L'articolo descrive la quantificazione di 1) le dimensioni e il numero di adereni focali e 2) l'indice di forma cellulare e la sua distribuzione da immagini confocali dei monostrati confluenti delle cellule MCF7.
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Articolo metodologico
Quantificazione dell'area di adesione del substrato cellulare e della distribuzione delle forme cellulari nei monostrati cellulari MCF7
In questo articolo
Sommario
Abstract
I metodi qui presentati quantificano alcuni parametri dei monostrati cellulari aderenti confluenti da più immagini confocali opportunamente macchiate: adesione al substrato in funzione del numero e delle dimensioni delle adere focali e della forma cellulare, caratterizzata dall'indice di forma cellulare e da altri descrittori di forma. Le adesioni focali sono state visualizzate dalla colorazione paxillin a zintillina e i confini delle cellule cellulari sono stati contrassegnati da plakoglobina di giunzione e actina. I metodi per la coltura cellulare e la colorazione erano standard; le immagini rappresentano singoli piani focali; l'analisi delle immagini è stata eseguita utilizzando un software di elaborazione delle immagini disponibile pubblicamente. I protocolli presentati vengono utilizzati per quantificare il numero e le dimensioni delle ademonie focali e le differenze nella distribuzione della forma cellulare nei monostrati, ma possono essere riutilizzati per la quantificazione delle dimensioni e della forma di qualsiasi altra struttura cellulare distinta che può essere macchiata (ad esempio, mitocondri o nuclei). La valutazione di questi parametri è importante nella caratterizzazione delle forze dinamiche nello strato cellulare aderente, compresa l'adesione cellulare e la contrattiglio anomiosina che influenza la forma delle cellule.
Introduzione
I monostrati cellulari epiteliali agiscono come un collettivo in cui l'adesione cellulare e substrato cellulare, così come le forze e le tensioni contrattuali rappresentano parametri importanti e il loro corretto equilibrio contribuisce all'integrità complessiva dell'unità1,2,3. Pertanto, la valutazione di questi parametri rappresenta un modo per stabilire lo stato corrente del livello della cella.
I due metodi qui descritti rappresentano un'analisi bidimensionale dei monostrati confluenti delle cellule epiteliali aderenti (in questo caso la linea ....
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Protocollo
1. Passi preparatori
- Semina cellulare per ottenere monostrati confluenti
- Prima della seminazione, ricoprire i pozze di uno scivolo camera 4-pozzi con collagene I (o altro componente ECM di scelta). Per il rivestimento i collagene, seguire un protocollo commerciale: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html ad una concentrazione di 8 g/cm2.
- Seme 400.000 cellule ad un pozzo di uno scivolo a 4 camere.
- Coltura le cellule per 24 h (o più a lungo, a seconda degli endpoint sperimentali) prima di colorare, in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Ques....
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Risultati
Analisi dell'adesione focale
L'abbattimenti del gene HAX1 è stato precedentemente dimostrato che influisce sulle aderene focali6. Le cellule sono state coltivate sulla superficie rivestita di collagene I per 48 h. Le immagini delle cellule di controllo MCF7 e MCF7 con un knockdown HAX1 (HAX1 KD) da tre esperimenti indipendenti macchiati con la colossione della proteina aderente paxillin sono stati ottenuti utilizzando un microscopio confocale (immagin.......
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Discussione
L'adesione cellulare e substrato cellulare costituiscono attributi intrinseci delle cellule epiteliali e svolgono il ruolo critico nella morfogenesi dei tessuti e nell'embriogenesi. Nei tessuti adulti la corretta regolazione delle proprietà meccaniche dello strato cellulare è cruciale per mantenere l'omeostasi e prevenire le risposte patologiche come la progressione del tumore e la metastasi. La dimensione e il numero di adere focali dipendono dalla forza dell'adesione delle cellule-substrato, mentre la forma cellulare d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Nazionale Scientifico Polacco sotto la concessione n. 2014/14/M/ NÀ1/00437.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | capra anti-coniglio, 1:500 |
| Cloruro di ammonio | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagene da pelle di vitello | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), acido nucleico colorazione |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-glucosio, piruvato | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| cellulare di | placoglobina a giunzione | 2309S | coniglio, 1:400 |
| Armadio a flusso laminare classe 2 | Equipaggiamento standard | Alpina | |
| Linea cellulare >HAX1KD basata su MCF7 | Linea cellulare stabilita nell'Istituto Nazionale di Oncologia, Varsavia, descritta in Balcerak et al., 2019 | Linea cellulare MCF7 conHAX1knockdown | |
| Linea cellulare MCF7 (CONTROLLO) | ATCC | ATCC HTB-22 | epiteliale, linea cellulare aderente per carcinoma mammario |
| Microscopio ottico Olympus CK2 | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | coniglio, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Coniugato falloidina-TRITC | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), marcatura dell'actina |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST ... NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Microscopio confocale | Zeiss |
Riferimenti
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006(2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122
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Ristampe e permessi
