Uso di neuroni ippocampali coltivati primari per studiare l'assemblaggio dei segmenti iniziali di Axon

Sommario

Qui, abbiamo descritto un protocollo per studiare quantitativamente l'assemblaggio e la struttura dei segmenti iniziali di axon (AIS) dei neuroni ippocampali che mancano di AIS pre-assemblato a causa dell'assenza di un anchirina-G gigante.

Abstract

I segmenti iniziali dell'assone neuronale (AIS) sono siti di iniziazione di potenziali d'azione e sono stati ampiamente studiati per la loro struttura molecolare, assemblaggio e plasticità dipendente dall'attività. L'anchirina gigante-G, il principale organizzatore dell'AIS, si associa direttamente ai canali del sodio gated al sodio (VSVG) e del potassio (KCNQ2/3), nonché alla neurofascina da 186 kDa, una molecola di adesione cellulare L1CAM. L'anchirina gigante-G si lega e recluta anche molecole di AIS citoplasmatiche tra cui beta-4-spectrin, e le proteine leganti i microtubuli, EB1/EB3 e Ndel1. L'anchirina gigante-G è sufficiente per salvare la formazione di AIS in neuroni carenti di anchirina-G. L'anchirina-G include anche un isoforma più piccolo da 190 kDa situato alle spine dendritiche invece dell'AIS, che non è in grado di mirare all'AIS o di salvare l'AIS in neuroni carenti di anchirina-G. Qui, abbiamo descritto un protocollo che utilizza neuroni ippocampali coltivati da topi ANK3-E22/23-flox, che, se trasfettato con Cre-BFP mostrano la perdita di tutta l'isoforma di anchirina-G e compromettono la formazione di AIS. Combinato un sistema di co-coltura Banker glia/neurone modificato, abbiamo sviluppato un metodo per trasfetto i neuroni nulli anchirina-G con un plasmide anchirina-G-GFP da 480 kDa, che è sufficiente per salvare la formazione di AIS. Utilizziamo inoltre un metodo di quantificazione, sviluppato da Salzer e colleghi per affrontare la variazione della distanza AIS dai corpi cellulari neuronali che si verifica nelle colture neuronali ippocampali. Questo protocollo consente studi quantitativi sull'assemblaggio de novo e sul comportamento dinamico dell'AIS.

Introduzione

Il segmento iniziale dell'assone si trova all'assone prossimale nella maggior parte dei neuroni vertebrati. Funzionalmente, AIS è il luogo in cui vengono avviati potenziali d'azione a causa dell'alta densità dei canali del sodio gated di tensione in questa regione. L'AIS di alcuni neuroni eccitatori è anche preso di mira da internauri inibitori formando sinapsi GABAergiche^1,2,3. Pertanto, AIS è un sito critico per integrare la segnalazione cellulare e modulare l'eccitabilità dei neuroni. AIS è normalmente lungo 20-60 μm e si trova entro 20 μm dal corpo cellulare. La lunghezza....

Protocollo

NOTA: Questo metodo di coltura dei neuroni ippocampali dai topi ANK3-E22/23^f/f postnatali è adattato dal sistema di co-coltura glia/neurone di Gary Banker. Pertanto, è fondamentale eseguire tutti i passaggi dopo la dissezione in una cappa pulita utilizzando strumenti sterilizzati. Questo protocollo richiede fino a 1 mese. Il flusso di lavoro viene visualizzato nella figura 3. Il protocollo segue le linee guida sugli animali della Duke University.

1. Preparazione di coverlips e piatti di placcatura neuronale

1. Almeno una settimana prima del giorno di coltura, caricare le coperture sul....

Risultati

Una serie completa di esperimenti dovrebbe includere la trasfezione solo Cre-BFP come controllo negativo, Cre-BFP più 480 kDa di co-trasfezione anchirina-G come controllo positivo e una condizione non trasfettata come controllo della tecnica. Nel controllo solo Cre-BFP, i neuroni trasfetti mancano dell'accumulo di marcatori AIS, tra cui anchirina-G (ankG), beta4-spectrina (β4), neurofascina (Nf) e canali di sodio gated di tensione (VSVG)(Figura 4A)¹⁶. Al contrario, i .......

Discussione

L'assemblaggio dell'AIS è organizzato da 480 kDa ankyrin-G. Tuttavia, l'anchirina-G ha isoforme più corte che possono colpire l'AIS dei neuroni di tipo selvatico, il che può portare a difficoltà nell'interpretazione delle analisi struttura-funzione dell'assemblaggio AIS. Qui presentiamo un metodo che utilizza neuroni di topi ANK3-E22/23-flox che consente lo studio dell'assemblaggio de novo dell'AIS. Transfettando con Cre-BFP a 3 div, eliminiamo tutte le isoforme endogene di anchirina-G. Potremmo anche c.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10xHBSS	Thermo Fisher Scientific	14065-056
Vetro di copertura da 18 mm (1,5D)	Fisher Scientific	12-545-84-1D
190kDa anchirina-G-GFP	Addgene	#31059
2,5% Tripsina senza rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific	14065-056
480kDa anchirina-G-GFP	realizzato in laboratorio	Fornire su richiesta
ANK3-E22/23f/f mouse	JAX	Codice 029797	B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
Integratore B27 senza siero	Thermo Fisher Scientific	A3582801
Acido borico	Sigma-Aldrich	B6768
Filtro cellulare con maglia da 70 mm	BD Biosciences	352350
Rack per colorazione vetrino in ceramica	Thomas Scientific	8542E40
Cre-BFP	Addgene	#128174
D-Glucosio	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995073
Integratore GlutaMAX-I	Thermo Fisher Scientific	A1286001
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668030
MEM con Earle' sali e L-glutammina	Thermo Fisher Scientific	11095-080
Terreno neurobasale	Thermo Fisher Scientific	21103-049
Acido nitrico 70%	Sigma-Aldrich	225711
Opti-MEM I Siero ridotto Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillina-streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122
Poli-L-lisina cloridrato	Sigma-Aldrich	26124-78-7
Idrossido di potassio	Sigma-Aldrich	1310-58-3