Articolo metodologico

Un modello preclinico di impatto corticale controllato per emorragia traumatica, contusione e neuroinfiammazione

DOI:

10.3791/61393

⸱

10 giugno 2020

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Cheng Hsin General Hospital, 2Graduate Institute of Physiology, College of Medicine, National Taiwan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'emorragia intraparenchimale e la neuroinfiammazione accompagnate da contusione cerebrale possono innescare gravi lesioni cerebrali secondarie. Questo protocollo descrive in dettaglio un modello di impatto corticale controllato (CCI) sui topi, che consente ai ricercatori di studiare l'emorragia, la contusione e le risposte immunitarie post-traumatiche ed esplorare potenziali terapie.

Abstract

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La contusione cerebrale è un grave problema medico che colpisce milioni di persone in tutto il mondo ogni anno. C'è un urgente bisogno di comprendere il meccanismo fisiopatologico e di sviluppare una strategia terapeutica efficace per questo devastante disturbo neurologico. L'emorragia intraparenchimale e la risposta infiammatoria post-traumatica indotta dall'impatto fisico iniziale possono aggravare l'attivazione di microglia/macrofagi e la neuroinfiammazione che successivamente peggiorano la patologia cerebrale. Forniamo qui un protocollo di impatto corticale controllato (CCI) in grado di riprodurre la contusione corticale sperimentale nei topi utilizzando un sistema di impattatore pneumatico per erogare forza meccanica con entità e velocità controllabili sulla superficie durale. Questo modello preclinico consente ai ricercatori di indurre una contusione cerebrale focale moderatamente grave nei topi e di studiare un'ampia gamma di progressioni patologiche post-traumatiche tra cui emorragia, contusione, attivazione di microglia/macrofagi, tossicità del ferro, danno assonale, nonché deficit neurocomportamentali a breve e lungo termine. Il presente protocollo può essere utile per esplorare gli effetti a lungo termine e i potenziali interventi per la contusione cerebrale.

Introduzione

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La contusione cerebrale è una forma di lesione cerebrale traumatica che si colloca in cima alla classifica tra i problemi di salute più letali nella società moderna1. È causato principalmente da eventi accidentali come un incidente stradale che provoca forze esterne che applicano energia meccanica alla testa. La lesione cerebrale traumatica colpisce circa 3,5 milioni di persone e rappresenta il 30% di tutti i decessi correlati a lesioni acute negli Stati Uniti ogni anno2. I pazienti che sopravvivono alla contusione cerebrale spesso soffrono di conseguenze a lungo termine, tra cui debolezza motoria focale, disfunzione sensoriale e malattia mentale1.

La lesione primaria della contusione cerebrale è indotta da fattori meccanici, tra cui le forze di stiramento e lacerazione, che portano all'immediata deformazione della struttura parenchimale e alla morte focale delle cellule del SNC3. Emorragia contusione è un termine generico per le emorragie cerebrali dovute a lacerazione vascolare nel sito del trauma cranico4. In particolare, l'emorragia intraparenchimale si verifica immediatamente dopo una contusione cerebrale che porta a una formazione ritardata di ematomi. All'interno dell'ematoma, l'emoglobina e il ferro libero rilasciati dai globuli rossi lisati possono innescare ulteriormente la tossicità correlata al sangue 5,6 che causa ernia, edema cerebrale e aumento della pressione intracranica 5,6. Anche le funzioni collaborative dei neuroni (assoni), della glia, dei vasi sanguigni e del tessuto di supporto sono compromesse dall'effetto massa dell'ematoma7. Inoltre, la neuroinfiammazione persistente e diffusa con neurodegenerazione progressiva continua per mesi e causa danni secondari nel cervello8.

L'attivazione della microglia è una delle molte importanti caratteristiche patologiche della contusione cerebrale 9,10. Dopo aver rilevato i modelli molecolari associati al danno (DAMP) e il sangue fuoriuscito nel tessuto danneggiato, la microglia attivata innesca la neuroinfiammazione che favorisce il danno cerebrale secondario11. Inoltre, il chemioattrattivo rilasciato dalla microglia promuove l'infiltrazione delle cellule immunitarie periferiche nel territorio traumatico con conseguente produzione di specie reattive dell'ossigeno e citochine pro-infiammatorie. Questo crea un ambiente pro-infiammatorio che si auto-perpetua e innesca una lesione cerebrale progressiva 9,12. Nel frattempo, le microglia con un fenotipo attivato in modo alternativo possono contribuire al ripristino omeostatico dei tessuti e alla riparazione cerebrale attraverso l'eliminazione dei detriti dal tessuto danneggiato13. La prevenzione della neuroinfiammazione secondaria riducendo le risposte immunitarie microgliali dannose ha dimostrato di essere particolarmente utile per promuovere il recupero cerebrale dalla contusione cerebrale 3,9,10,12.

Sono stati sviluppati diversi modelli preclinici per lo studio delle lesioni cerebrali traumatiche, tra cui il modello a caduta di peso, la lesione a percussione laterale del fluido e il modellodell'onda d'urto 14,15. Tuttavia, ognuno di questi modelli ha i suoi punti deboli, tra cui l'alto tasso di mortalità durante la procedura, la bassa riproducibilità dei risultati istologici e l'elevata variabilità delle lesioni inflitte tra i laboratori16,17. In confronto, il modello di impatto corticale controllato (CCI) è più adeguato per lo studio della contusione cerebrale focale a causa del suo controllo preciso e dell'elevata riproducibilità 14,15,18,19.

Inoltre, attraverso la manipolazione dei parametri di deformazione biomeccanica come la velocità e la profondità dell'impatto, la gravità del danno indotto può essere controllata per produrre un'ampia gamma di entità della lesione, consentendo ai ricercatori di imitare diversi livelli di compromissione spesso osservati nei pazienti17. Il modello preclinico di CCI è stato sviluppato per la prima volta nel 189620. Da allora, la CCI è stato il modello più ampiamente applicabile ad essere modificato per l'uso nei primati21, nei suini22, negli ovini23, nei ratti24 e nei topi25. L'insieme di queste caratteristiche rende la CCI uno dei modelli sperimentali di contusione cerebrale più adatti26.

Il nostro laboratorio utilizza un sistema pneumatico di impatto CCI disponibile in commercio e parametri di deformazione biomeccanica testati per produrre una contusione cerebrale focale moderatamente grave che territorializza le aree corticali sensoriali e motorie primarie senza danneggiare l'ippocampo27,28. Noi e altri abbiamo dimostrato che questa procedura CCI può essere utilizzata per studiare le caratteristiche cliniche della contusione cerebrale umana, tra cui la perdita di tessuto cerebrale, il danno neuronale, l'emorragia intraparenchimale, la neuroinfiammazione e il deficit sensomotorio 24,25,27,28,29,30 . Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo standard per eseguire la CCI nel topo che consente di porre domande sulla perdita di mielina indotta dalla CCI, sulla deposizione di ferro, sull'infiammazione del SNC, sulla tossicità emorragica e sulle risposte di microglia/macrofagi all'indomani di una contusione cerebrale focale.

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Protocollo

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Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state condotte sotto l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso il Cheng Hsin General Hospital e il National Taiwan University College of Medicine. In questo protocollo sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 wild type di età compresa tra otto e dieci settimane.

1. Induzione dell'anestesia

  1. Anestetizzare il topo con isoflurano del ~4% miscelato con aria ambiente a ~0,2 L/min in una camera di induzione collegata al vaporizzatore di isoflurano.
  2. Assicurarsi che il modello respiratorio sia regolare. Controllare la profondità dell'anestesia confermando la mancanza di riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi nell'animale.

2. Preparazione pre-chirurgica

  1. Radere la testa del mouse con un tagliacapelli elettrico in direzione da caudale a rostrale. Non tagliare i baffi del mouse.
    NOTA: La perdita dei baffi può influenzare l'accuratezza dei risultati dei successivi test comportamentali.
  2. Posiziona il mouse sul fotogramma stereotassico. Inserire con cautela le barre auricolari nei canali uditivi. Assicurarsi che la testa del mouse sia stabilizzata allo stesso modo da entrambe le barre auricolari.
  3. Portare il cono nasale e mantenere l'anestesia all'1% - 2% di isoflurano per tutta la durata dell'intervento.
  4. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per evitare che si secchi durante l'intervento. Tenere l'animale su un termoforo per mantenere una temperatura corporea di 37 °C.
  5. Disinfettare la testa rasata con betadina seguita da alcol al 70% utilizzando tamponi di cotone sterili. Ripeti tre volte.

3. Chirurgia CCI

  1. Somministrare 100 μl di bupivacaina (0,25%) per via sottocutanea utilizzando un ago da insulina da 31 G prima dell'incisione. Massaggiare delicatamente il sito di iniezione per un migliore assorbimento.
    NOTA: Questo anestetico locale fornisce sollievo dal dolore direttamente nel sito dell'intervento chirurgico.
  2. Praticare un'incisione longitudinale (~1,5 cm) lungo la linea mediana del cuoio capelluto con un bisturi o delle forbici. Usa un emostatico per tenere la pelle sul lato destro e lascia asciugare il cranio esposto per 1 minuto. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per rimuovere eventuali residui di sangue e tessuti sul cranio.
  3. Verificare che la testina del mouse sia a livello sul piano orizzontale.
    1. Identifica i punti di riferimento anatomici Bregma e Lambda e contrassegna entrambe le posizioni con un pennarello/matita chirurgica sterile.
    2. Assicurarsi che la testa dell'animale sia a livello in direzione rostrale-caudale. A tale scopo, misurare le coordinate Z di Bregma e Lambda utilizzando un ago da insulina da 31 G collegato al telaio stereotassico.
      NOTA: Regolare la barra auricolare verticalmente, se necessario.
    3. Eseguire il posizionamento orizzontale della testa dell'animale seguendo la stessa procedura di controllo delle coordinate Z sulla linea mediana insieme a due posizioni corrispondenti sul lato sinistro e destro della linea mediana e regolare le barre auricolari se necessario.
      NOTA: Un posizionamento livellato e stabile della testa dell'animale è fondamentale per la riproducibilità e l'affidabilità del modello CCI.
  4. Utilizzare lo stesso ago da insulina da 31 G per identificare il sito della craniectomia. Impostare l'origine XY su Bregma e spostare lateralmente l'ago di 3 mm verso destra. Segna questa posizione come sito di craniectomia e disegna un cerchio di 4 mm di diametro sul cranio con un pennarello/matita chirurgica sterile.
  5. Utilizzare un micro trapano ad alta velocità con una trefina (diametro 4 mm) per tagliare lungo il cerchio delineato a matita per creare un foro aperto di 4 mm di diametro. Utilizzare un'impostazione di velocità di 20.000 giri/min. Evitare di applicare una pressione eccessiva.
    NOTA: Eseguire questo passaggio rapidamente (di solito entro 30 s a 1 minuto) per evitare danni termici al cervello. L'applicazione di una pressione eccessiva durante la perforazione può portare a una penetrazione accidentale che potrebbe comprimere e ferire la superficie del cervello.
  6. Rimuovere con cura il lembo osseo con una pinzetta e conservarlo temporaneamente in soluzione fisiologica ghiacciata. Sciacquare delicatamente il foro con soluzione fisiologica normale prima di applicare pressione sulla superficie del cervello con la punta del batuffolo di cotone per fermare l'emorragia.
  7. Impostare la punta dell'impattatore arrotondata da 2,5 mm di diametro sul dispositivo CCI su un angolo di 22,5°. Azzerare la punta d'impatto sulla superficie durale. Impostare i parametri di impatto sulla scatola di controllo su una velocità di 4 m/s e una profondità di deformazione di 2 mm. Ritrarre la punta metallica.
    NOTA: L'azzeramento della punta mentre è staticamente e leggermente premuta contro la superficie durale nella posizione di corsa completa migliora la precisione del punto zero e la riproducibilità del livello di lesione.
  8. Scaricare il pistone per generare un impatto sul cervello. Posiziona un batuffolo di cotone sterile sulla zona lesa per fermare l'emorragia.
  9. Riposizionare il lembo osseo sul cervello del topo e fissarlo con cemento dentale. Chiudere il cuoio capelluto con adesivo per tessuti (ad es. 3M Vetbond).

4. Recupero postoperatorio

  1. Metti il topo in una gabbia di recupero pulita con lettiera sotto la lampada riscaldante fino al completo recupero.
  2. Fornire cibo inumidito e somministrare per via sottocutanea ketoprofene (5 mg/kg) per due giorni consecutivi dopo l'intervento chirurgico.
  3. Eseguire le procedure di cui sopra, ad eccezione dei passaggi 3.7 e 3.8 per gli animali di controllo fittizi.

5. Eutanasia del topo

  1. Eutanasia dei topi il giorno dello studio mediante overdose di isoflurano e quindi decapitazione.
    NOTA: Diverse strategie possono essere utilizzate per l'eutanasia degli animali da esperimento prima della raccolta del campione.
  2. Raccogli campioni di cervello per l'analisi istologica.

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Risultati

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Illustrazione del posizionamento stereotassico e della procedura di craniotomia.

Il modello CCI è noto per la sua stabilità e riproducibilità nel produrre lesioni che vanno da lievi a gravi18. La corretta tecnica stereotassica e la procedura di craniotomia sono i principali determinanti nella produzione di una lesione cerebrale indotta da CCI stabile e riproducibile (Figura 1A, B). Una procedura di cranioto...

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Discussione

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Il protocollo CCI produce lesioni meccaniche altamente riproducibili al cervello per la ricerca sulla contusione cerebrale. I seguenti passaggi sono cruciali per generare lesioni cerebrali coerenti negli animali che utilizzano questo protocollo CCI.

Innanzitutto, la testa del mouse deve essere montata in modo stabile sul telaio stereotassico e i punti di riferimento anatomici Bregma e Lambda sempre sullo stesso piano orizzontale. Un posizionamento instabile o ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Danye Jiang per aver modificato il manoscritto e per il suo contributo perspicace. Ringraziamo Jhih Syuan Lin per l'assistenza nella preparazione del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST 107-2320-B-002-063-MY2) a C.F.C.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4mm breve trephine drillsalvin specialità dentali, inc.TREPH-SHORT-4
anticorpo Iba1 Wakochemicals#019-19741
anticorpo anti-Ly76abcamab91113
cemento carbossilato3M70201136010
contusione corticale impattatore Fabbricazione, Inc.S/N 49-2004-C, dispositivo CCI eCCI modello 6.3(S/N 49-2004-C, eCCI modello 6.3)
acetato di violetto di cresileDAB Sigma-AldrichC5042
anticorpo secondario IgG anti-coniglio vettoriale
Mayer's HematoxylinScyTekHMM500
pinzettestrumenti per la scienza fine11252-20 NO. 5
isofluranoPanion & BF Biotech Inc.
Bupivacaina 0,25%Hospira
carbonato di litioSigma-Aldrich62470
steriotexic framestoelting
forbiciper scienze fini14068-12
solvente blu 38Sigma-AldrichS3382
, kit di colorazione , SK-4105, Alexa Fluor 488, Invitrogen A11034, anticorpo secondario IgG anti-ratto di capra, Alexa Fluor 594, Invitrogen A11007 strumenti

Riferimenti

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