Metilazione specifica Multiplex Droplet PCR utilizzando Polymer Droplet Generator Device per la diagnostica ematologica

Summary

Marcatori epigenetici sono utilizzati per sottotipi di globuli bianchi (WBC) attraverso la quantificazione dei modelli di metilazione del DNA. Questo protocollo presenta un metodo di reazione a catena di polimerasi a goccia multiplex (mdPCR) utilizzando un dispositivo microfluidometro termoplastico (TPE) per la generazione di droplet che consente una quantificazione mirata precisa e multiplex specifica della metilazione dei conteggi differenziali WBC.

Abstract

Viene descritto un flusso di lavoro PCR (mdPCR) a goccia multiplexed e un protocollo dettagliato per determinare il numero differenziale dei globuli bianchi a base epigenetica (WBC), insieme a un dispositivo di generazione di goccioline microfluidiche di elastimero termoplastico (TPE). Marcatori epigenetici sono utilizzati per la sottotipazione WBC che è di importante valore prognostico in diverse malattie. Ciò si ottiene attraverso la quantificazione dei modelli di metilazione del DNA di specifiche regioni ricche di CG nel genoma (CpG loci). In questo articolo, il DNA trattato con bisulfite da cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) è incapsulato in goccioline con reagenti mdPCR, tra cui primer e sonde fluorescenti idrolisi specifiche per i loci CpG che sono correlati alle sottopposizioni WBC. L'approccio multiplex consente l'interrogatorio di molti loci CpG senza la necessità di reazioni mdPCR separate, consentendo una determinazione parametrica più accurata delle sottoppole WBC utilizzando l'analisi epigenetica dei siti di metilazione. Questa quantificazione precisa può essere estesa a diverse applicazioni ed evidenzia i benefici per la diagnosi clinica e la successiva prognosi.

Introduction

L'analisi della composizione dei globuli bianchi (WBC) è tra i test di laboratorio più richiesti nella diagnostica ematologica. Il conteggio differenziale dei leucoc primi è un indicatore per uno spettro di malattie tra cui infezione, infiammazione, anemia e leucemia, ed è sotto indagine come biomarcatore prognostico precoce per diverse altre condizioni. Il Gold Standard nella sottotipizzazione WBC comporta l'immunostaining e/o la citometria di flusso che richiedono anticorpi fluorescenti costosi e soggetti a instabilità e sono spesso fortemente dipendenti dalla competenza dell'operatore nella preparazione del campione. Inoltre, questo metodo è applicabile solo ai cam....

Protocol

Tutti gli esperimenti condotti in questo studio che hanno coinvolto campioni umani sono stati approvati dal Comitato Etico del NRC e sono stati fatti secondo le politiche del NRC che disciplinano i soggetti umani che seguono le linee guida di ricerca applicabili e sono conformi alle leggi del Québec, Canada.

1. Preparazione cellulare

1. Scongelare immediatamente le cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBFC) congelate mettendo il criovial in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 5 minuti.
2. Invertire il criovial due volte per risundere delicatamente le cellule e utilizzando una pipetta da 1 mL trasferire la s....

Results

Il dispositivo generatore di goccioline microfluidiche basato su TPE è stato fabbricato utilizzando il protocollo descritto, come illustrato nella Figura 1. Una maschera di trasparenza è stata utilizzata nella fotolithografia per ottenere il maestro del silicio (Si). La litiografia morbida è stata eseguita per ottenere una replica PDMS inversa del maestro Si che è stata poi utilizzata per fabbricare lo stampo epossico. Il precursore dell'epossia è stato versato sul PDMS e curato per incrocia.......

Discussion

Il protocollo e i metodi sperimentali presentati consentono di mdPCR interno utilizzando un generatore di goccioline TPE fabbricato, un ciclo termico e un microscopio a fluorescenza. Il dispositivo fabbricato utilizzando il legame morbido da TPE a TPE offre proprietà di superficie idrofobiche uniformi su tutte le pareti del canale, in modo che il dispositivo finale non richieda alcun trattamento superficiale per un uso successivo come generatore di goccioline. Questo materiale è stato regolarmente impiegato in piattaform.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201	Provetta
RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroSurfactant	Fluoro-surfactant
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, Regno Unito		Telecamera
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		Utilizzato per l'analisi delle
Nikon, Giappone			10x
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Fisher, Canada
Vitrocom, NJ, USA	5015 e 5010	Tubo capillare in borosilicato
		Tubo
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Microscopio
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä rding, Austria
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Svizzera		SU-8 fotoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Germania
Immagine J		Utilizzato per valutare il diametro
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, USA		Lampada
Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC	DE1010
Hexpol TPE, & Aring; må l, Svezia		Elastomero termoplastico (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Giappone		Utilizzato per l'acquisizione di
3M, St Paul, MN		Olio
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Colorante fluorescente blu per cellule vive (DAPI)
IDEX Salute & Scienza, Oak Harbor, WA	P-881		in PEEK
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, USA	ARV 310
Ihc world, Maryland, USA	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Germania
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Mississauga, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NY		Microscopio
Nikon, Giappone
Loctite	AA 352