione dei miRNA nel rene del topo con fibrosi interstiziale renale.

Abbiamo progettato un protocollo per purificare e rilevare in modo affidabile le espressioni dei miRNA nei reni dei topi con fibrosi interstiziale renale. Il protocollo prevede cinque passaggi principali, come indicato di seguito. (1) I topi maschi C57BL/6 di 8 settimane sono divisi in gruppi di topi che subiscono un'operazione fittizia (controlli) e topi sottoposti a un intervento chirurgico che fornisce ostruzione ureterale unilaterale (UUO), che è collegata alla fibrosi interstiziale renale. (2) I campioni di rene vengono estratti dai topi finti e UUO, omogeneizzati separatamente in un omogeneizzatore di silicio, e poi trasferiti in un sistema di triturazione del biopolimero su una colonna di spin microcentrifuge11,12. (3) L'RNA totale contenente miRNA viene estratto dai campioni renali da una colonna di spin a base di membrana di silice12,13. (4) Utilizzando questo RNA totale estratto, il DNA complementare (cDNA) viene sintetizzato dall'RNA totale con l'uso di trascrizione inversa, polimerasi poli(A) e oligo-dT primer14,15. (5) Le espressioni dei miRNA sono valutate mediante reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) utilizzando un colorante intercalante14,15.

Questo protocollo si basa su indagini che hanno ottenuto estrazioni significative e valutazioni di miRNA in una varietà di tessuti11,12,13,14,15, e il sistema di triturazione del biopolimero utilizzato nel protocollo è stato indicato per purificare alta qualità, RNA totale dai tessuti nel 200612. Inoltre, studi precedenti hanno confermato l'accuratezza e la sensibilità di aspetti del protocollo (cioè la sintesi cDNA con trascrizione inversa, polimerasi poli(A) e primer oligo-dT dall'RNA totale estratto) per la determinazione dell'espressione del miRNA da qRT-PCR con un colorante intercalante14,15. Dal momento che il nuovo protocollo ha i vantaggi di semplicità, risparmio di tempo, e la riduzione degli errori tecnici, il protocollo può essere utilizzato nella ricerca che richiede l'identificazione accurata e sensibile del profilo miRNA nel rene del topo. Inoltre, il protocollo potrebbe essere applicato alle indagini su molte condizioni patologiche.

Descriviamo poi la determinazione dei profili di espressione miRNA nei topi con UUO, che è legata alla fibrosi interstiziale renale. Nell'uomo, la fibrosi interstiziale renale è una caratteristica comune e importante sia della malattia renale cronica che della malattia renale dello stadio finale, indipendentemente dalla loro eziologia16,17. Questa fibrosi interstiziale renale è associata alla progressione dell'insufficienza renale, ed è caratterizzata da una maggiore espressione di componenti di matrice extracellulare negli spazi interstiziali (ad esempio, collagene, fibronectina e actin muscolare α liscio)17,18.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico Animale della Jichi Medical University e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida Sull'uso e la cura degli animali sperimentali della Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.

1. La chirurgia farsa

  1. Preparare i seguenti elementi: isoflurane, foglio di sughero, crema depilatoria, salviette di laboratorio, piatto Petri con salina tamponata di fosfati (PBS), 4-0 nylon, pinzette, forbici chirurgiche, tamponi di cotone e topi maschi C57BL/6 di 8 settimane.
  2. Anestesizzare un topo con l'1,5% isoflurane e mantenere a 1,5%. Quindi, applicare la crema depilatoria all'addome del topo. Dopo alcuni minuti, pulire la crema depilatory con una salvietta da laboratorio imbevuta di PBS.
  3. Iniettare il 70% di etanolo nell'addome del topo e quindi posizionare il mouse sul foglio di sughero nella posizione supina.
  4. Utilizzando forbici chirurgiche e pinzette, fare un'incisione nella pelle all'addome e tagliare il muscolo e la membrana peritoneale dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole.
  5. Inumidire due tamponi di cotone con PBS e poi tirare l'intestino con attenzione a lato. Posizionare i tamponi in umido per identificare il rene sinistro e l'uretere.
  6. Chiudere la membrana peritoneale e quindi chiudere l'incisione con 4-0 di nylon.

2. La chirurgia UUO

  1. Preparare i seguenti elementi: isoflurane, foglio di sughero, crema depilatoriale, salviette di laboratorio, piatto Petri con PBS, 4-0 di seta, 4-0 nylon, una siringa da 2,5 mL, tamponi di cotone, pinzette, forbici chirurgiche e topi maschi C57BL/6 di 8 settimane.
  2. Anestesizzare un topo con l'1,5% isoflurane e mantenere a 1,5%. Quindi applicare la crema depilatoria all'addome del topo. Dopo alcuni minuti, pulire la crema depilatory con una salvietta da laboratorio imbevuta di PBS.
  3. Iniettare il 70% di etanolo nel topo dell'addome del topo e quindi posizionare il mouse nella posizione supina sul foglio di sughero.
  4. Utilizzando forbici chirurgiche e pinzette, fare un'incisione nella pelle all'addome e tagliare il muscolo e la membrana peritoneale dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole.
  5. Posizionare la siringa da 2,5 mL sotto il mouse. Prendi due tamponi di cotone e inumidili con PBS. Tirare l'intestino con attenzione a lato con le pinzette, e posizionare i tamponi inagiati in modo appropriato per identificare l'uretere sinistro. Utilizzando le pinzette, sollevare il rene sinistro.
  6. Utilizzare la seta 4-0 per ligare l'uretere sinistro in due punti circa 1 cm di distanza. Tagliare l'uretere al punto centrale delle due legature, quindi utilizzare le suture di nylon 4-0 per chiudere la membrana peritoneale e l'incisione.

3. Raccolta di campioni di rene

  1. Preparare quanto segue: tubi microcentrifuge da 1,5 mL, isoflurane, foglio di sughero, 70% di etanolo, piatto Petri con PBS, pinzette e forbici chirurgiche.
  2. Anestesizzare un topo con l'1,5% isoflurane e mantenere a 1,5%. Iniettare il 70% di etanolo nel suo addome e mettere il mouse sul foglio di sughero nella posizione supina.
  3. Utilizzando forbici chirurgiche e pinzette, fare un'incisione nella pelle all'addome e tagliare il muscolo e la membrana peritoneale dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole.
  4. Sollevare la membrana peritoneale con le pinzette. Con le forbici chirurgiche, fare un'incisione laterale sul bordo superiore della membrana peritoneale e continuare l'incisione lungo il bordo più basso delle costole.
  5. Successivamente, identificare il rene sinistro, reflusso con PBS fino a quando il rene diventa giallo-bianco per lavare il sangue dai vasi, e rimuovere il rene tagliando l'arteria renale sinistra e vena con le forbici chirurgiche. Mettere il rene nel piatto Petri e lavarlo con cura con PBS.
  6. Tagliare il rene in campioni di 10 mg con le forbici chirurgiche e pinzette (10 mg è una dimensione appropriata per il passo successivo). Mettere ogni pezzo del rene nel proprio tubo microcentrifrifuge da 1,5 mL e chiudere il tappo del tubo.
  7. Trasferire ogni tubo di microcentrifuge in azoto liquido e mantenere i tubi a 80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine prima dell'uso.

4. Estrazione dell'RNA totale dai campioni di rene

  1. Preparare i seguenti elementi: tubi microcentrifuge da 1,5 mL, tubi microcentrifuge da 2,0 mL, 100% etanolo, cloroformio, omogeneizzatore di silicio, ghiaccio, un miscelatore a vortice, colonne di rotazione biopolimere in tubi di raccolta 2,0 mL11,12, colonne di rotazione ancorate a membrana in tubi di raccolta 2,0 mL12,13, reagente di lisi a base di fenolo/guanidine, buffer di lavaggio contenente guanidina ed etanolo (buffer di lavaggio 1), buffer di lavaggio contenente etanolo (lavaggio buffer 2) e acqua libera da RNase.
  2. Mettere un campione di rene da 10 mg nell'omogeneizzatore di silicio. Aggiungere 700 lL del reagente di lisi a base di fenolo/guanidina nell'omogeneizzatore.
  3. Preparare l'omogeneizzatore e quindi premere/torcere lentamente il pestello dell'omogeneizzatore contro il campione renale per omogeneizzare il campione. Ripetere la pressatura/torsione fino a quando il campione renale non viene completamente sciolto nel reagente di lisi a base di fenolo/guanidina.
  4. Per omogeneizzare ulteriormente il campione, trasferire il llysate omogeneizzato (in un tubo di raccolta di 2,0 mL) nella colonna di spin del biopolimero.
  5. Ruotare l'lalisato omogeneizzato a 14.000 x g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT), quindi trasferire l'llisato precipitato in un tubo di microcentrifuge di 1,5 mL inutilizzato.
  6. Unire il lico nel tubo con 140 L di cloroformio e quindi chiudere saldamente il tappo del tubo. Per mescolare il licosato e il cloroformio, invertire il tubo 15 volte.
    NOTA: Il cloroformio può essere utilizzato senza cappuccio.
  7. Incubare ogni campione per 2-3 min a RT e poi girare ogni campione a 12.000 x g per 15 min a 4oC.
  8. Senza disturbare il precipitato, trasferire il supernatanto (che in genere è di 300 l) in un nuovo tubo microcentrifuge da 1,5 mL, quindi aggiungere 1,5 volte il suo volume (tipicamente 450 l) di etanolo al 100%. Vortice la miscela per 5 s.
  9. Caricare 700 L del campione su una colonna di spin ancorata alla membrana in un tubo di raccolta di 2,0 mL. Chiudere l'tappo della colonna e ruotare la colonna a 15.000 x g per 15 s. Gettare via il lisate precipitato nel tubo di raccolta.
  10. Lavare accuratamente il campione aggiungendo 700 L di buffer di lavaggio 1 alla colonna di spin ancorata alla membrana in un tubo di raccolta di 2,0 mL. Chiudere l'intestazione della colonna e ruotare la colonna a 15.000 x g per 15 s. Gettare via il lisate precipitato nel tubo di raccolta.
  11. Caricare 500 L del buffer di lavaggio 2 sulla colonna di spin ancorata alla membrana in un tubo di raccolta di 2,0 mL per rimuovere i sali di traccia. Chiudere l'intestazione della colonna e ruotare la colonna a 15.000 x g per 15 s. Gettare via il lisate precipitato nel tubo di raccolta.
    NOTA: una colonna di spin ancorata alla membrana può separare RNA e DNA.
  12. Eseguire nuovamente il passaggio 4.11.
  13. Ruotare nuovamente la colonna di rotazione ancorata alla membrana in un tubo di raccolta di 2,0 mL a 15.000 x g per 1 min. Gettare via il lisate precipitato nel tubo di raccolta.
  14. Trasferire la colonna di rotazione ancorata a membrana in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 mL. Sciogliere l'RNA totale aggiungendo 30 L di acqua senza RNase alla colonna. Chiudere il tappo della colonna e attendere 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, ruotare la colonna a 15.000 x g per 1 min.
  15. Trasferire la quantità totale di campione contenente RNA totale in un nuovo tubo microcentrifuge. Mettere ciascuno dei tubi sul ghiaccio e misurare la concentrazione di RNA totale dalla spettrofotometria.
  16. Conservare i tubi con campioni a 80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine prima dell'uso.

5. Sintesi di cDNA con la trascrizione inversa dell'RNA totale

NOTA: Le linee guida MIQE (Minimum Information for the Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) sono state emanate per incoraggiare migliori pratiche sperimentali e contribuire a ottenere risultati affidabili e inequivocabili19. In questo protocollo, cDNA è sintetizzato da 1,0 g di RNA totale purificato in una procedura in due passaggi utilizzando la trascrizione inversa, la polimerasi poli(A) e l'oligo-dT primer.

  1. Preparare quanto segue: tubi microcentrifuge da 1,5 mL, tubi a striscia a otto possimi con tappi, il tappo di ogni tubo a otto strisce, acqua distillata, ghiaccio, un kit di trascrizione inversa (vedi tabella dei materiali )14,15 nello stato fuso, un ciclo termico e un mixer a vortice.
  2. Avviare il ciclo termico.
  3. Preparare una soluzione di miscela principale: Aggiungere 2,0 L di mix di trascrizione inversa (incluso nel kit) e 2,0 L di miscela di acido nucleico 10x in 4,0 L di buffer hi-spec 5x (per ottenere un totale di 8,0 L mix master per tubo).
  4. Mettere 8,0 L della soluzione di miscela principale in ogni tubo di un tubo a strisce a otto pota.
  5. Regolare la densità totale dell'RNA. Per isolare 1,0 g di RNA totale dai campioni renali in 12 L di acqua libera da RNase, trasferire la quantità appropriata di RNA totale nell'acqua distillata, utilizzando i dati di densità misurati come descritto al punto 4.15.
    NOTA: Se è presente una contaminazione del DNA, il DNA contaminato sarà co-amplificato nel qRT-PCR.
  6. Inserire un aliquot di 12 L di RNA totale in ogni tubo e chiudere il tappo del tubo. Centrifugare il tubo per 15 x.
  7. Mettere il tubo nel ciclo termico e incubare il campione per 60 min a 37 gradi centigradi. Successivamente, incubare immediatamente il campione per 5 minuti a 95 gradi centigradi per la sintesi di CDNA.
  8. Una volta completata l'incubazione, trasferire il CDNA in un nuovo tubo microcentrifrifuge da 1,5 mL e diluire il cDNA dieci volte (1:10) con acqua distillata. Vortice e centrifuga il tubo per 5 s.
  9. Conservare temporaneamente il cDNA diluito sul ghiaccio e spostare i campioni a 80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine prima dell'uso.

6. qRT-PCR di miRNA

NOTA: Abbiamo usato il metodo intercalatore per eseguire il qRT-PCR del miRNA. I primer per l'RNA sono U6 piccolo nucleare 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, e miRNA-7219-5p sono stati utilizzati.

  1. Preparare quanto segue: tubi microcentrifuge da 1,5 mL, miscelatore a vortice, piastra di reazione a 96 possi per il qRT-PCR, Pellicola adesiva per la piastra di reazione 96-well, un applicatore pellicola adesivo, un rotore centrifuga da 96 pozzo, primer specifici di miRNA, uno strumento PCR in tempo reale e un kit PCR a base di colorante verde (vedi la Tabella dei Materiali)14,15 contenente 2x pcR master mix e 10x primer universale.
  2. Dopo averli mescolati in tubi microcentrifuge da 1,5 mL, vortice i seguenti elementi: 6,25 L di acqua distillata, 1,25 L di ogni primer da 5 M miRNA disciolto in acqua senza nucleasi, 12,5 L di 2× miscela master PCR e 2,5 L di 10x primer universale.
  3. Preparare il cDNA sintetizzato come descritto nel passaggio 5, e scioglierlo. Vortice e centrifuga il cDNA per 5 s.
  4. Mettere un aliquot 22,5 L del reagente (creato come descritto al punto 6.2) in ciascun pozzo della piastra a 96 pote.
  5. Mettete un aliquot di cDNA da 2,5 L in ogni pozzo della piastra.
  6. Utilizzando l'applicatore pellicola adesivo, fissare saldamente la pellicola adesivo sulla piastra 96-well. Centrifugare la piastra con il rotore centrifuga da 96-well a 1.000 x g per 30 s per regolare le reazioni nella parte inferiore di ogni pozzo.

7. Ciclo PCR

  1. Avviare il sistema PCR in tempo reale e posizionare la piastra creata come descritto nel passaggio 6.6. nel sistema PCR in tempo reale. Impostare le proprietà dell'esperimento successivo; identificare il nome dell'esperimento. Selezionare quanto segue: "96-well (0,2 mL)" come tipo di esperimento del sistema, "Comparative CT"" come metodo di quantificazione, "SYBR Green Reagents" come reagenti per rilevare la sequenza di destinazione e "standard" come viene eseguito dal sistema.
  2. Assegnare un nome al campione e al miRNA di destinazione, quindi assegnare un nome al campione e al miRNA di destinazione in ogni pozzo. I campioni devono essere assegnati in duplicato al fine di ottenere i dati appropriati per la conferma dei risultati. Selezionare un campione di riferimento e un controllo endogeno, quindi selezionare "nessuno" per il colorante da utilizzare come riferimento passivo. Assicurarsi di impostare la trascrizione inversa negativa e il controllo non modello per l'espressione miRNA al fine di eliminare la contaminazione incrociata dei reagenti.
  3. Assicurarsi che l'impostazione del volume di reazione sia "20 L" e che le condizioni di ciclismo PCR siano fissate a 95 gradi centigradi per 15 minuti, seguite da 40 cicli di denaturazione a 94 gradi centigradi per 15 s, annealing a 55 gradi centigradi per 30 s e estensione a 70 s.
  4. Una volta completato il processo qRT-PCR, utilizzare il programma software del sistema per analizzare i dati qRT-PCR. Assicurarsi che la linea di soglia selezionata automaticamente dal programma software sia appropriata per ogni pozzo.
  5. Controllare il valore del ciclo di soglia (CT) del controllo endogeno e del miRNA di destinazione analizzati in ogni campione. Il valore CT è determinato dall'intersezione tra la curva di amplificazione e la linea di soglia. Nel presente studio, abbiamo usato RNU6-2 come controllo endogeno per il livello di espressione del miRNA di destinazione, e abbiamo usato il metodo di espressione di tipo .CT per determinare il livello di espressione relativa di ogni miRNA20 di destinazione.

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Risultati

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Un modello di topo UUO è stato creato dalla legatura ureterale sinistra comedescritto 21 in topi maschi di 8 settimane di peso 20-25 g. Gli urester erano completamente ostruito dalla doppia legatura con suture di seta 4-0. Un analgesico (meloxicam 5 mg/kg, iniezione sottocutanea) è stato somministrato prima dell'intervento chirurgico e anche ogni giorno nei 2 giorni dopo l'intervento chirurgico. A 8 giorni dopo l'intervento chirurgico, i reni sono stati raccolti, sciacquati con PBS, sezionati e co...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo sopra descritto con qRT-PCR ha determinato con successo i livelli di espressione dei miRNA mirati. La valutazione dei miRNA estratti è importante quando si cerca di ottenere dati qRT-PCR significativi e, al fine di confermare la qualità dei miRNA prima di eseguire il qRT-PCR, il rapporto di assorbimento a 260 nm a quello a 280 nm deve essere controllato con uno spettrofotometro. Se una singola amplificazione PCR della lunghezza prevista e della temperatura di fusione o una curva di fusione monomodale non pu...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Michelle Goody, PhD, di Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) per aver modificato una bozza di questo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Qiagen79216Tampone di lavaggio 2
Qiagen1067933Tampone di lavaggio 1
Tokyo Laboratory Animals ScienceNon assegnato
Thermo Fisher Scientific4316813Piastra di reazione a 96 pozzetti
QiagenMS000017015'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen
MS000651415'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3'Qiagen
MS000680675'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3'Qiagen
MS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen
217004Spin ancorato a membrana colonna in provetta
pertrascrittasi inversaQiagen
Kit per PCRverde Qiagen79654
Colonne di centrifuga in biopolimeroQiagen79654
a base di fenolo/guanidinaQiagen79306
Strumento per PCR in tempo reale
Codice 9968-32
Thermo Fisher Scientific 4311971 Pellicola adesiva per piastra di reazione a 96 pozzetti da 2,0 mLKit 218073 218161 a base di colorante Reagente di lisi Thermo Fisher Scientific 4472380 Thermo Fisher Scientific 4472380 Software per strumenti per PCR in tempo reale Qiagen 129112 Qiagen MS00033740 Non divulgato Takara Bio 9790B Omogeneizzatore al silicio ASKUL GA04SW AS ONE ER1004NA45-KF2,62 -

Riferimenti

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