Questo protocollo mostra come impiegare la microscopia super-risoluzione per studiare la co-localizzazione delle proteine nelle colture neuronali primarie.
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Articolo metodologico
Imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le sinapsi sono gli elementi funzionali dei neuroni e i loro difetti o perdite sono alla base di diversi disturbi neurodegenerativi e neurologici. Gli studi di imaging sono ampiamente utilizzati per studiare la loro funzione e plasticità in condizioni fisiologiche e patologiche. A causa delle loro dimensioni e struttura, gli studi di localizzazione delle proteine richiedono tecniche di imaging ad alta risoluzione. In questo protocollo, descriviamo una procedura per studiare nei neuroni primari la co-localizzazione delle proteine bersaglio con marcatori sinaptici a un livello di super-risoluzione utilizzando la microscopia ad illuminazione strutturata (SIM). La SIM è una tecnica di illuminazione a luce modellata che raddoppia la risoluzione spaziale della microscopia a campo largo, raggiungendo un dettaglio di circa 100 nm. Il protocollo indica i controlli e le impostazioni necessari per robusti studi di co-localizzazione e una panoramica dei metodi statistici per analizzare correttamente i dati di imaging.
Introduzione
La comprensione e la visione della sinapsi è cambiata enormemente dalla sua prima descrizione da Foster e Sherrington nel 18971. Da allora, la nostra conoscenza della comunicazione neuronale e dei processi molecolari alla base è cresciuta esponenzialmente2. È diventato chiaro che le sinapsi possono essere pensate come un sistema a due compartimenti: un compartimento pre-sinaptico contenente vesciche per il rilascio di neurotrasmettitori e un compartimento post-sinaptico con recettori3. Questa visione semplicistica, negli ultimi vent'anni, si è evoluta in una complessa rete di proteine necessarie p....
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Protocollo
1. Culture primarie
- Coltura mouse ippocampo primario neuroni in coperture camerate (come Ibidi μ-Slide 8 Well o Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) che corrispondono al requisito obiettivo per #1.5 (0.17 mm) coprelo spessore.
- Coperture con rivestimento camerato con 100 lL di poli-L-lysine (100 g/mL).
- Il giorno successivo, lavare due volte i coperture con camera con salina sterile tamponata al fosfato (PBS).
- Per ottenere i neuroni primari del topo, isolare gli ippocampi da P1-P4cuccioli 23.
- Posizionare l'ippocampo sezionato in 10 mL di Dissection Media (Tabella 1) e lasciarli depo....
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Risultati
Vi presentiamo qui il flusso di lavoro standard per studiare la co-localizzazione delle proteine neuronali. Abbiamo prima calibrato il microscopio e successivamente abbiamo eseguito l'analisi SIM dei campioni. Per calibrare il sistema, abbiamo usato microsfere fluorescenti di diametro di 0,1 m. Dopo aver ottenuto immagini 3D-SIM super-risolte delle perline, i dati dell'immagine sottostanti vengono trasformati da Fourier per convertirli nuovamente in una rappresentazione di frequenza spaziale. Nella F.......
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Discussione
Chiarire la struttura e la composizione della sinapsi è fondamentale per comprendere i processi fisiologici e patologici che regolano la memoria e la cognizione. Mentre nello stato normale, le sinapsi sono gli elementi costitutivi della memoria, sono anche alla base di disturbi neurologici complessi come il morbo di Alzheimer32. Il protocollo qui descritto serve a studiare la co-localizzazione delle proteine neuronali con una tecnica di microscopia super-risoluzione chiamata SIM. Utilizzando un pa.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Edoardo Micotti per la critica costruttiva del manoscritto. Lo studio è stato sostenuto da BrightFocus A2019296F, di Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), di Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) e della Rete di Formazione Innovativa Marie skadorwska-Curie (JK).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di blu di tripano allo 0,4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µ m filtro | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Anticorpo scientifico | ||
| Anticorpo SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Anticorpo |
| B27 Integratore | Life Technologies | 17504044 | |
| Chimica Albumina sierica bovina | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered Coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher | Scientific-Antibody | |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres microsfere modificate con carbossilato, 0,1 μ m, giallo– fluorescente verde | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucosio Merck | Life Science | G8769 | Chimico |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chimico |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chimico |
| L-Cisteina | Merck Scienze della Vita | C6852-25G | Chimico |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Anticorpo |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | |
| Medium MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1.091.371.000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | |
| Medium N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon-Instrument | ||
| Papain | Merck Life Science& nbsp; | P-3125 | |
| Paraformaldeide | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Penna chimica |
| /Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Soluzione |
| salina tamponata con fosfato chimico | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lisina | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Anticorpo |
| Rotondo coprivetro | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Anticorpo |
| Sinaptofisina | Merck | S5768 | anticorpo |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Inibitore chimico |
| della tripsina | Merck Scienze della Vita | T9003-500MG | Chimico |
Riferimenti
- Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K.
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Ristampe e permessi
