Generazione e caratterizzazione quantitativa di cisti epiteliali biliari funzionali e polarizzate

Summary

I sistemi cellulari tridimensionali (3D) sono modelli rilevanti per lo studio dell'organogenesi. Viene proposto un metodo a base di idrogel per la produzione di cisti biliari e la loro caratterizzazione. Questo protocollo svela le barriere della caratterizzazione 3D, con un metodo semplice e affidabile per valutare l'efficienza di formazione delle cisti, le dimensioni e testarne la funzionalità.

Abstract

I colangiociti, le cellule epiteliali che allineano i dotti biliari nel fegato, supervisionano la formazione e la modifica della bile. Negli ultimi vent'anni, nel contesto delle malattie del fegato, sono emersi modelli tridimensionali (3D) basati su coriagiociti come cisti, sferoidi o strutture tube-like per imitare la topologia dei tessuti per l'organogenesi, la modellazione delle malattie e gli studi di screening farmacologico. Queste strutture sono state ottenute principalmente incorporando coriagiociti in un idrogel. Lo scopo principale era quello di studiare l'auto-organizzazione affrontando la polarità epiteliale, le proprietà funzionali e morfologiche. Tuttavia, pochissimi studi si concentrano sull'efficienza della formazione della cisti. In questo caso, l'efficienza viene spesso quantificata dalle immagini di un singolo piano. I test funzionali e l'analisi strutturale vengono eseguiti senza rappresentare la potenziale eterogeneità della distribuzione della cisti derivante da eterogeneità di polimerizzazione dell'idrogel ed effetti collaterali. Pertanto, l'analisi quantitativa, al termine, non può essere utilizzata per il confronto da un articolo all'altro. Inoltre, questa metodologia non consente confronti del potenziale di crescita 3D di diverse matrici e tipi di cellule. Inoltre, non si fa menzione della risoluzione dei problemi sperimentale per le cisti immunosotteninti. In questo articolo, forniamo un metodo affidabile e universale per dimostrare che la distribuzione iniziale delle cellule è correlata alla distribuzione verticale eterogenea della formazione di cisti. Le cellule di conlangiociti incorporate nell'idrogel sono seguite con l'analisi z-stack lungo la profondità dell'idrogel nel corso del tempo di 10 giorni. Con questo metodo, si ottiene una robusta cinetica di efficienza e crescita della formazione di cisti. Presentiamo anche metodi per valutare la polarità della cisti e la funzione secretoria. Infine, vengono forniti ulteriori suggerimenti per ottimizzare i protocolli di immunosottenzione al fine di limitare il collasso della cisti per l'imaging. Questo approccio può essere applicato ad altri studi di coltura cellulare 3D, aprendo così le possibilità di confrontare un sistema con un altro.

Introduction

Negli ultimi tre decenni, il campo della ricerca in vitro è avanzato verso i sistemi di coltura 3D. Un certo numero di protocolli sono emersi per coltivare cellule in 3D come sferoidi o aggregati in presenza o assenza di un'impalcatura / matrice, in una goccia, in agitazione, in dispositivi microfluidici o^{galleggianti 1}. L'uso di metodi di coltura 3D ha dimostrato i suoi vantaggi rispetto alle colture bidimensionali (2D), in particolare per le cellule epiteliali, che hanno dimostrato di auto-organizzarsi in strutture 3D, chiamate cisti o acini. In questo caso, le cellule formano un monostrato che circonda un lume, dove le cellule acquisiscono i....

Protocol

1. Generazione di cisti

NOTA: Questo protocollo può essere eseguito con qualsiasi tipo di idrogel, se la gelazione consente l'incorporamento di cellule.

1. Rivestimento idrogel
   NOTA: Un corretto rivestimento idrogel dello scivolo della camera è un passaggio critico per evitare la formazione di strati cellulari 2D sul fondo del pozzo, che potrebbe interferire con la successiva imaging della cisti e compromettere il calcolo dell'efficienza di formazione della cisti.
   1. Per garantire l'omogeneità della soluzione di gel, scongelare l'idrogel a 4 °C durante la notte (O/N).
   2. Punte di pipetta precool su ghiaccio o O/N a -2....

Results

Formazione e caratterizzazione delle cisti
I sistemi di coltura cellulare 3D sono uno strumento importante per studiare l'organogenesi e la modellazione delle^{malattie 25}. Sfortunatamente, la maggior parte di questi metodi sono qualitativi o utilizzano la quantificazione interna eseguita su un singolo piano confrontando il numero di cisti rispetto alle non cisti, in volumi variabili e spesso non specificati, impedendo qualsiasi confronto in termini di efficienza di formazione de.......

Discussion

Al fine di studiare l'organogenesi e il mantenimento delle strutture cellulari 3D, sono stati modellati vari tessuti, utilizzando diverse origini cellulari ma anche diversi tipi di matrici extracellulari tra cui idrogel sintetici^8,9,10,21. Tuttavia, a causa della mancanza di analisi quantitativa 3D che consente confronti tra metodi in termini di formazione di organoidi o funzionalità

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 µ l- Pipetta Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000020
100 µ l - Pipetta Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000046
1000 &; l - Pipetta Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000062
1X PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-094
200 µ l - Pipetta Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000054
3,3′,5-Triiodo-L-tironina sale sodico	Sigma-Aldrich	T5516	NRC media completa concentrazione finale = 3,4 µ g/mL
Acido acetico	VWR	20104-298	0,02N finale
Pipette barriera aerosol puntali 10 &; micro; l (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific 2707439
Pipette barriera per aerosol puntali 1000 & micro; l (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific 2707404
Pipette barriera per aerosol puntali 200 & micro; l (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707430
Soluzione antimicotica antibiotica (100X)	Sigma-Aldrich	A5955	NRC media completa concentrazione finale = diluizione 1:100
Estratto ipofisario bovino	Thermo Fisher Scientific	13028-014	NRC media completa concentrazione finale = 30 µ g/mL
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A2153	Diluizione 1:1000
Concentrato lipidico chimicamente definito (100X)	Thermo Fisher Scientific	11905-031	NRC completo medio concentrazione finale = diluizione 1:100
Collagene ad alta concentrazione, coda di ratto	Thermo Fisher Scientific	354249	50 &; g/mL concentrazione finale
Desametasone	Sigma-Aldrich	D4902	NRC concentrazione finale media completa = 0,393 µ g/mL
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	NRC completo medio concentrazione finale = 1X
E-caderina Coniglio anti-umano, ratto, policlonale	Thermo Fisher Scientific	PA5-32178	diluizione 1:400
Eclipse TE300 microscopio invertito	Imaging Nikon
Etanolammina	Sigma-Aldrich	E9508	NRC completo medio finale concentrazione = 0,32 mM
Siero fetale di vitello	Thermo Fisher Scientific	10270-106	NRC completo medio concentrazione finale = diluizione 5:100
Fluoroshield con DAPI (Mezzo di montaggio)	Sigma-Aldrich	F6057
Formaldeide 16% (P/V)	Thermo Fisher Scientific	28906	4% (P/V)
Siero di capra	Thermo Fisher Scientific	16210-064	1:10 diluizione
Hamamatsu fotocamera (Fotocamera digitale C11440 ORCA - flash 4.OLT)	Hamamatsu		imaging
Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	B1155	5 &; g/mL concentrazione finale
IgG (H+L) Capra altamente adsorbita anti-coniglio, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Fisher Scientific	A32733	Diluizione 1:500
ImageJ versione 2.0.0-rc-69/1.52n			Software di elaborazione delle immagini open source
Insulina-Transferrina-Selenio (100X)	Thermo Fisher Scientific	51300-044	NRC completo concentrazione finale del mezzo = diluizione
1:100L-Glutammina (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030-024	NRC concentrazione finale completa del mezzo = diluizione 1:100
Matrigel GFR (concentrazione madre 9,7 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	356231	diluizione 4:10
NIS Elements versione software 4.50.00	Acquisizione e visualizzazione di immagini	Nikon
Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-035	NRC completo medio concentrazione finale = diluizione 1:100
Obiettivo Piano Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2)	Nikon
Prolong Gold Antifade Reagente	Thermo Fisher Scientific	P36931
Ioduro di propidio (PI)	Sigma-Aldrich	P4170	20 &; g/mL concentrazione finale
Rodamina Falloidina	Thermo Fisher Scientific	R415	16,2 nM
concentrazione finale Kit Sir-Actin / Verapamil	Spirochrome	SC001	10 &; M concentrazione finale
Inibitore della tripsina di soia	Thermo Fisher Scientific	17075-029	NRC completo medio concentrazione finale = 50 µ g/mL
Filtro cellulare sterile 40 &; micro; m (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	22363547
Pipette sterili 10 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	1367811E
Pipette sterili 5 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Provette sterili 1,5 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific 11926955
Provette sterili 15 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	7200886
Provette sterili 50 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	553913
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389	Diluizione 5:100
Pallone trattato per coltura tissutale 25cm2 (Falcon)	Thermo Fisher Scientific 353108
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	5:1000 diluizione
Tripsina-EDTA (0,05%) rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific	25300-054	1X
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	5:10000 diluizione
Vitamina (100X)	Thermo Fisher Scientific	11120-037	NRC completo concentrazione finale media = diluizione 1:100
μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi	Clinisciences	80826