Il protocollo qui descritto evidenzia i principali passaggi nella differenziazione delle cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte, nella preparazione di Neisseria meningitidis per l'infezione e nella raccolta di campioni per altre analisi molecolari.
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Articolo metodologico
Meningitidis di Neisseria Infezione di cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte
In questo articolo
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Sommario
Abstract
La meningite meningococcica è un'infezione pericolosa per la vita che si verifica quando Neisseria meningitidis (meningococco , Nm) può accedere al sistema nervoso centrale (SNC) penetrando nelle cellule endoteliali cerebrali (BEC) altamente specializzate. Poiché Nm è un patogeno specifico per l'uomo, la mancanza di solidi sistemi modello in vivo rende difficile lo studio delle interazioni ospite-patogeno tra Nm e BEC e stabilisce la necessità di un modello basato sull'uomo che imiti i BEC nativi. I BEC possiedono proprietà di barriera più strette rispetto alle cellule endoteliali periferiche caratterizzate da complesse giunzioni strette e da un'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER). Tuttavia, molti modelli in vitro , come i BEC primari e i BEC immortalizzati, mancano o perdono rapidamente le loro proprietà di barriera dopo la rimozione dal microambiente neurale nativo. I recenti progressi nelle tecnologie delle cellule staminali umane hanno sviluppato metodi per derivare cellule endoteliali simili al cervello da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) che fenopiano meglio le BEC rispetto ad altri modelli umani in vitro . L'uso di BEC derivati da iPSC (IPSC-BEC) per modellare l'interazione Nm-BEC ha il vantaggio di utilizzare cellule umane che possiedono proprietà di barriera BEC e può essere utilizzato per esaminare la distruzione della barriera, l'attivazione immunitaria innata e l'interazione batterica. Qui dimostriamo come derivare le iPSC-BEC dalle iPSC oltre alla preparazione batterica, all'infezione e alla raccolta del campione per l'analisi.
Introduzione
La barriera emato-encefalica (BBB) e la barriera meningea sangue-liquido cerebrospinale (mBCSFB) sono barriere cellulari estremamente strette che separano la circolazione dal sistema nervoso centrale (SNC) e sono costituite principalmente da cellule endoteliali cerebrali (BEC) altamente specializzate1,2. Insieme, i BEC mantengono una corretta omeostasi cerebrale regolando i nutrienti e i prodotti di scarto dentro e fuori il cervello, escludendo molte tossine, farmaci e agenti patogeni 1,2. La meningite batterica si verifica quando i batteri trasmissibi....
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Protocollo
NOTA: Tutte le fasi di preparazione del terreno/reagente, del mantenimento delle cellule staminali e della differenziazione sono adattate da Stebbins et al.22.
1. Preparazione dei materiali necessari per la coltura delle iPSC e il differenziamento delle BEC.
- Rivestimento della matrice della plastica per coltura tissutale (TC) per coltura iPSC IMR90-4
- Aliquote di gel di matrice di membrana basale (ad es. Matrigel) in aliquote da 2,5 mg e conservare a -20 °C.
NOTA: Lavorare rapidamente quando si maneggia il gel della matrice e l'aliquota sul ghiaccio, poiché forma un gel al di sopra dei 4 °C e non p....
- Aliquote di gel di matrice di membrana basale (ad es. Matrigel) in aliquote da 2,5 mg e conservare a -20 °C.
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Risultati
Il protocollo qui descritto è adattato da Stebbins et al. ed evidenzia il processo per differenziare le iPSC in cellule endoteliali simili al cervello che possiedono proprietà BBB e come utilizzare questo modello per gli studi di infezione utilizzando iPSC-BEC con Nm19,22. Le iPSC-BEC, se differenziate correttamente, mostrano proprietà di barriera strette misurate da TEER che sono spesso superiori a 2000 Ω·cm2 ed esprimono marcatori endoteliali come VE.......
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Discussione
La modellazione dei BEC e della BBB ha avuto delle sfide, poiché i BEC umani primari e immortalizzati, in vitro, tendono a mancare di fenotipi di barriera robusti. L'avvento delle tecnologie delle cellule staminali umane ha permesso la generazione di cellule BEC derivate da iPSC che mantengono i fenotipi tipici della BBB come i marcatori endoteliali, l'espressione della giunzione stretta, le proprietà di barriera, la risposta ad altri tipi di cellule del SNC e i trasportatori funzionali dell'efflusso 12,13,14,15.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
L.M.E. è supportato dal programma di formazione alla ricerca DFG GRK2157 dal titolo "3D Tissue Models for Studying Microbial Infections by Human Pathogens" assegnato ad A.S-U. B.J.K. è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato della Fondazione Alexander von Humboldt. Inoltre, ringraziamo Lena Wolter per la sua assistenza tecnica nella generazione delle iPSC-BEC in cultura.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Accutase (1x) | Sigma | A6964 | Reagente di dissociazione cellulare enzimatica |
| Acido acetico | Sigma | A6283 | |
| Acido retinoico all-trans (RA) | Sigma | R2625 | |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
| Anti-Claudin-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
| Anti-Glut-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
| Anti-occludina | Invitrogen | 33-1500 | |
| Anti-VE-caderina | Santa Cruz | sc-52751 | |
| Anti-ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
| Bacto Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| b-Mercaptoetanolo | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
| Piastre e matracci per colture cellulari | Centrifuga Sarstedt | ||
| (Heraeus Megafuge 1.0R) | Cabina | ||
| Classe II | Incubatore a CO2 Nuaire | NU-437-400E | |
| (Incubatore a CO2 con camicia d'aria DHD Autoflow) | Nuaire | ||
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Columbia ager + 5 % sangue di pecora | Biomerieux | 43049 | |
| Filtri in poliestere Costar Transwell (12 o 24 pozzetti) | Corning | 3460, 3470 | |
| D(+)-Glucosio | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
| DMSO | ROTH | A994.1 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Misuratore epiteliale di volt-ohm (Millicell ERS-2) con elettrodo STX | Merck (Millipore) | MERS00002 | |
| Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
| fibronectina | Sigma | F1141 | |
| (Eclipse Ti) | Nikon | ||
| Hemacytometer (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti basici umani (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
| Terreno libero da siero endoteliale umano (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
| Microscopio invertito (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
| iPS(IMR90)-4 cellule | |||
| Per preparare 110 ml di integratore Kellogg's, preparare 100 ml di 4 g/ml di glucosio, 0,1 g/ml di glutammina e 0,2 mg/ml di tiamina pirofosfato e 10 ml di 5 mg/ml di Fe(NO3)3 e combinare le soluzioni. Filtrare, sterilizzare e conservare aliquotato a -20 °C. | |||
| Sostituzione del siero knockout (KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutammina (GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
| LunaScript RT SuperMix Kit | NEB | E3010L | kit di sintesi di cDNA |
| Matrigel | Matrix Corning | 354230 | |
| Metanolo | ROTH | 4627,5 | |
| MgCl2 | ROTH | KK36.1 | |
| Micropipette (Research Plus) | Eppendorf | ||
| NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
| Aminoacidi non essenziali (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| Kit di isolamento dell'RNA NucleoSpin | isolamento dell'RNA | 740955 | Machery-Nagel |
| Pipette boy (Accu-Jet Pro) | Marchio | ||
| Siero plasmaderivato povero di piastrine, bovino (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR master mix |
| qPCR film qPCR (MicroAmp Optical Adhesive Film) | Applied Biosystems | 4211971 | |
| piastre qPCR (MicroAmp Fast 96-well) | Applied Biosystems | 4346907 | |
| Inibitore ROCK, Y27632 dicloridrato | Tocris | 1254 | |
| RT-PCR termociclatore (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Pipette sierologiche | Sarstedt | ||
| StemFlex terreno basale + 50x integratore StemFlex | Gibco | A3349401 | Terreno di mantenimento delle cellule staminali |
| Rotore a secchiello oscillante (Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
| Tiamina pirofosfato | Sigma | C8754-5G | |
| Soluzione di blu di tripano, 0,4% | Gibco | 15250061 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 | Reagente di dissociazione cellulare non enzimatica (EDTA) |
Riferimenti
- Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
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