Metodi modificati per il caricamento di piastre di estrazione del DNA ad alta velocità effettiva riducono il potenziale di contaminazione

Summary

Gli attuali metodi per il caricamento di piastre di 96 well per le estrazioni di DNA possono essere soggetti a contaminazione. Dettagliamo un nuovo metodo per caricare piastre a 96 pozzi che riduce il rischio di contaminazione incrociata tra i pozzetti. Il nostro metodo aiuterà altri ricercatori a capitalizzare l'efficienza delle tecniche di estrazione del DNA ad alto rendimento e a ridurre al minimo il rischio di contaminazione.

Abstract

Tecniche di sequenziamento del DNA ad alto rendimento hanno contribuito notevolmente a far progredire la nostra comprensione delle relazioni tra le comunità microbiche, le caratteristiche dell'ospite e le funzioni più ampie dell'ecosistema. Con questo rapido aumento di ampiezza e profondità delle capacità di sequenziamento sono venuti metodi per estrarre, amplificare, analizzare e interpretare il DNA ambientale con successo con la massima efficienza. Purtroppo, l'esecuzione rapida di estrazioni di DNA può costare il rischio di contaminazione tra i campioni. In particolare, le estrazioni ad alta velocità che si basano su campioni contenuti in una piastra di 96 po 'offrono un metodo relativamente veloce, rispetto alle estrazioni a tubo singolo, ma aumentano anche le opportunità di contaminazione incrociata ben bene. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata tra i campioni, pur mantenendo i benefici delle tecniche di estrazione ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per caricare campioni ambientali in piastre a 96 poteggiamenti. Abbiamo usato pellicole di tenuta PCR forabili per coprire ogni piastra durante il caricamento dei campioni e abbiamo aggiunto campioni prima ai tubi PCR prima di spostarli in pozzi; insieme, queste pratiche riducono il rischio di deriva del campione e di doppio carico involontario di pozzi. Il metodo descritto in questo documento fornisce ai ricercatori un approccio per massimizzare le tecniche di estrazione ad alto rendimento disponibili, riducendo al contempo il rischio di contaminazione incrociata inerente alle piastre a 96 pozze. Forniamo una descrizione dettagliata passo dopo passo di come passare dalla raccolta dei campioni all'estrazione del DNA, riducendo al minimo il rischio di contaminazione incrociata indesiderata.

Introduction

I recenti progressi nel sequenziamento ad alto rendimento delle comunità microbiche stanno fornendo una profondità di sequenziamento senza precedenti e, di conseguenza, uno sguardo senza precedenti sul funzionamento e la diversità del microbioma^{terrestre 1}. Con l'aumentare della capacità di multiplex sempre più campioni su una singola corsia di sequenziamento, l'estrazione del DNA a tubo singolo potrebbe diventare un passo limitante nella generazione di dati ecologici. Tuttavia, i nuovi metodi nelle estrazioni di DNA ad alto rendimento promettono di elaborare grandi quantità di campioni ambientali con una maggiore efficienza di quanto sia stato....

Protocol

1. Panca di laboratorio e preparazione dell'utensile per il caricamento di una piastra da 96

1. Panca chiara con 70% di etanolo. Pulire e lasciare asciugare l'aria prima di spruzzare panca con 10% di candeggina. Pulire la panca asciutta.
2. Sterilizzare micro-scoopula, spatola e forbici chirurgiche (curve) immergendo nel 95% l'etanolo e quindi esporre a una fiamma. Immergere ciascuno in candeggina 10% e lasciare asciugare l'aria prima dell'uso.
   NOTA: gli utensili devono essere sterilizzati tra ogni campione.

2. Sotto-campionamento e preparazione del campione

1. Sterilizzare i guanti usando l'etanolo prima del s....

Results

Questo nuovo metodo è stato utilizzato con successo per caricare lastre di estrazione del DNA di 96-well. Il confronto dei metodi di caricamento delle placche ha mostrato il nostro metodo per avere la più bassa concentrazione di DNA nei pozzi vuoti. La concentrazione del DNA nei pozzi vuoti era significativamente inferiore al metodo proposto il mio McPherson et al.⁹ (p < 0.05), anche se le concentrazioni di DNA nel nostro metodo non erano statisticamente diverse dal metodo di default Qiagen (

Discussion

Questo metodo riduce le opportunità di contaminazione incrociata ben elevata durante il caricamento di piastre di estrazione del campione ad alta velocità di produzione e offre un mezzo più controllato per caricare piastre a 96 pori oltre le strategie di caricamento delle piastre^{esistenti 9,10}. La contaminazione tra pozzi può essere più pervasiva nelle estrazioni di lastre di 96 pozzi rispetto alle estrazioni a tubo singolo, soprattutto quando^au.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
provette da centrifuga da 2 mL	Fisherbrand	05-408-129
200 µ L provette per micro-PCR	Thermo Scientific	AB 2000
Kit di estrazione del DNA PowerSoil a 96 pozzetti	Qiagen	12955-4	Abbiamo utilizzato un kit per l'estrazione del suolo, ma qualsiasi kit in formato a 96 pozzetti avrebbe funzionato.
Blocco di ghiaccio per provette da centrifuga da 2 mL	Qualsiasi	Qualsiasi	blocco di ghiaccio realizzato per provette da 2 mL funzionerà
Blocco di ghiaccio per 200 µ L provette micro-PCR	Any	Any Any	ice block made for 200 µ I tubi a L funzioneranno
Micro scoopula	Qualsiasi	Qualsiasi Pellicola
sigillante perforabile pretagliata	Excel Scientific	XPS25
Spatola	Qualsiasi	Qualsiasi
Forbici chirurgiche	Qualsiasi	Qualsiasi