Valutazione dell'espressione del complesso di istocompatibilità maggiore classe I sui neuroni ippocampali murini primari per citometria a flusso

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per coltivare i neuroni ippocampali primari dal cervello embrionale del topo. L'espressione del complesso di istocompatibilità principale di classe I sulla superficie extracellulare dei neuroni coltivati viene quindi valutata mediante analisi citometrica del flusso.

Abstract

L'aumento delle evidenze supporta l'ipotesi che le interazioni neuro-immunitarie impartino sulla funzione del sistema nervoso sia in condizioni omeostatiche che patologiche. Una funzione ben studiata del principale complesso di istocompatibilità classe I (MHCI) è la presentazione di peptidi derivati dalle cellule al sistema immunitario adattivo, in particolare in risposta alle infezioni. Più recentemente è stato dimostrato che l'espressione delle molecole di MHCI sui neuroni può modulare i cambiamenti dipendenti dall'attività nella connettività sinaptica durante il normale sviluppo e disturbi neurologici. L'importanza di queste funzioni per la salute del cervello supporta la necessità di un saggio sensibile che rilevi prontamente l'espressione MHCI sui neuroni. Qui descriviamo un metodo per la coltura primaria dei neuroni ippocampali murini e quindi la valutazione dell'espressione MHCI mediante analisi citometrica del flusso. L'ippocampo murino viene microdissecato dai cuccioli di topo prenatale al giorno 18 embrionale. Il tessuto viene dissociato in una singola sospensione cellulare utilizzando tecniche enzimatiche e meccaniche, quindi coltivate in un supporto privo di siero che limita la crescita delle cellule non neuronali. Dopo 7 giorni in vitro, l'espressione MHCI viene stimolata trattando le cellule coltivate farmacologicamente con interferone beta. Le molecole di MHCI sono etichettate in situ con un anticorpo marcato fluorescentmente, quindi le cellule vengono dissociate non enzimaticamente in una singola sospensione cellulare. Per confermare l'identità neuronale, le cellule sono fissate con paraformaldeide, permeabilizzate ed etichettate con un anticorpo taggato fluorescentmente che riconosce l'antigene nucleare neuronale NeuN. L'espressione MHCI viene quindi quantificata sui neuroni mediante analisi citometrica del flusso. Le colture neuronali possono essere facilmente manipolate da modifiche genetiche o interventi farmacologici per testare ipotesi specifiche. Con lievi modifiche, questi metodi possono essere utilizzati per coltura di altre popolazioni neuronali o per valutare l'espressione di altre proteine di interesse.

Introduction

Un tempo si pensava che il sistema nervoso centrale (SNC) fosse privo di sorveglianza immunitaria, indicato come "immune^{privilegiato 1".} Ora è chiaro che questo privilegio non equivale all'assoluta assenza di componenti immunitari, ma piuttosto a una regolazione specializzata che funzioni per limitare il danno associato all'immunopatologia¹. Infatti, la comunicazione tra il SNC e il sistema immunitario è una conversazione in corso necessaria per uno sviluppo cerebrale sano e la risposta alle^{infezioni 2,3}.

Le principali molecole di classe I (MHCI) complesse di istocompatibilità sono proteine transmembrana poligeniche e polimorfiche meglio conosciute per la loro funzione nel presentare peptidi antigenici alle cellule CD8⁺ T durante l'infezione⁴. I complessi MHCI classici consistono in una catena α transmembrana e una catena di luce extracellulare, chiamata β2-microglobulina. La α contiene una scanalatura polimorfica che lega un peptide antigenico per la presentazione⁵. La corretta espressione di MHCI sulla membrana extracellulare richiede un'azione coordinata di chaperoni molecolari al reticolo endoplasmatico per garantire una corretta piegatura della catena α e β2-microglobulina insieme al caricamento di un ligando peptidico ad alta affinità⁵. Solo una volta assemblati i complessi MHCI, vengono esportati dal reticolo endoplasmatico alla membrana plasmatica⁶. Al momento dell'innesto del recettore delle cellule T affini con il complesso MHCI caricato peptidico, le cellule CD8⁺ T mediano l'uccisione cellulare rilasciando granuli litici contenenti perforina e granzimi o inducendo apoptosi attraverso il legame del recettore Fas sulla membrana cellulare bersaglio⁷. Inoltre, le cellule CD8⁺ T producono citochine, come l'interferone gamma (IFNγ) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα), che può attivare meccanismi antivirali nelle cellule infette senza effetti citopatici^8,9. Per molti virus neurotropi, le cellule CD8⁺ T sono necessarie per cancellare l'infezione dal SNC^10,11,12.

In precedenza si pensava che i neuroni esprimessero MHCI solo in condizioni di danno, infezione virale o con stimolazione citochina in vitro. Recentemente, la ricerca ha identificato un ruolo per l'espressione neuronale di MHCI nel rimodellamento sinaptico e nella^{plasticità 13,14}. Sebbene i meccanismi precisi alla base della regolazione della sinapsi non siano ben compresi, i dati indicano che il livello di espressione MHCI è regolato dall'attività^{sinaptica 15,16}. Un'ipotesi ipotizza che i neuroni esprimano il recettore B (PirB) accoppiato come immunoglobulina, che lega l'MHCI trasnapticamente^13,17. Questa interazione avvia una cascata di segnalazione da parte di PirB che si oppone ai percorsi coinvolti nel rimodellamento sinaptico, rafforzando e stabilizzando così la connessione sinaptica^17,18,19. In assenza di attività neuronale, l'espressione MHCI^{è diminuita di 14}e la perdita di MHCI si traduce in eliminazione sinapsi difettosa e circuiti sinaptici disorganizzati^20,21.

Il saggio qui descritto, che è stato adattato da Chevalier et^al. Questo protocollo illustra le tecniche iniziali per microdissesecare il tessuto ippocampale dai cuccioli di topo embrionali. Vengono quindi dettagli i processi per la dissociazione enzimatica e meccanica del tessuto in un'unica sospensione cellulare e i metodi per mantenere le colture in vitro. Poiché non si dividono, una volta che sono in coltura, i neuroni devono essere placcati in un piatto e una densità adatti al loro endpoint sperimentale. Successivamente, delinea i passaggi per indurre l'espressione MHCI con interferone beta (IFNβ), l'immunoetichettatura per MHCI e il marcatore di nuclei neuronali NeuN e l'analisi delle cellule per citometria del flusso. Infine, descrive le procedure per valutare i dati della citometria del flusso per identificare i neuroni mhci-positivi e quantificare il livello dell'espressione MHCI. In questo protocollo sono anche annotate piccole regolazioni che possono essere fatte per coltura di neuroni corticali in aggiunta o al posto dei neuroni ippocampali. Questo protocollo può essere facilmente modificato per testare ipotesi specifiche utilizzando variazioni genetiche o trattamenti farmacologici.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite nel rispetto delle raccomandazioni contenute nella Guida alla cura e all'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute e secondo i Principi Guida Internazionali per la Ricerca Biomedica che coinvolge gli Animali. Il protocollo è stato approvato dall'Università della Carolina del Nord presso il Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #19-020).

1. Prepararsi alla cultura

NOTA: Queste procedure devono essere fatte in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza designato per la coltura tissutale. Cfr. tabella 1 per i supporti e le soluzioni.

1. Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione autoclave in sacchetti di sterilizzazione autosigillanti.
2. Preparare scorte di lavoro di poli-D-lisina per il trattamento di piatti di coltura a 12 porvili.
   1. Sciogliere la poli-D-lisina in 1x tampone di borato a una concentrazione di 100 μg/mL (10x concentrato). Conservare circa 1 mL di aliquote a -20 °C fino a quando necessario.
   2. Diluire la poli-D-lsina concentrata 10x in dPBS a 10 μg/mL (1x) e sterilizzare il filtro.
   3. Trattare piastre di coltura a 12 po porsi con 0,5 mL per pozzo di 1 poli-D-lisina a temperatura ambiente per almeno 1 h o durante la notte per l'uso il giorno successivo. Assicurarsi che il volume di poli-D-llysina sia sufficiente per coprire completamente il fondo dell'area di coltura.
   4. Appena prima dell'uso, rimuovere la poli-D-lisina dalla piastra di coltura, risciacquare 3 volte in acqua sterile e conservare in acqua sterile fino a quando non è pronto per placcare le cellule. Rimuovere tutte le tracce di liquido da un'aspirazione approfondita prima di placcare le cellule.
3. Preparare neuron growth media e tampone FACS. Filtrare sterilizzare e conservare a 4 °C fino all'uso. Neuron Growth Media può essere conservato per circa 2 wks; Il buffer FACS può essere mantenuto per circa 4 wks.

2. Sezionare l'ippocampo embrionale

NOTA: Questa procedura può essere eseguita sul banco in quanto richiede l'uso di un microscopio stereo per la rimozione di meningi e microdissezione dell'ippocampo. Aderire a una rigorosa tecnica aseptica per ridurre al minimo la potenziale contaminazione.

1. Eutanasia un topo femmina C57BL/6J incinta a tempo al giorno 18 embrionale in una camera di CO_2.
2. Spruzzare la pelle addominale e la pelliccia con il 70% di EtOH, quindi pizzicare la pelle con le forcelle tissutali e fare una piccola incisione con forbici chirurgiche. Incise il peritoneo per esporre i visceri e l'utero.
3. Afferrare l'utero con force standard, sollevare dalla cavità e tagliare la connessione al mesometrio con forbici fini. Trasferire l'utero con embrioni in un piatto sterile di coltura plastica da 100 mm posto sul ghiaccio.
4. Usando forbici fini e forcep fini, tagliare con cura l'utero e rimuovere le sacche embrionali per rilasciare embrioni. Trasferire gli embrioni in un nuovo piatto sterile da coltura plastica da 100 mm contenente dPBS posto sul ghiaccio.
5. Decapitare i cuccioli embrionali usando forbici fini e trasferire le teste al nuovo piatto di coltura plastica sterile da 100 mm contenente mezzo Hibernate-E posto sul ghiaccio.
6. Per rimuovere il cervello, tenere la testa con un paio di forcep fini in una mano. Usando le forcep dumont #7 curve, invece, inserisci la punta delle forcep alla base del cranio e pizzica l'osso e sovrasta la pelle muovendosi anteriormente lungo la linea mediana senza perforare il cervello.
7. L'uso di forcep curve separa la pelle e il cranio per esporre il cervello. Spazzare le forcep curve sotto il cervello dal bulbo olfattivo esposto al cervelletto per sollevare il cervello dal cranio. Trasferire il cervello in un nuovo piatto sterile da coltura plastica da 100 mm contenente mezzo Hibernate-E posto sul ghiaccio. Ripeti per ogni cervello.
   NOTA: Tutti i cervelli possono essere raccolti in un unico piatto di coltura a meno che non sia necessario essere separati per scopi specifici dell'esperimento.
8. Al microscopio a dissezione stereo, lavorando con un cervello alla volta e due paia di piumini dumont #5 sterili, pizzicare i bulbi olfattivi e tirare via le meningi. Una rimozione completa delle meningi è necessaria per evitare la contaminazione della coltura da parte di altre cellule e per consentire un'ulteriore dissezione.
9. Una volta rimosse correttamente le meningi, il lato superiore della corteccia si apre lateralmente, il che esporrà l'ippocampo. Usando le #5 Dumont, pizzicare l'ippocampo lontano dalla corteccia attaccata e trasferire con cura l'ippocampo isolato in un tubo conico sterile da 15 ml contenente 5 ml di mezzo ibernato-E sul ghiaccio.
10. Ripetere la dissezione per entrambi gli emisferi cerebrali per ogni cucciolo di topo embrionale e combinare tutti gli ippocampi in un unico tubo conico da 15 ml, a meno che non sia necessario separatamente per scopi specifici dell'esperimento.
    1. Per coltura dei neuroni corticali, la corteccia può essere separata dalla sottocorteccia ed elaborata in modo identico ai neuroni ippocampali.
       NOTA: A questo punto, il protocollo potrebbe essere messo in pausa. Conservare cervelli o ippocampi sezionati in hibernate-e medium integrati con B27 (2%) a 4 °C per un massimo di 1 mese, anche se un ritardo prolungato può compromettere il numero di cellule vitali.

3. Dissociare e coltivare i neuroni ippocampali

NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza designato per la coltura tissutale.

1. Preparare 0,5 mL di soluzione di dissociazione della papaina per embrione per la dissociazione ippocampale. Il volume della soluzione di dissociazione necessaria varierà a seconda del numero di cervelli embrionali sezionati.
   NOTA: Per la coltura corticale dei neuroni, preparare 1,0 mL di soluzione di papaina per embrione.
   1. Sciogliere 20 μL di sospensione di papaina per 1 mL del mezzo Hibernate E con vortice per circa 3 min.
   2. Dopo lo scioglimento della papaina, aggiungere 1 μL di DNasi I per 1 mL della soluzione. Non vortice la soluzione dopo la DNasi I è stato aggiunto in quanto questo può disattivare l'enzima.
2. Tubo conico centrifugato da 15 ml contenente tessuto ippocampale (fase 2.10) a 1.000 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e aggiungere la soluzione di papaina. Rimorsi il tessuto invertendo più volte. Incubare a 37 °C per 30 minuti, invertendo per rimorsi il tessuto ogni 10 minuti.
   1. Se si coltivano neuroni corticali, trasferire tutte le cortici in un nuovo piatto di coltura sterile da 100 mm, aspirare accuratamente i mezzi dalla piastra e il tessuto tritacanza con forbici sottili o lamette da barba. Aggiungere la soluzione di papaina al piatto di coltura e trasferire il tessuto corticale con soluzione di papaina in un tubo conico da 15 ml utilizzando una pipetta di trasferimento sterile. Incubare tessuti e soluzione enzimatica a 37 °C per 30 min, agitando ogni 10 minuti.
3. Durante l'incubazione di 30 minuti, preparare 3 pipette Pasteur in vetro lucidato dal fuoco: 1 completamente aperto, 1 mezzo aperto e 1 quarto aperto.
4. Dopo l'incubazione di 30 minuti, centrifugare il tubo conico da 15 ml contenente tessuti cerebrali digeriti a 125 x g per 10 minuti. Rimuovere la soluzione enzimatica e sostituirla con un volume uguale di mezzo fresco Ibernato E.
5. Utilizzando pipetta Pasteur completamente aperta, triturare il tessuto 10x. Lasciare depositare il tessuto per 2 minuti, quindi trasferire la sospensione cellulare supernatante in un tubo conico sterile da 50 ml. Aggiungere un volume uguale di mezzo Ibernato E al tessuto.
6. Utilizzando pipetta Pasteur semiapra, tessuto triturato 10x. Lasciare depositare il tessuto per 2 minuti, quindi trasferire la sospensione cellulare supernatante nello stesso tubo conico da 50 ml come nella fase precedente. Aggiungere un volume uguale di mezzo Ibernato E al tessuto.
7. Utilizzando pipetta Pasteur quarti aperta, tessuto triturato 10x. Lasciare che il tessuto si accontenti di 2 minuti, quindi trasferire nuovamente la sospensione cellulare supernatante allo stesso conico da 50 mL dei passaggi precedenti. Scartare qualsiasi tessuto rimanente che non si sia dissociato.
8. Centrifugare il tubo conico da 50 ml contenente il supernatante dalla sospensione cellulare a 125 x g per 5 min. Se non è già fatto, lavare piastre rivestite in poli-D-llysina con acqua sterile e rimuovere tutte le tracce di liquido per aspirazione approfondita durante la centrifugazione.
9. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 5 mL di Neuron Growth Media. Contare le cellule vive usando tripano blu ed emocitometro.
   1. Se si coltivano neuroni corticali, aggiungere almeno 10 mL di neuron growth media per cellule meno dense e conteggio più accurato.
10. Diluire le cellule con neuron growth media per una densità di placcatura finale di 5 x 10⁵ cellule vitali per ml e aggiungere 1 ml di sospensione cellulare diluita ad ogni pozzo di una piastra di 12 pozza. Mantenere i neuroni a 37 °C con il 5% di CO₂.
    NOTA: Tipicamente, gli ippocampi di 1 cervello di topo embrionale, cioè 2 ippocampi, producono circa 1 x 10^{6 cellule} vitali. Questo numero è fornito solo a scopo di pianificazione sperimentale e non deve essere considerato una sostituzione per il conteggio delle celle per ogni coltura.
11. Cambia i mezzi di crescita il giorno dopo la coltura rimuovendo metà del volume dei media da ogni pozzo, cioè 0,5 mL, e aggiungi un volume uguale di nuovi supporti sul lato del pozzo per evitare di interrompere le cellule coltivate. Completa i semi-supporti due volte alla settimana per la durata della cultura.

4. Valutazione dell'espressione MHCI per citometria del flusso

1. Preparare il trattamento diluire l'interferone beta (IFNβ) o un volume uguale di diluente nei media di crescita neuronali. Poiché il cambiamento dei media sarà un cambiamento di mezzo volume, preparare i mezzi di trattamento con IFNβ concentrato 2x. cioè, per trattare 3 pozzi di una piastra di 12 pozzali con 100 U/mL di IFNβ, preparare 1,5 mL con 200 U/mL IFNβ o e uguale volume di diluente IFNβ per i controlli trattati con supporti.
2. Rimuovere 0,5 mL da ogni pozzo di neuroni e aggiungere 0,5 mL di neuron growth media con o senza IFNβ ad ogni pozzo. Incubare in condizioni di crescita normale (37 °C, 5% CO₂) per 6-72 ore, a seconda delle condizioni sperimentali e dell'ottimizzazione del segnale.
3. Dopo il tempo di trattamento, rimuovere tutti i mezzi di coltura e lavare delicatamente una volta in mezzi neurobasali freddi privi di integratori (B27, L-glutammina, Pen-Strep).
4. Aggiungere 0,5 mL di mezzi neurobasali freddi non integrati contenenti 1 μg/mL di blocco Fc e 1 μg/mL di anticorpo fluorescente coniugato anti-MHCI per ogni pozzo. Incubare a 4 °C protetto dalla luce per 45 minuti.
5. Rimuovere i mezzi contenenti anticorpi e lavare con cura una volta in dPBS freddo. Aggiungere un tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi a temperatura ambiente di 0,5 mL ad ogni pozzo e agitare per spodedare le cellule. Guarda la dissociazione usando il microscopio a coltura tissutale invertita.
6. Una volta che le cellule sono staccate dal piatto di coltura, aggiungere 0,5 ml di tampone FACS a ogni pozzo, cellule triturate per disperdere i grumi e trasferire il volume totale di ogni pozzo a singoli tubi di microcentrifugo da 1,7 ml.
7. Centrifuga a 1.000 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante, rimescolare il pellet cellulare in 100 μL di tampone FACS e trasferire il volume totale di ciascun tubo in singoli pozzi di una piastra inferiore a U da 96 pozzoli.
8. Aggiungere 100 μL di reagente fissivo ad ogni pozzo. Triturare più volte per evitare che le cellule si aggloppino e incubano per 15 minuti a temperatura ambiente protette dalla luce.
9. Centrifuga a 500 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e resuspend in 200 μl di tampone FACS.
10. Centrifuga a 500 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e il resopend in 100 μL di reagente di permeabilizzazione contenente anticorpo anti-NeuN coniugato fluorescente (diluizione 1:100) ad ogni pozzo. Mescolare bene, quindi incubare a temperatura ambiente protetta dalla luce con dondolo per 20 minuti.
11. Dopo l'incubazione, centrifugare a 500 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e resuspend in 100 μL di tampone FACS. Ripetere 2x.
12. Dopo il lavaggio finale, resuspend cellule in 100 μL di paraformaldeide al 2% diluite nel tampone FACS. Mescolare bene per evitare che le cellule si aggloppino. Conservare a 4 °C protetti dalla luce fino a quando non sono pronti per la lettura su un citometro a flusso. Leggere i campioni il prima possibile, entro 1 settimana.

5. Quantificare e valutare i dati

1. Misurare i controlli di compensazione per ogni colorante fluorescente e correggere eventuali sovrapposizioni spettrali. I controlli di compensazione ideali includono neuroni coltivati che non sono contaminati, macchiati solo con anti-MHCI e macchiati solo di anti-NeuN.
2. Se possibile, registrare 100.000 eventi per ogni esempio (almeno 10.000) e salvarli come file FCS.
3. Per analizzare i dati, utilizzando un software di analisi appropriato, impostare cancelli sequenziali, come illustrato nella figura 1A-C da selezionare per i neuroni positivi alla NeuN.
   1. Plottare SSC-A (log) vs FSC-A (lineare). Disegnare un cancello sulla popolazione cellulare (P1) per eliminare i detriti cellulari dall'analisi.
   2. All'interno della popolazione cellulare P1, tracciare FSC-H (lineare) vs FSC-A (lineare). Disegna un cancello sulla popolazione di singole cellule.
   3. All'interno della popolazione a cella singola, tracciare SSC-A (log) vs NeuN (log). Disegna un cancello sulla popolazione neun-positiva usando celle macchiate non macchiate o solo MHCI come guida.
   4. Traccia un istogramma della fluorescenza MHCI con eventi cellulari normalizzati in modalità sull'asse y. Usando neuroni macchiati non macchiati o solo NeuN come guida, disegna un cancello orizzontale per quantificare la percentuale di neuroni positivi per mhci.
   5. Esportare la percentuale di cellule positive per mhci, così come l'intensità mediana di fluorescenza (IFM) per MHCI sulla popolazione neun-positiva per la valutazione statistica e il disegno grafico.

Results

Utilizzando la procedura qui presentata, il tessuto ippocampale è stato sezionato dai cuccioli di topo prenatale al giorno 18 embrionale. Il tessuto è stato dissociato in una singola sospensione cellulare utilizzando metodi enzimatici e meccanici, quindi coltivati in 12 piastre pozzate che sono state pretrattate con poli-D-lisina. Dopo 7 giorni in vitro, le cellule sono state trattate con 100 U/mL di IFNβ o mezzi solo per 72 h, il che ha stimolato l'espressione di MHCI. I neuroni sono stati macchiati in situ per MHCI prima di essere dissociati non enzimaticamente in una singola sospensione cellulare. I neuroni sono stati fissati e permeabili, quindi macchiati intracellularmente per il marcatore dei nuclei neuronali NeuN. I campioni sono stati valutati per citometria del flusso e i dati sono stati analizzati utilizzando il software associato. I neuroni sono stati identificati attraverso la gating sequenziale degli eventi totali per escludere detriti cellulari e doppietti (Figura 1A,B). I neuroni sono stati definitivamente identificati dalla positività NeuN(Figura 1C). Le cellule NeuN⁺ sono state ulteriormente analizzate per la positività MHCI tracciando le cellule su un istogramma con il numero di cellule normalizzate alla modalità sull'asse y e la fluorescenza MHCI sull'asse x. Un MHCI⁺ gate è stato disegnato nel punto in cui i picchi positivi e negativi divergevano (Figura 1D). Da ciò, la percentuale di neuroni positivi per la colorazione MHCI (Figura 1E) e l'intensità mediana della fluorescenza (IFM; Figura 1F) sono stati calcolati. I risultati mostrano che il trattamento IFNβ ha significativamente migliorato la percentuale di neuroni positivi per la colorazione extracellulare dell'MHCI, così come il livello di espressione, come indicato dalle IFM. L'analisi statistica e la rappresentazione grafica sono state fatte utilizzando software statistico disponibile in commercio.

Figura 1: Strategia rappresentativa di gating e quantificazione MHCI.
I neuroni ippocampali primari sono stati trattati con 100 U/mL di IFNβ o solo media. Dopo 72 ore, i neuroni sono stati macchiati extracellularmente con MHCI coniugato con blu del Pacifico (1 μg / mL H2-K^b), quindi etichettati intracellularmente con NeuN coniugato in PE (diluizione 1:100). La fluorescenza cellulare è stata valutata dalla citometria del flusso e sono stati analizzati i dati. (A) Gli eventi totali sono stati tracciati come SSC-A (log) vs FSC-A (lineare) e le celle (P1) sono state gateed per escludere i detriti. (B) All'interno della popolazione P1, le cellule sono state tracciate come FSC-H (lineari) vs FSC-A (lineari) per gateare la popolazione di singole cellule. (C) All'interno della popolazione di singole celle, le celle sono state tracciate SSC-A (log) vs NeuN-PE (log). Le cellule NeuN⁺ sono state gated per identificare i neuroni. (D) All'interno della popolazione neuronale, le cellule sono state tracciate su un istogramma con MHCI-PacBlu sull'asse x e i numeri cellulari normalizzati in modalità sull'asse y. È stato disegnato un cancello orizzontale per quantificare la percentuale di neuroni positivi per la colorazione MHCI. (E) Quantificazione della percentuale di MHCI⁺ di NeuN⁺ cellule solo nei mezzi e neuroni trattati con IFNβ. (F) Quantificazione dell'intensità mediana di fluorescenza (IFM) di MHCI su NeuN⁺ cellule nei neuroni mediali (neri) e trattati con IFNβ (rosso). La significatività statistica è stata calcolata mediante test t non accoppiato. **, P < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Neuron Growth Media (50 ml)
Reagente	Concentrazione finale	Concentrazione stock	Per 50 ml
Supplemento B27	2%	100%	1,0 ml
L-glutammina	2 mM	200 mM	0,5 ml
Penicillina-Streptomicina	100 U/ml	10.000 U/ml	0,5 ml
Mezzi neurobasali			48,0 ml
Tampone FACS (500 ml)
Reagente	Concentrazione finale	Concentrazione stock	Per 500 ml
Siero bovino fetale	2%	100%	10 ml
Edta	1 mM	500 mM	1 ml
DPBS			489 ml
Soluzione di dissociazione con papaina
Reagente	Concentrazione finale	Concentrazione stock	Per 1 ml
Sospensione papaina	20 U/ml	1000 U/ml	0,020 ml
DNasi I	2,5 U/ml	2500 U/ml	0,001 ml
Ibernazione-E			1,0 ml
Nota: Il volume della soluzione di dissociazione della papaina necessaria varierà a seconda del numero di cervelli embrionali sezionati. Preparare 0,5 ml per cervello per i neuroni ippocampali o 1,0 ml per cervello per i neuroni corticali.
Nota: Preparare la soluzione di dissociazione vortexing sospensione di papaina in Ibernato-E per circa 3 min. Dopo che la papaina è stata completamente sciolta, aggiungere la DNasi I. Non vortice DNasi I.

Tabella 1: Media e soluzioni.

Discussion

Questo protocollo descrive la dissezione e la coltura dei neuroni ippocampali primari dai cuccioli di topo prenatale al giorno 18 embrionale. L'uso di neuroni primari coltivati da roditori è una delle metodologie più fondamentali sviluppate nella neurobiologia moderna²². Sebbene le linee cellulari immortalate possano modellare alcuni aspetti dei neuroni, la loro natura di cellule derivate dal tumore, l'incapacità di sviluppare assoni definiti e la continua divisione cellulare sollevano dubbi sul fatto che ricapitolano fedelmente le proprietà dei neuroni post-mitotici in vivo²³. Un'altra alternativa ai neuroni primari è l'uso di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC). La tecnologia per l'utilizzo degli HiPSC, in particolare quelli derivati dal paziente, è prolisse rapidamente negli ultimi^{anni 24}. Tuttavia, ci sono ancora limitazioni all'utilizzo degli HiPSC, tra cui variabilità tra linee cellulari, mancanza di maturità funzionale e differenze nei profili epigenetici²⁵. Sebbene ci siano anche limiti al lavoro con il modello riduzionista dei neuroni roditori primari, i neuroni coltivati mantengono la natura post-mitotica dei neuroni in vivo. Inoltre, gli ampi strumenti di biologia molecolare e le modifiche genetiche disponibili per i topi favoriscono l'uso dei neuroni primari rispetto agli IPSC per molte applicazioni, e gli studi sui topi possono essere facilmente tradotti nell'organismo in vivo più complesso senza perdere il sistema genetico sperimentale. Per questi motivi, molti ricercatori usano i neuroni roditori primari per verificare gli aspetti chiave, se non la maggior parte, della loro ricerca.

Per alcuni saggi, i neuroni possono essere analizzati direttamente dopo l'isolamento dal cervello ex vivo. Ciò è particolarmente auspicabile per gli esperimenti che coinvolgono topi adulti che possono essere sottoposti a specifiche condizioni sperimentali o che possono dipendere da interazioni di più tipi di cellule; tuttavia, ci sono diversi problemi che limitano il tipo di analisi che possono essere fatte. È tecnicamente difficile preparare una sospensione a singola cellula dei neuroni dal cervello dei topi adulti perché i neuroni sono interconnessi in modo univoco ed etnea dalla mielina²⁶. I metodi non enzimatici di triturazione tissutale sono inefficienti nel dissociare il tessuto e causano la morte cellulare, mentre i preparati enzimatici spesso scindono gli antigeni superficiali^{cellulari 27}. Inoltre, mentre la mielina è in gran parte assente dai topi embrionali, comprende circa il 20% del cervello adulto e può compromettere l'isolamento cellulare vitale e impedire l'analisi della citometria del^{flusso 28}. Molte delle tecniche che sono state sviluppate alla fine spogliano i neuroni del loro citosolo e lasciano piccoli corpi cellulari arrotondati che consistono principalmente di nuclei²⁹. Sebbene ciò sia accettabile per alcune analisi, questo non è appropriato per quantificare l'espressione citoplasmatica o extracellulare delle proteine. Inoltre, il sistema di coltura cellulare riduzionista consente di testare specifiche domande meccaniche su una scala di tempo più breve di quanto sia spesso possibile con un sistema in vivo.

In questo protocollo sono descritti anche metodi per stimolare l'espressione MHCI farmacologicamente con IFNβ e la quantificazione dell'espressione MHCI extracellulare per citometria del flusso. La stimolazione da parte dell'IFNβ è un utile controllo positivo per testare altre condizioni sperimentali, ma si può notare che IFNγ e l'acido kainico possono anche stimolare l'espressione MHCI nei neuroni^9,30, mentre la tetrodotossina diminuisce l'espressione MHCI¹⁴. Metodi precedenti per rilevare l'espressione MHCI si basavano sull'ibridazione in situ e sull'analisi immunoistochimica^14,15,20,31. Mentre i test basati sull'mRNA, come l'ibridazione in situ e il qRT-PCR, possono determinare la localizzazione spaziotemporale, la specificità del tipo di cellula e i livelli di trascrizione genica, questi test non possono valutare la traduzione o il trasporto delle proteine nella membrana plasmatica. L'analisi immunoistochimica e western blot può determinare le differenze nell'espressione proteica e nella localizzazione potenzialmente cellulare, ma può essere difficile da quantificare con precisione. Inoltre, molti anticorpi MHCI riconoscono la struttura terziaria del complesso e sono altamente sensibili ai cambiamenti conformazionali. Pertanto, le condizioni di permeabilizzazione o denaturazione potrebbero causare la perdita di immunoreattività MHCI³². Il metodo qui presentato utilizza l'immunostaining in situ per MHCI, che consente il riconoscimento della proteina da parte dell'anticorpo nella sua conformazione nativa, seguita da metodi di fissazione e permeabilizzazione.

Con lievi modifiche, i metodi qui descritti possono essere utilizzati per coltura di altre popolazioni neuronali o per valutare l'espressione di altre proteine extracellulari di interesse. Notato in questo protocollo sono facili modifiche che possono essere fatte al fine di coltura neuroni corticali, ma i metodi descritti qui possono anche essere utilizzati per coltura di altre popolazioni neuronali, come i neuroni striatoli³³. Inoltre, sebbene questo protocollo specifichi l'immunostaining di MHCI e NeuN, altri marcatori cellulari possono essere identificati in modo simile. In generale, i marcatori extracellulari possono essere trattati come MHCI e i marcatori intracellulari possono essere trattati come NeuN. Tuttavia, va notato che durante la fase di dissociazione cellulare, le proiezioni assonali vengono recise dal soma. Poiché la strategia di gating definita qui scherma i detriti cellulari e si concentra sul marcatore dei nuclei neuronali NeuN, le proteine che sono espresse esclusivamente nelle proiezioni assonali potrebbero non essere rilevate.

Fino a poco tempo fa, si pensava che i neuroni esprimessero MHCI solo in risposta a danni, infezioni o stimolazione citochina in vitro al fine di coinvolgere cellule citotossiche CD8⁺ T⁹. Una nuova ricerca ha chiarito un'altra funzione dell'MHCI nella regolazione delle connessioni sinaptiche durante lo sviluppo¹³. Il protocollo qui descritto utilizza IFNβ per stimolare l'espressione MHCI nei neuroni coltivati a tipo selvatico, ma metodi simili possono essere usati con una varietà di stimoli cellulari o modifiche genetiche per testare ipotesi specifiche. Questo metodo consentirà ai ricercatori di studiare i meccanismi molecolari che regolano l'espressione MHCI, che miglioreranno la comprensione del ruolo dicotomo dell'MHCI su queste due distinte funzioni cellulari.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	Fisher	05-408-129	Forniture da laboratorio
Piatto di coltura sterile da 100 mm	Fisher		FB012924 Forniture per colture tissutali Provette
centrifuga da 15 ml	Genesee	21-103	Forniture da laboratorio
Provetta da centrifuga da 50 ml	Genesee	21-108	Forniture da laboratorio
500 mM EDTA	Invitrogen	Reagente tampone FACS	AM9260G
70% Etanolo	Fisher	BP82031Gal	Forniture per colture tissutali
Piastra con fondo a U a 96 pozzetti	Genesee	25-221	Forniture per citometria a flusso
B27	Gibco	17504044	Reagente per coltura neuronale
Borato Buffer	Thermo Scientific	28341	Forniture per colture tissutali
Vetro borosilicato Pasteur Pipetta	Fisher	13 678 20C	Forniture di laboratorio
Tampone di dissociazione cellulare	Gibco	13 151 014	Forniture per citometria a flusso
DNase I	Thermo	90083	Reagente soluzione di dissociazione
dPBS	Gibco	14190-235	Forniture per colture tissutali
Dumont #5 Pinze	Strumenti per scienze fini	91150-20	Strumento di dissezione
Dumont #7 Pinze	Strumenti per le scienze fini	91197-00	Strumento di dissezione
Fetale Siero bovino fetale	Gibco	26140079	Forniture per la coltura dei tessuti
Pinze fini	Strumenti per le scienze fini	91113-10	Strumento di dissezione
Forbici fini	Strumenti per le scienze fini	91460-11	Strumento di dissezione
Kit di permeabilizzazione cellulare per la riparazione e la permanente	Invitrogen	Forniture per citometria a flusso	GAS003
Reagente per coltura Glutamax	Gibco	35050061	Neuron
Hibernate-E Reagente per	Gibco	A1247601
Neuron Buste per sterilizzazione a tenuta istantanea Fisher Forniture	per	colture tissutali	Fisher
test Interferone	Beta PBL Scienza	12405-1	Forniture per citometria a flusso
Anticorpo anti-NeuN-PE Milli-Mark, clone A60	MilliporeSigma	FCMAB317PE	Citometria a flusso Anticorpo
Terreni neurobasali	Gibco	21103049	Neuron Reagente per coltura
Pacifico Anticorpo H-2Kb Anticorpo H-2Kb	BioLegend	116513	Citometria a flusso
papaina	Reagente
per LS003126 soluzione di dissociazione WorthingtonScienze della microscopia elettronica della paraformaldeide		15714	Fissativo
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122	Reagente per coltura neuronale
Poli-D-lisina	Sigma	P7280	Reagente per coltura neuronale
Modello standard Pinze	Strumenti per scienze fini	91100-12	Strumento di dissezione
Microscopio per dissezione stereo	Swift	M29TZ-SM99CL-BTW1	Strumento di dissezione
Forbici chirurgiche	Strumenti per scienze fini	91401-10	Pipette di trasferimento per strumenti di dissezione
	Corning	357575	Forniture di laboratorio
TruStain FcX (anti-topo CD16/32) Anticorpo	BioLegend	101319	Citometria a flusso Anticorpo
Trypan Blue	Sigma	T8154-100ML	Forniture per colture tissutali