Quantificazione dell'area di adesione del substrato cellulare e della distribuzione delle forme cellulari nei monostrati cellulari MCF7

Summary

L'articolo descrive la quantificazione di 1) le dimensioni e il numero di adereni focali e 2) l'indice di forma cellulare e la sua distribuzione da immagini confocali dei monostrati confluenti delle cellule MCF7.

Abstract

I metodi qui presentati quantificano alcuni parametri dei monostrati cellulari aderenti confluenti da più immagini confocali opportunamente macchiate: adesione al substrato in funzione del numero e delle dimensioni delle adere focali e della forma cellulare, caratterizzata dall'indice di forma cellulare e da altri descrittori di forma. Le adesioni focali sono state visualizzate dalla colorazione paxillin a zintillina e i confini delle cellule cellulari sono stati contrassegnati da plakoglobina di giunzione e actina. I metodi per la coltura cellulare e la colorazione erano standard; le immagini rappresentano singoli piani focali; l'analisi delle immagini è stata eseguita utilizzando un software di elaborazione delle immagini disponibile pubblicamente. I protocolli presentati vengono utilizzati per quantificare il numero e le dimensioni delle ademonie focali e le differenze nella distribuzione della forma cellulare nei monostrati, ma possono essere riutilizzati per la quantificazione delle dimensioni e della forma di qualsiasi altra struttura cellulare distinta che può essere macchiata (ad esempio, mitocondri o nuclei). La valutazione di questi parametri è importante nella caratterizzazione delle forze dinamiche nello strato cellulare aderente, compresa l'adesione cellulare e la contrattiglio anomiosina che influenza la forma delle cellule.

Introduction

I monostrati cellulari epiteliali agiscono come un collettivo in cui l'adesione cellulare e substrato cellulare, così come le forze e le tensioni contrattuali rappresentano parametri importanti e il loro corretto equilibrio contribuisce all'integrità complessiva dell'unità^1,2,3. Pertanto, la valutazione di questi parametri rappresenta un modo per stabilire lo stato corrente del livello della cella.

I due metodi qui descritti rappresentano un'analisi bidimensionale dei monostrati confluenti delle cellule epiteliali aderenti (in questo caso la linea ....

Protocol

1. Passi preparatori

1. Semina cellulare per ottenere monostrati confluenti
   1. Prima della seminazione, ricoprire i pozze di uno scivolo camera 4-pozzi con collagene I (o altro componente ECM di scelta). Per il rivestimento i collagene, seguire un protocollo commerciale: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html ad una concentrazione di 8 g/cm².
   2. Seme 400.000 cellule ad un pozzo di uno scivolo a 4 camere.
   3. Coltura le cellule per 24 h (o più a lungo, a seconda degli endpoint sperimentali) prima di colorare, in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 5% CO₂. Ques....

Results

Analisi dell'adesione focale
L'abbattimenti del gene HAX1 è stato precedentemente dimostrato che influisce sulle aderene focali⁶. Le cellule sono state coltivate sulla superficie rivestita di collagene I per 48 h. Le immagini delle cellule di controllo MCF7 e MCF7 con un knockdown HAX1 (HAX1 KD) da tre esperimenti indipendenti macchiati con la colossione della proteina aderente paxillin sono stati ottenuti utilizzando un microscopio confocale (immagin.......

Discussion

L'adesione cellulare e substrato cellulare costituiscono attributi intrinseci delle cellule epiteliali e svolgono il ruolo critico nella morfogenesi dei tessuti e nell'embriogenesi. Nei tessuti adulti la corretta regolazione delle proprietà meccaniche dello strato cellulare è cruciale per mantenere l'omeostasi e prevenire le risposte patologiche come la progressione del tumore e la metastasi. La dimensione e il numero di adere focali dipendono dalla forza dell'adesione delle cellule-substrato, mentre la forma cellulare d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	capra anti-coniglio, 1:500
Cloruro di ammonio	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Collagene da pelle di vitello	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), acido nucleico colorazione
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-glucosio, piruvato	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
cellulare di	placoglobina a giunzione	2309S	coniglio, 1:400
Armadio a flusso laminare classe 2	Equipaggiamento standard	Alpina
Linea cellulare >HAX1KD basata su MCF7	Linea cellulare stabilita nell'Istituto Nazionale di Oncologia, Varsavia, descritta in Balcerak et al., 2019		Linea cellulare MCF7 conHAX1knockdown
Linea cellulare MCF7 (CONTROLLO)	ATCC	ATCC HTB-22	epiteliale, linea cellulare aderente per carcinoma mammario
Microscopio ottico Olympus CK2	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	coniglio, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Coniugato falloidina-TRITC	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), marcatura dell'actina
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST ... NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Microscopio confocale	Zeiss