Indagini dettagliate sugli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria sono fondamentali per progettare efficaci strategie di blocco della trasmissione. Questo protocollo dimostra come coltura efficacemente gametociti infettivi e quindi nutrire questi gametociti alle zanzare per generare stadi di zanzara di P. falciparum.
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Articolo metodologico
Plasmodium falciparum Coltura di gametociti e infezione da zanzare attraverso l'alimentazione artificiale della membrana
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malaria rimane uno dei più importanti problemi di salute pubblica, causando morbilità e mortalità significative. La malaria è una malattia trasmessa dalle zanzare trasmessa attraverso un morso infettivo dalla zanzara femmina Anopheles. Il controllo della malaria alla fine si baserà su una moltitudine di approcci, che includono modi per bloccare la trasmissione da, attraverso e dalle zanzare. Per studiare in laboratorio gli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria, abbiamo ottimizzato un protocollo per la coltura di gametociti di Plasmodium falciparum altamente infettivi, uno stadio parassitario necessario per la trasmissione dall'ospite umano al vettore della zanzara. I gametociti di P. falciparum maturano attraverso cinque fasi morfologicamente distinte, che richiedono circa 1-2 settimane. La coltura dei gametociti descritta in questo protocollo viene completata in 15 giorni e sono infettive per le zanzare dai giorni 15-18. Questi protocolli sono stati sviluppati per mantenere un ciclo continuo di infezione dei gametociti competenti e per mantenere l'apporto ininterrotto degli stadi di zanzara del parassita. Qui, descriviamo la metodologia della coltura dei gametociti e come infettare le zanzare con questi parassiti usando alimentatori a membrana di vetro.
Introduzione
La malaria è causata dai parassiti Plasmodium e viene trasmessa ai loro ospiti vertebrati attraverso il morso infettivo delle zanzare Anopheles femminili. Secondo il rapporto 2019 dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), ci sono stati circa 405.000 decessi, su un totale di 228 milioni di casi di malaria1. La maggior parte dei decessi correlati alla malaria sono stati concentrati nella regione africana, specialmente tra i bambini sotto i cinque anni di età. Mentre il tasso di incidenza complessivo della malaria è diminuito a livello globale dal 2010, negli ultimi anni il declino si è stabilizzato e sono urgentemente nec....
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Protocollo
Le raccolte di sangue descritte di seguito sono state approvate dall'Institutional Review Board della Johns Hopkins University. P. falciparum viene coltivato in globuli rossi freschi in condizioni sterili in un impianto di livello di biosicurezza 2 (BSL2) e si usa cautela per maneggiare materiali biologici. Dopo ogni passaggio che coinvolge sangue o prodotti sanguigni, ogni stoviglie o bicchieri viene risciacquato con candeggina al 10% all'interno del cappuccio prima del corretto smaltimento.
1. Reagenti e preparazione
- È stato utilizzato l'isolato di parassiti P. falciparum NF54 (vedi Tabella dei material....
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Risultati
Qui presentiamo i risultati di una serie di alimentazioni a membrana utilizzando colture di gametociti P. falciparum NF54 generate utilizzando il protocollo sopra (vedi (Figura 5). La coltura dei gametociti è stata iniziata con circa lo 0,5% di coltura asessuata a stadio misto il giorno 0, che è cresciuta fino a un picco di parassitemia di circa il 15% entro il giorno 4 e il giorno 5. Come mostrato nella Figura 5A a questa alta parassitemia, i parassiti.......
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Discussione
I metodi qui descritti sono stati utilizzati con successo presso il Johns Hopkins Malaria Research Institute per più di 10 anni15,16,17,18,19,20,21,22. I gametociti prodotti utilizzando questo protocollo sono stati utilizzati per saggi gametocitocidi ad alt.......
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Dichiarazioni
Gli Autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Bloomberg Philanthropies per il sostegno finanziario al Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Questo lavoro non sarebbe stato possibile senza l'esperienza fornita dalle strutture di base per insetti e parassitologia JHMRI.
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Materiali
Plasmodium falciparum
10%contatore cellulare Bagno d'acqua circolante pinza a punta fine Fisherbrand 12-000-122 Essiccatore in vetro Sigma GS1L Essiccatore in vetro Alimentatore a membrana in vetro del sangue interstatale N-acetilglucosamina Parafilm PBS Thermo Scientific 249964 per pipette NF54 bagno di incubazione della coltura
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di zucchero | |||
| Pipetta sierologica | Falcon | 357551 | |
| Tubo conico da 15 ml | Falcon | 352096 | |
| Pipetta sierologica da 1 ml | Falcon | 357521 | |
| Pipetta sierologica da 25 ml | Falcon | 357535 | |
| 37 gradi C Incubatore | |||
| 50 ml tubo conico | Falcon | 352070 | |
| pipetta sierologica da 5 ml | Falcon | 357543 | |
| piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti | Falcon | 353046 | |
| 70% etanolo | |||
| Pipetta in vetro da 9" | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, nucleo dell'insetto | Usiamo A. stephensi o A. gambiae (chiglia) | |
| Chemglass Life Sciences | CG183570 | ||
| Vetrini | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Sangue umano O+ | JHU | Lavare i globuli rossi tre volte con RPMI e conservare in frigorifero al 50% di ematocrito | |
| Siero umano O+ | Banca | Pool di almeno 6 unità di siero da donatori diversi e congelare le aliquote a -20& gradi; C. | |
| Ipoxantina | Sigma | H9337 | Produce 500 volte lo stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Preparare una soluzione madre all'1% in PBS che può essere diluita allo 0,1% quando necessario |
| Microscopio per micropipette | |||
| Olympus | Qualsiasi microscopio con obiettivo 10x, 40x e 100x funzionerà. | ||
| Coppe per zanzare Coppe | Neptune | ||
| Sigma | A3286 | Opzionale e necessario solo quando sono richiesti gametociti puri. | |
| Rete | Assicurarsi che possa contenere zanzare e consentire l'alimentazione del sangue | ||
| Piastra di Petri | |||
| Punte | |||
| Pipetman | |||
| BEI Resources | MRA-1000 | Congelare un gran numero di colture di passaggio precoce per assicurarsi di avere una fornitura costante | |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Il terreno contiene glutammina e HEPES |
| Scaldavetrini | |||
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S6297 | Opzionale per i terreni, aggiungere solo quando si utilizza la miscela di gas malaria durante il |
| d'acqua | |||
| Acido Xanturenico | Sigma | D120804 | Per terreni di flagellazione |
Riferimenti
- World Health Organization. World Malaria Report. World Health Organization. , (2018).
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E.
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Ristampe e permessi
