Articolo metodologico

Valutazione dell'impegno del bersaglio cellulare da parte degli inibitori della fosfatasi SHP2 (PTPN11)

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DOI:

10.3791/61457

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17 luglio 2020

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1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

In questo articolo

Sommario

La capacità di valutare l'impegno target da parte degli inibitori candidati nelle cellule intatte è fondamentale per la scoperta di farmaci. Questo protocollo descrive un saggio di spostamento termico cellulare in formato 384 che rileva in modo affidabile l'impegno del bersaglio cellulare degli inibitori che prendono di mira SHP2 di tipo selvaggio o le sue varianti oncogeniche.

Abstract

La fosfatasi 2 (SH2) contenente dominio Src-omologia 2 (SHP2), codificata dal proto-oncogene PTPN11, è un mediatore chiave della segnalazione cellulare guidata dalla tirosina chinasi recettore (RTK), promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione cellulare. Inoltre, SHP2 viene reclutato dai recettori dei punti di controllo immunitario per inibire l'attivazione delle cellule B e T. La funzione Aberrant SHP2 è stata implicata nello sviluppo, nella progressione e nella metastasi di molti tumori. Infatti, gli inibitori della piccola molecola SHP2 sono recentemente entrati in studi clinici per il trattamento di tumori solidi con attivazione della via Ras / Raf / ERK, compresi i tumori con alcune mutazioni ras oncogeniche. Tuttavia, l'attuale classe di inibitori dell'SHP2 non è efficace contro le varianti oncogeniche SHP2 che si verificano frequentemente nelle leucemie, e lo sviluppo di piccole molecole specifiche che prendono di mira l'SHP2 oncogenico è oggetto di ricerche attuali. Un problema comune con la maggior parte delle campagne di scoperta di farmaci che coinvolgono proteine citosoliche come SHP2 è che i test primari che guidano la scoperta chimica sono spesso saggi in vitro che non riportano l'impegno target cellulare dei composti candidati. Per fornire una piattaforma per misurare l'engagement del bersaglio cellulare, abbiamo sviluppato test di spostamento termico cellulare SHP2 sia di tipo selvaggio che mutante. Questi test rilevano in modo affidabile l'impegno target degli inibitori di SHP2 nelle cellule. Qui, forniamo un protocollo completo di questo saggio, che fornisce uno strumento prezioso per la valutazione e la caratterizzazione degli inibitori di SHP2.

Introduzione

La fosforilazione della tirosina svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale nellecelle 1,2. Questa modifica post-traslazionale è catalizzata da proteina tirosina chinasi (PTT) e invertita da proteina tirosina fosfatasi (PTP). Pertanto, la funzione PTK o PTP aberrante porta a molte malattie umane ereditarie o acquisite3,4,5,6. La Src-omologia 2 (SH2) contenente il dominio fosfatasi 2 (SHP2) è un PTP di tipo non recettore ampiamente espresso codificato dal proto-oncogene PTPN117 ed è un regolatore chiave di numerosi processi fisiologici che comportano la trasduzione del segnale tramite attivazione delle vie di segnalazione Ras/ Raf / ERK, PI3K / Akt o JAK / STAT8. Normalmente, l'attività SHP2 è strettamente regolata al fine di prevenire la segnalazione aberrante. In condizioni basali SHP2 è autoibitato dal suo dominio SH2 N-terminale, che blocca l'accesso al sito attivo all'interno del dominio della fosfatasi catalitica (Figura 1A)9,10. Al momento dell'attivazione cellulare, le proteine leganti fosforilate della tirosina reclutano SHP2, facendolo adottare la sua conformazione attiva, in cui il sito attivo è ora accessibile ai suoi substrati. In molti tumori l'attività SHP2 è elevata. Mutazioni del guadagno di funzione somatico (GOF) in PTPN11 sono state identificate principalmente nelle leucemie e impediscono il legame del dominio N-SH2 al dominio fosfatasi, con conseguente SHP2 costitutivamente attivo (Figura 1B)11. Le mutazioni gof germinali in PTPN11 sono responsabili di ~ 50% dei casi di sindrome di Noonan, un disturbo dello sviluppo con un aumento del rischio di malignità12. Nei tumori solidi, dove le mutazioni di PTPN11 sono rare, maggiori livelli di proteine leganti fosforilate portano ad una maggiore attività SHP2 (Figura 1C). SHP2 è anche importante per la segnalazione del checkpoint immunitario, poiché i recettori del checkpoint come BTLA o PD-1 reclutano SHP2 per defosforilato le molecole di segnalazione della chiave, impedendo l'attivazionedelle cellule immunitarie 13,,14,,15.

Indirizzare i PTP con piccole molecole è stata una sfida, perché il sito attivo dei PTP è altamente conservato e altamente carico; gli inibitori che prendono di mira il sito attivo sono spesso potenti, ma mostrano scarsa selettività e biodisponibilità orale16,,17,,18,,19,,20,,21,,22. Infatti, molti inibitori di SHP2 segnalati soffrono di scarsa selettività e mancanza di efficacia nelle cellule23. Recentemente, sono stati segnalati inibitori allosterici di SHP2 con buona potenza e eccellente selettività (ad esempio, SHP09924 e RMC-455025) e hanno suscitato un rinnovato interesse per gli inibitori di SHP2. I composti a base di SHP099 e RMC-4550 sono attualmente in fase I studi clinici per trattare tumori solidi con attivazione del percorso della tirosina chinasi recettore (RTK)26,,27. Sebbene innovativi, questi composti sono inefficaci contro molti dei mutanti oncogenici SHP2 che guidano la leucemogenesi in un numero significativo di pazienti con cancro delsangue 28,29,30. Questa mancanza di potenza dei composti simili a SHP099 verso le varianti oncogeniche SHP2 deriva dal loro meccanismo allosterico unico, in quanto inibiscono l'attività SHP2 legando e stabilizzando la conformazione inattiva e chiusa, che viene interrotta nei mutanti SHP2. Inoltre, sulla base di un recente rapporto31, i meccanismi di resistenza adattativa nei pazienti trattati con inibitori simili a SHP099 sono del tutto concepibili. Di conseguenza, lo sviluppo di inibitori SHP2 di nuova generazione che prendono di mira il suo stato attivo e aperto è oggetto di intense ricerche.

La caratterizzazione di nuovi inibitori SHP2 nelle cellule è un aspetto essenziale del processo di ottimizzazione del piombo. Criticamente, l'impegno target comprovato dell'inibitore in condizioni fisiologiche fornisce un ulteriore livello di fiducia nel fatto che le risorse per la chimica medicinale siano utilizzate in modo efficiente su composti con promettente efficacia cellulare. In passato, sono stati sviluppati diversi metodi per valutare il legame degli inibitori di piccole molecole ai loro obiettivi, principalmente per le chinasi proteiche32. Per sviluppare un test di coinvolgimento del bersaglio cellulare SHP2, abbiamo utilizzato un saggio di spostamento termico cellulare33. Questo saggio, simile al saggio di spostamento termico in vitro (PTS) per le proteine34, monitora la stabilità termica della proteina bersaglio, che è tipicamente alterata dal legame di piccole molecole. Il saggio originale è un saggio a bassa produttività che utilizza anticorpi per quantificare i livelli proteici bersaglio. In alternativa, abbiamo scelto una variante recentemente riportata del saggio di spostamento termico che utilizza un saggio di complementazione dei frammenti enzimatici β-galattosidasi (EFC)(Figura 2)35. Per questi esperimenti, la proteina di interesse è espressa nelle cellule come una proteina di fusione N o C-terminale che porta un tag ProLabel migliorato (ePL, un frammento di 42 amminoacidi di β-galattosidasi). Le cellule vengono quindi trasferite in piastre compatibili con PCR a 384 pozzi e incubate con composti di interesse. Un termociclo viene utilizzato per applicare un gradiente di temperatura alle cellule, le cui proteine si denaturano e si aggregano man mano che la temperatura aumenta in base alla loro stabilità termica. La capacità di un composto candidato di legare e stabilizzare la proteina di interesse si tradurrà in una maggiore stabilità termica di quella proteina. Pertanto, a seguito della lisi delle cellule, le proteine taggate che sono state stabilizzate da un composto candidato rimarranno in soluzione a temperature più elevate rispetto alle proteine taggate delle cellule incubate con il controllo del veicolo. L'accettore enzimatico Reporter (EA) è in grado di integrare le proteine solubili taggate ePL, risultando in un'attività rilevabile β-galattosidasi utilizzando un substrato di luminescenza.

Recentemente abbiamo sviluppato un robusto test di spostamento termico cellulare per SHP2 di tipo selvaggio (SHP2-WT) e una frequente variante oncogenica SHP2 (SHP2-E76K) in un formato miniaturizzato 384-well36. Qui, reportiamo un protocollo dettagliato di questo saggio, che rileva in modo affidabile l'impegno del bersaglio da parte degli inibitori SHP2 nelle cellule e dimostra un alto grado di correlazione tra la potenza dell'inibitore e i dati dello spostamento termico cellulare. Il flusso di lavoro generale dei saggi è illustrato nella figura 3. La nostra piattaforma utilizza proteine di fusione ePL-SHP2 a lunghezza intera taggate n-terminale. Per la generazione dei corrispondenti plasmidi di espressione pICP-ePL-N-SHP2-WT e pICP-ePL-N-SHP2-E76K, fare riferimento alla nostra recente pubblicazione36. Questo test può essere eseguito utilizzando un gradiente termico per stabilire profili termici SHP2 e determinare le temperature di fusione SHP2 in presenza o assenza di inibitore. Una volta stabiliti i profili termici, può anche essere eseguito in condizioni isotermiche, consentendo la valutazione della dose-risposta dell'inibitore. Entrambi i tipi di esperimenti sono descritti di seguito.

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Protocollo

1. Preparazione della coltura cellulare e dei reagenti

  1. Formulare una bottiglia da 500 ml di mezzi di crescita con siero bovino fetale al 10%, 1x antibiotico/antimicotico, 20 mM HEPES e 1 mM di piruvato di sodio. Conservare a 4 °C.
  2. Scongelare i reagenti di spostamento termico cellulare (reagente EA, tampone di lysis e substrato) da bottiglie di magazzino originali congelate.
  3. Erogare reagenti e tamponare come aliquote da 2 mL e conservare a -20 °C.
    NOTA: Evitare il congelamento/scongelamento per la riproducibilità e utilizzare solo il volume di reagente richiesto per la procedura di dosaggio.

2. Crescita e manutenzione delle celle HEK293T

  1. Ottenere cellule HEK293T aderenti a basso passaggio dalla conservazione criogenica.
  2. Mantenere le cellule HEK293T nei mezzi di crescita a 37 °C, 5% CO2.
  3. Dividere le celle ogni 4 giorni in un rapporto 1:14.
    NOTA: Per ottenere le migliori prestazioni, le celle HEK293T non possono passare più di 25 volte.

3. PREPARAZIONE cellulare HEK293T per la trasfezione transitoria

  1. Staccare le celle HEK293T da piastre da 16 mL utilizzando 3 mL del reagente di distacco cellulare.
  2. Diluire con 12 mL di mezzi di crescita. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1.400 x g per 4 min.
  3. Resuspend il pellet in mezzi di crescita da 10 mL. Misurare la concentrazione e la vitalità delle cellule utilizzando il blu tripano e un contatore di cellule.
  4. Piastra 7,0 x 105 cellule HEK293T in crescita esponenziale per pozzo in una piastra di coltura cellulare di 6 po 'circa 24 ore prima della trasfezione.
    NOTA: Riservare un pozzo per ogni plasmide da trasfetto.
  5. Incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.

4. Trasfezione di cellule HEK293T

  1. Da uno stock plasmide purificato di pICP-ePL-N-SHP2-WT o pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~200 ng/μL) diluire 2 μg di DNA plasmide in 200 μL di tampone di trasfezione.
  2. Vortice per 10 s e centrifuga a 1.400 x g per 4 min.
  3. Aggiungere 4 μL di reagente di trasfezione al DNA diluito. Vortice per 10 s e centrifuga a 1.400 x g per 4 min.
  4. Incubare a 23 °C per 10 min.
  5. Rimuovere dall'incubatore la piastra di 6 pozzi contenente cellule HEK293T in crescita. Aggiungere la miscela di trasfezione alle celle attaccate nella piastra a 6 po'. Incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.

5. Preparazione di piastre di dosaggio

  1. Preparare soluzioni stock da 10 mM in DMSO di composti da testare.
  2. Erogare soluzioni inibitorie in una piastra di sorgente a volume morto a 384 po 'di basso volume morto per un uso immediato.
  3. Individuare il volume desiderato di inibitori o veicoli (DMSO) utilizzando un gestore liquido in piastre PCR in tempo reale da 384 po 'ad un volume finale target inferiore allo 0,5% DMSO (v/v). Sigillare la piastra utilizzando un sigillare a piastre con spurgo di gas inerte.
    NOTA: Per i test dose-risposta dell'inibitore, assicurarsi di riempire di conseguenza DMSO in modo che per ogni concentrazione di inibitore siano utilizzate quantità uguali di DMSO. Per ottenere i migliori risultati, conservare le piastre a 23 °C e utilizzare piastre entro 24 ore.

6. Distacco e preparazione delle cellule trasfette

  1. Mezzi di crescita preincubati e reagente di distacco cellulare in un bagno d'acqua a 37 °C. Rimuovere le cellule trasfette dall'incubatrice. Aspirare delicatamente i supporti dai pozzi della piastra.
    NOTA: Utilizzare un nuovo aspiratore per ogni pozzo che contiene un plasmide trasfetto diverso.
  2. Aggiungere 0,3 mL del reagente di distacco della cella. Scuotere delicatamente la piastra avanti e indietro per coprire accuratamente la superficie del fondo della piastra. Incubare a 23 °C per 2 min.
  3. Aggiungere 1 mL di mezzi di crescita a ciascun pozzo. Pipettare delicatamente mezzi e celle nel pozzo e trasferirli in un tubo di centrifuga Falcon da 15 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1.400 x g per 4 min.
  4. Aspirare delicatamente ma accuratamente dal supporto.
    NOTA: Il rosso fenolo residuo nel reagente del distacco cellulare può interferire con il saggio.
  5. Resuspend accuratamente pellet cellulare in 2 mL di mezzi di crescita. Misurare la concentrazione e la vitalità delle cellule utilizzando il blu tripano e un contatore di cellule.
    NOTA: La vitalità della cella dovrebbe essere > 90% per i migliori risultati.
  6. Diluire le cellule a una concentrazione di 125 cellule/μL. Ad esempio, per un saggio da 5 μL questo è ~625 cellule/μL. Per una vitalità ottimale mantenere le cellule in sospensione per non più di 2 ore.

7. Incubazione di cellule con inibitori di SHP2

  1. Erogare le cellule in un trogolo sterile a canale singolo.
  2. Centrifuga la piastra PCR in tempo reale da 384 pozzetto che è stata pre-preparata dalla deposizione dell'inibitore SHP2 a 2.500 x g per 5 minuti a 23 °C.
  3. Rimuovere la guarnizione dalla piastra composta. Utilizzando una pipetta multicanale da 125 μL, aggiungere 5 μL delle cellule diluite ai possenti desiderati.
  4. Centrifugare la piastra a 42 x g per 30 s senza coperchio sulla piastra. Attaccare una guarnizione del coperchio alla piastra dopo che la piastra è stata filata verso il basso e incubare la piastra di dosaggio a 37 °C, 5% CO2 per 1 h.

8. Preparazione del master mix di reagenti chemiluminescenti

  1. Rimuovere la quantità necessaria di reagenti di rilevamento (reagente EA, tampone dilisi e substrato) dallo stoccaggio di -20 °C dopo la placcatura delle cellule. Scongelare i reagenti a 23 °C.
    NOTA: Per comodità nel trasferimento, preparare un volume che sia 1,5 volte il volume totale delle cellule che sono state depositate sulla piastra. Non riutilizzare i reagenti dopo l'uso.
  2. Preparare una miscela master dei reagenti utilizzando la condizione EA-10, che consiste in frazione di componente e volume come segue: reagente EA (0,17), tampone di lisi (0,17), substrato (0,67).
    NOTA: I rapporti di reagente si basano su esperimenti di ottimizzazione eseguiti come specificato nel manuale del fornitore.

9. Impulso termico gradiente del profilo isotermico o termico

  1. Programmare il termociclore capace di gradiente per l'erogazione di impulso termico.
    1. Per gli esperimenti di gradiente del profilo termico, preprogrammare il termociclo con le seguenti specifiche di esempio:
    2. Impulso termico: 3 minuti di temperatura di fusione desiderata (gradiente verticale o orizzontale +/- 15 °C; esempio 38-68 °C distribuiti su 24 pozzi produce incrementi di temperatura di 1,25 °C).
  2. Fase di recupero dell'equilibrazione: 3 min 20 °C con velocità della rampa = 1 °C/s
    1. Per gli esperimenti isotermici impostare il protocollo impostato come segue:
    2. Impulso termico: 3 min 55 °C. Fase di recupero dell'equilibrazione: 3 min 20 °C con velocità della rampa = 1°C/s
      NOTA: Per una maggiore riproducibilità, in quanto può essere difficile posizionare la piastra esattamente nel momento in cui il termociclo raggiunge la temperatura desiderata, impostare il programma per contare 15 s prima di iniziare l'impulso di 3 minuti. Per il termociclo utilizzato in questo esperimento vedere Tabella dei materiali, il coperchio viene mantenuto durante l'impulso termico.

10. Rilevamento e misurazione dellalisi

  1. Integrare le piastre di dosaggio con mix principale di rilevamento della lisi mediante aggiunta di volumi uguali (5 μL) ad ogni pozzo da analizzare utilizzando una pipetta multicanale.
  2. Centrifugare la piastra 42 x g per 30 s. Conservare a 23 °C al buio per 30-60 minuti.
  3. Misurare la chemiluminescenza utilizzando un lettore di micropiatte in grado di rilevare la luminescenza in formato 384-well. Eseguire la misurazione della luminescenza con il tipo di piastra e il tempo di integrazione ottimizzati (tempo di integrazione 1000 ms, tempo di regolamento 0 s). Misurare i valori come conteggi/i e output per ulteriori analisi.

11. Analisi dei dati

  1. Analizzare i dati di luminescenza utilizzando un software scientifico di grafica e statistica 2D.
  2. Genera profili termici analizzando i dati di luminescenza normalizzati (normalizzati al controllo del veicolo) utilizzando la regressione non lineare e un modello sigmoidale Boltzmann.
    NOTA: Negli esperimenti di profilo termico, il V50 calcolato,la temperatura che è il punto intermedio tra il fondo e la parte superiore della curva, definisce la temperatura di fusione di SHP2. Negli esperimenti isotermici, EC50 definisce la concentrazione dell'inibitore che dà una risposta semi-massima.

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Risultati

L'esperimento del gradiente termico per SHP2-WT ha portato a un profilo termico cellulare sigmoidale con una stretta transizione di fusione tipica e coerente per una proteina piegata (Figura 4A). SHP2 è costituito da tre domini indipendenti: due domini SH2 e il dominio catalitico (Figura 1). Nella conformazione chiusa automaticamente inibita questi domini si associano automaticamente; la transizione di fusione osservata nell'esperimento del profilo termico rifle...

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Discussione

Abbiamo presentato un saggio di coinvolgimento target in grado di confermare il legame diretto di piccole molecole alla fosfatasi SHP2 nelle cellule. Il saggio può discriminare tra inibitori a bassa e alta affinità e, cosa importante, confermare una mancanza di potenza da parte degli inibitori allosterici del tipo SHP099 per il mutante oncogenico GOF SHP2-E76K. Un punto di forza di questo test miniaturizzato è la sua capacità di essere integrato in una campagna di screening inibitore SHP2. La capacità del saggio di confe...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con il contenuto di questo articolo.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (a L. T.), Epstein Family Foundation Award (a N. D. P.C.) e NSC Cancer Center Support Grant P30CA030199. Inoltre, questo progetto è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, nell'ambito del contratto n. del consorzio di biologia chimica. HHSN261200800001E. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani, né la menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Termociclatore dotato di gradiente a 384 pozziEppendorf AGX50h
Micropiastra a basso volume morto a 384 pozzi Echo qualificataBeckman Coulter, Inc.LP-0200
Piastre di coltura cellulare a 6 pozziGreiner Bio-One657 160Sterile con coperchio
Antibiotico-Antimicotico (Anti Anti-Anti) 100 XThermo Fisher Scientific15240-062
Contatore cellulariThermo Fisher ScientificContessa II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Manipulatore acustico di liquidi a ecoBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Pipetta elettronica multicanaleThermo Fisher ScientificE1 ClipTip
Siero bovino fetaleThermo Fisher Scientific26140-079500 mL
Buffer HEPESThermo Fisher Scientific15630-680100 mL
Kit di avviamento InCell PulseEurofins DiscoverX Corp.94-4007I componenti includono buffer EA, buffer di lisi e substrato
Lettore di microplaccheTecan Trading AGSpark
Vascello di soluzione a canale singoloThermo Fisher ScientificS253012005
Piruvato di sodioThermo Fisher Scientific11360-010100 mM
Sigillante termico per microplaccheAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Reagenti di trasfezioneTrasfezione PolyplusjetPRIME
Blu di tripanoThermo Fisher ScientificT10282
Reagente TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605-010
Piastre PCR in tempo reale Twin.tec 384Eppendorf AG30132734

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