Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine

Sommario

Questo protocollo presenta un approccio basato su qRT-PCR per determinare il numero di copia genica della nucleoproteina del virus della rabbia (N) all'interno di varie strutture anatomiche cerebrali bovine utilizzando la trascrizione in vitro.

Abstract

La rabbia paralitica bovina (BPR) è una forma di encefalite virale di notevole importanza economica in tutta l'America Latina, dove presenta un grave rischio zoonotico. Qui, il nostro obiettivo era quello di utilizzare un protocollo di laboratorio per determinare il numero relativo di copie del genoma del virus della rabbia (RABV) in diverse strutture anatomiche del cervello bovino utilizzando la reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale (qRT-PCR). qRT-PCR quantifica il numero specifico di copie geniche presenti in un campione basato sulla fluorescenza emessa dopo l'amplificazione che è direttamente proporzionale alla quantità di acido nucleico bersaglio presente nel campione. Questo metodo è vantaggioso per la sua breve durata, il ridotto rischio di contaminazione e il potenziale di rilevare gli acidi nucleici virali in campioni diversi più facilmente rispetto ad altre tecniche. Il cervello di sei animali rabbiosi era diviso in sei strutture anatomiche, vale a dire il corno di Ammon, il cervelletto, la corteccia, il midollo, il pons e il talamo. Tutti i cervelli sono stati identificati come positivi per gli antigeni RABV sulla base di un test di immunofluorescenza diretta. Sono state valutate anche le stesse strutture anatomiche provenienti dal cervello di quattro bovini rabv-negativi. L'RNA è stato estratto da ogni struttura e utilizzato per qRT-PCR. È stato eseguito un test per determinare il numero di copie dei geni RABV utilizzando un gene nucleoproteina trascritto in vitro. La curva standard utilizzata per quantificare l'RNA virale presentava un'efficienza del 100% e una linearità dello 0,99. L'analisi ha rivelato che la corteccia, il midollo e il talamo erano le porzioni ideali del SNC da utilizzare nel rilevamento RABV, in base all'osservazione che queste strutture possedevano i più alti livelli di RABV. La specificità del test era del 100%. Tutti i campioni erano positivi, non sono stati rilevati falsi positivi. Questo metodo può essere utilizzato per rilevare rabv in campioni che contengono bassi livelli di RABV durante la diagnosi di BPR.

Introduzione

La rabbia può essere confermata ante mortem e post mortem con varie tecniche che consentono il rilevamento di acidi nucleici virali nel cervello, nella pelle, nelle urine o nella saliva¹. L'individuazione del gene della nucleoproteina del virus della rabbia(N)viene utilizzata principalmente per la diagnosi della rabbia mediante test molecolari. Questo gene è anche usato per il genotipizzazione virale. La rabbia può essere diagnosticata negli animali utilizzando qualsiasi porzione del cervello interessato; tuttavia, per escludere la possibilità di rabbia, i tessuti provenienti da almeno due regioni del cervello devono ....

Protocollo

Questo studio è stato approvato e condotto in stretta conformità con le raccomandazioni per l'uso di animali fornite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. Campioni

1. Utilizzare diverse aree del cervello sezionate da 6 diversi cervelli bovini positivi alla rabbia per l'analisi RT-PCR.

2. Anticorpi fluorescenti diretti (DLA) per confermare la rabbia

NOTA: Il rilevamento dell'antigene della rabbia da parte del DFA è un metodo qualitativo per determinare la p....

Risultati

I risultati del DFA hanno mostrato rispettivamente 100%, 100%, 83,3%, 66% e positività del 50% per rabv nella corteccia, talamo, midollo, pons e corno. Questi risultati hanno confermato i risultati precedenti, e almeno tre delle strutture sezionate da ogni cervello erano positive per rabv. Una colorazione DAF positiva rappresentativa è mostrata nella figura 1.

La figura 2 mostra l'amplificazione di un frammento del gene RABV N (fase 5.......

Discussione

Studi precedenti hanno dimostrato che il DFA può rilevare rabv solo entro sette giorni dalla conservazione del campione a temperatura ambiente (21 °C)¹⁴. Al contrario, questo lavoro ha dimostrato che la sensibilità di RT-PCR inizia a diminuire dopo che i campioni sono stati esposti alla temperatura ambiente per 12 giorni. Pertanto, il genoma RABV può essere rilevato da qRT-PCR in campioni esposti a temperatura ambiente per un massimo di 23 giorni. Ciò dimostra che la sensibilità di qRT-PCR è relat.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloroformio	SIGMA	C7559	Facilita il recupero della fase acquosa delle PCR che sono state ricoperte di olio minerale.
DNA pulito & Concentratore-500	Zimo	D4031	Il DNA Pulito & Concentrator-500 (DCC-500) è progettato per la purificazione e la concentrazione rapida e di grande formato fino a 500 &5; g di DNA di alta qualità da campioni, comprese le digestioni di endonucleasi di restrizione su larga scala e preparazioni di DNA impuro.
Etanolo	Amresco	193-500	Purificazione degli acidi nucleici
Kit del sistema PCR ad alta fedeltà FastStart, dNTPack	Roche	3553400001	Enzima ad alta fedeltà per l'amplificazione dei prodotti PCR evitando cambiamenti casuali di basi
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analizza le proteine più grandi e i gel di DNA
GelRed	Biotium	41003	Una nuova generazione di coloranti in gel di acido nucleico, possiedono nuove caratteristiche chimiche progettate per ridurre al minimo la possibilità per i coloranti di interagire con gli acidi nucleici nelle cellule viventi.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	La temperatura può essere monitorata e controllata dall'algoritmo dello strumento, dalla sonda all'interno del campione o dalle modalità di blocco del campione
iTaq Universal Probes Kit One-Step BioRad		1725141	Miscela di reazione per eseguire reazioni PCR in tempo reale utilizzando sonde di ibridazione di tipo TaqMan
Alcool isopropilico	Amresco	0918-500	Precipitazione degli acidi nucleici
Kit di estrazione del gel QIAquick	I kit QIAquick Qiagen	28706	contengono un gruppo di membrana di silice per il legame del DNA in tampone ad alto contenuto di sale e l'eluizione con tampone a basso contenuto di sale o acqua. La procedura di purificazione rimuove primer, nucleotidi, enzimi, olio minerale, sali, agarosio, bromuro di etidio e altre impurità dai campioni di DNA
Trascrittasi inversa M-MLV	Invitrogen	28025-021	La trascrittasi inversa del virus della leucemia murina Moloney (M-MLV RT) utilizza RNA o DNA a filamento singolo in presenza di un primer per sintetizzare un filamento di DNA complementare .
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Spettrofotometro per microvolumi
Primer oligo(dT)18	Invitrogen	SO132	Il primer oligo (dT)18 è un oligonucleotide sintetico a filamento singolo 18-mer con estremità 5' e 3'-ossidrile.
Kit per sistemi di produzione di RNA su larga scala RiboMAX SP6 e T7	Promega	P1300	Le reazioni di trascrizione in vitro vengono utilizzate per sintetizzare quantità di microgrammi di sonde di RNA da modelli di DNA ricombinante. La maggior parte delle reazioni di trascrizione progettate per generare sonde di RNA sono ottimizzate per massimizzare l'incorporazione di ribonucleotidi radiomarcati piuttosto che per produrre grandi quantità di RNA
Taq DNA polimerasi	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA polimerasi è una DNA polimerasi altamente termostabile del batterio termofilo Thermus aquaticus. L'enzima catalizza il 5' e 3' sintesi di DNA
Reagente TRIzol	Invitrogen	15596026	Il reagente TRIzol è un reagente completo, pronto all'uso, progettato per l'isolamento di RNA totale di alta qualità o per l'isolamento simultaneo di RNA, DNA e proteine da una varietà di campioni biologici.