Articolo metodologico

Valutazione PCR in tempo reale quantitativa delle espressioni di microRNA nel rene del topo con ostruzione ureterale unilaterale

DOI:

10.3791/61383

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27 agosto 2020

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1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un metodo per valutare l'espressione del microRNA nei reni dei topi con ostruzione ureterale unilaterale (UUO) mediante reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa quantitativa. Questo protocollo è adatto per studiare i profili di espressione del microRNA renale nei topi con UUO e nel contesto di altre condizioni patologiche.

Abstract

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I microRNA (miRNA) sono singole molecole di RNA non codificanti che in genere regolano l'espressione genica a livello post-trascrizionale legandole a siti bersaglio parzialmente complementari nella regione non tradotta (UTR) dell'RNA messaggero (mRNA), che riduce la traduzione e la stabilità dell'mRNA. I profili di espressione miRNA in vari organi e tessuti dei topi sono stati studiati, ma i metodi standard per la purificazione e la quantificazione del miRNA nel rene del topo non sono stati disponibili. Abbiamo stabilito un metodo efficace e affidabile per estrarre e valutare l'espressione del miRNA nel rene del topo con fibrosi interstiziale renale mediante reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR). Il protocollo richiedeva cinque fasi: (1) creazione di topi finti e unilaterali di ostruzione ureterale (UUO); (2) estrazione di campioni renali dai topi UUO; (3) estrazione dell'RNA totale, che include il miRNA, dai campioni di rene; (4) sintesi del DNA complementare (cDNA) con trascrizione inversa dal miRNA; e (5) qRT-PCR utilizzando il cDNA. Utilizzando questo protocollo, abbiamo confermato con successo che rispetto ai controlli, l'espressione di miRNA-3070-3p è stata significativamente aumentata e quelli di miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p sono stati significativamente diminuiti nei reni di un modello murino di fibrosi interstiziale renale. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare l'espressione di miRNA nei reni dei topi con UUO.

Introduzione

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I microRNA (miRNA) - gli RNA corti e non codificanti che causano la degradazione e l'inibizione trascrizionale dell'RNA messaggero (mRNA)1 - hanno dimostrato di regolare l'espressione di vari mRNA che hanno ruoli cruciali sia nella fisiologia che nella malattia (ad esempio, infiammazione, fibrosi, disturbi metabolici e cancro). Alcuni dei miRNA possono quindi essere candidati nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici per una varietà di malattie2,3,4,5. Anche se i profili di espressione del miRNA negli organi murini e ....

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Protocollo

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Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico Animale della Jichi Medical University e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida Sull'uso e la cura degli animali sperimentali della Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.

1. La chirurgia farsa

  1. Preparare i seguenti elementi: isoflurane, foglio di sughero, crema depilatoria, salviette di laboratorio, piatto Petri con salina tamponata di fosfati (PBS), 4-0 nylon, pinzette, forbici chirurgiche, tamponi di cotone e topi maschi C57BL/6 di 8 settimane.
  2. Anestesizzare un topo con l'1,5% isoflurane e mantenere a 1,5%....

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Risultati

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Un modello di topo UUO è stato creato dalla legatura ureterale sinistra comedescritto 21 in topi maschi di 8 settimane di peso 20-25 g. Gli urester erano completamente ostruito dalla doppia legatura con suture di seta 4-0. Un analgesico (meloxicam 5 mg/kg, iniezione sottocutanea) è stato somministrato prima dell'intervento chirurgico e anche ogni giorno nei 2 giorni dopo l'intervento chirurgico. A 8 giorni dopo l'intervento chirurgico, i reni sono stati raccolti, sciacquati con PBS, sezionati e co.......

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Discussione

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Il protocollo sopra descritto con qRT-PCR ha determinato con successo i livelli di espressione dei miRNA mirati. La valutazione dei miRNA estratti è importante quando si cerca di ottenere dati qRT-PCR significativi e, al fine di confermare la qualità dei miRNA prima di eseguire il qRT-PCR, il rapporto di assorbimento a 260 nm a quello a 280 nm deve essere controllato con uno spettrofotometro. Se una singola amplificazione PCR della lunghezza prevista e della temperatura di fusione o una curva di fusione monomodale non pu.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Michelle Goody, PhD, di Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) per aver modificato una bozza di questo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Qiagen79216Tampone di lavaggio 2
Qiagen1067933Tampone di lavaggio 1
Tokyo Laboratory Animals ScienceNon assegnato
Thermo Fisher Scientific4316813Piastra di reazione a 96 pozzetti
QiagenMS000017015'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen
MS000651415'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3'Qiagen
MS000680675'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3'Qiagen
MS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen
217004Spin ancorato a membrana colonna in provetta
pertrascrittasi inversaQiagen
Kit per PCRverde Qiagen79654
Colonne di centrifuga in biopolimeroQiagen79654
a base di fenolo/guanidinaQiagen79306
Strumento per PCR in tempo reale
Codice 9968-32
Thermo Fisher Scientific 4311971 Pellicola adesiva per piastra di reazione a 96 pozzetti da 2,0 mLKit 218073 218161 a base di colorante Reagente di lisi Thermo Fisher Scientific 4472380 Thermo Fisher Scientific 4472380 Software per strumenti per PCR in tempo reale Qiagen 129112 Qiagen MS00033740 Non divulgato Takara Bio 9790B Omogeneizzatore al silicio ASKUL GA04SW AS ONE ER1004NA45-KF2,62 -

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
  2. Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.....

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Ristampe e permessi

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Tag

Espressione di microRNAEstrazione di RNASintesi di cDNAmiRNA 3070 3pmiRNA 7218 5pmiRNA 7219 5pFibrosi renale

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