Quantificazione dell'area di adesione del substrato cellulare e della distribuzione delle forme cellulari nei monostrati cellulari MCF7

Summary

L'articolo descrive la quantificazione di 1) le dimensioni e il numero di adereni focali e 2) l'indice di forma cellulare e la sua distribuzione da immagini confocali dei monostrati confluenti delle cellule MCF7.

Abstract

I metodi qui presentati quantificano alcuni parametri dei monostrati cellulari aderenti confluenti da più immagini confocali opportunamente macchiate: adesione al substrato in funzione del numero e delle dimensioni delle adere focali e della forma cellulare, caratterizzata dall'indice di forma cellulare e da altri descrittori di forma. Le adesioni focali sono state visualizzate dalla colorazione paxillin a zintillina e i confini delle cellule cellulari sono stati contrassegnati da plakoglobina di giunzione e actina. I metodi per la coltura cellulare e la colorazione erano standard; le immagini rappresentano singoli piani focali; l'analisi delle immagini è stata eseguita utilizzando un software di elaborazione delle immagini disponibile pubblicamente. I protocolli presentati vengono utilizzati per quantificare il numero e le dimensioni delle ademonie focali e le differenze nella distribuzione della forma cellulare nei monostrati, ma possono essere riutilizzati per la quantificazione delle dimensioni e della forma di qualsiasi altra struttura cellulare distinta che può essere macchiata (ad esempio, mitocondri o nuclei). La valutazione di questi parametri è importante nella caratterizzazione delle forze dinamiche nello strato cellulare aderente, compresa l'adesione cellulare e la contrattiglio anomiosina che influenza la forma delle cellule.

Introduction

I monostrati cellulari epiteliali agiscono come un collettivo in cui l'adesione cellulare e substrato cellulare, così come le forze e le tensioni contrattuali rappresentano parametri importanti e il loro corretto equilibrio contribuisce all'integrità complessiva dell'unità^1,2,3. Pertanto, la valutazione di questi parametri rappresenta un modo per stabilire lo stato corrente del livello della cella.

I due metodi qui descritti rappresentano un'analisi bidimensionale dei monostrati confluenti delle cellule epiteliali aderenti (in questo caso la linea cellulare del cancro al seno MCF7). L'analisi viene eseguita utilizzando immagini confocali (singole sezioni z) provenienti da diverse regioni sull'asse z; regione basale vicino a un substrato per misurazioni di adesione focale (FA) e regione apicale per le misurazioni della forma delle cellule. I metodi presentati sono relativamente semplici e richiedono tecniche di laboratorio standard e software open-source. La microscopia confocale è sufficiente per questo protocollo, quindi può essere eseguita senza utilizzare una microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) più specializzata. Pertanto, il protocollo potrebbe essere implementato in un ambiente di laboratorio relativamente standard. Anche se l'accuratezza dei metodi è limitata, possono distinguere le differenze di base nell'adesione focale e nella forma delle cellule.

Entrambi i metodi qui descritti consistono nelle procedure sperimentali standard come la coltura cellulare, l'immunostaining, l'imaging confocale e l'analisi delle immagini eseguite utilizzando ImageJ. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi software di elaborazione delle immagini con le funzioni appropriate. I metodi presentati possono monitorare e confrontare i cambiamenti inflitti dal trattamento farmacologico o dalla modificazione genetica minima. Non è consigliabile ottenere valori definiti, a causa della precisione limitata di questi metodi. Sono state incluse due macro automatizzate, per facilitare le misurazioni di molte immagini.

Protocol

1. Passi preparatori

1. Semina cellulare per ottenere monostrati confluenti
   1. Prima della seminazione, ricoprire i pozze di uno scivolo camera 4-pozzi con collagene I (o altro componente ECM di scelta). Per il rivestimento i collagene, seguire un protocollo commerciale: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html ad una concentrazione di 8 g/cm².
   2. Seme 400.000 cellule ad un pozzo di uno scivolo a 4 camere.
   3. Coltura le cellule per 24 h (o più a lungo, a seconda degli endpoint sperimentali) prima di colorare, in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 5% CO₂. Questo passaggio consente una maturazione dei contatti cellulare e la formazione di monostrati.
   4. Utilizzare un microscopio ottico invertito per verificare la confluenza (circa il 90%) e una condizione generale dei monostrati. Non procedere se le celle sono galleggianti o sembrano stressate.
2. Colorazione immunofluorescente
   NOTA: Le celle possono essere macchiate con un protocollo di scelta. Qui, l'immunofluorescenza è stata eseguita come descritto in precedenza⁴.
   1. Per l'analisi dell'adesione focale, macchiare le cellule con una proteina di adesione focale di scelta (in questo protocollo paxillin). Per l'analisi della forma cellulare macchia con proteina di giunzione cellula-cellula di scelta (in questo protocollo plakoglobin a proteine desmosomiche).
   2. Per la procedura, utilizzare 0,5 mL di soluzioni specificate, se non diversamente specificato.
   3. Fissare le cellule nel 4% formaldeide in PBS per 30 min sul ghiaccio.
   4. Incubare con cloruro di ammonio da 0,1 m (in PBS) per 10 minuti per dissondare l'auto-fluorescenza.
   5. Aggiungere 0,5% Triton X-100 (in PBS) per 30 min (permeabilization).
   6. Blocco con 5% di latte (o 1% BSA) in TBS-T per 1 h.
   7. Incubare con anticorpo primario a 4 gradi durante la notte (anti-paxillina: coniglio, 1:250, anti-plakoglobin: coniglio, 1:400)
   8. Incubare con anticorpo secondario per 30 min (Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio, 1:500, 1:500)
   9. Macchie con 300 nM DAPI per 1-5 min, protetti dalla luce.
      NOTA: Facoltativamente, può essere eseguita un'ulteriore colorazione dell'atto con coniugati di faloidina fluorescente (conc. 1:400); phalloidin deve essere aggiunto nello stesso passaggio dell'anticorpo secondario.
3. Immagini confocali
   1. Prendere le immagini di singole fette di z utilizzando un microscopio confocale (ad es., l'isola lsM800).
      NOTA: la colorazione dell'atto opzionale può aiutare a valutare il piano focale corretto. La colorazione dell'attrattiva corticale è presente nella regione apicale, mentre le fibre di stress di actina sono presenti nella regione basale, vicino al substrato, come illustrato nella figura 1.
   2. Imaging adeno focale
      1. Scegliete le sezioni z per l'analisi dell'adesione focale dalla regione basale, vicino al substrato.
      2. Utilizzare un obiettivo con l'apertura numerica più alta disponibile (preferibilmente 63x N.A.: 1.4).
         NOTA: La forma di FA è molto specifica e facilmente riconoscibile. Pertanto, si consiglia di avviare la scansione da un piano focale sotto le cellule e quindi lentamente la scansione verso di loro, fino a quando le FA non sono chiaramente visibili. L'analisi delle immagini sarà più accurata da campi di visione più piccoli, che tendono ad essere più uniformi, ma ciò implica che verrà calcolato un numero inferiore di celle in un unico campo visivo.
   3. Creazione di contatti con celle a celle
      1. Utilizzare un obiettivo 40x o 63x.
      2. Selezionare i canali per la colorazione nucleare e la colorazione proteica di giunzione preferita.
      3. Scegliete le sezioni z per l'analisi della forma delle celle dall'area apicale dei monostrati.
      4. Scattare foto per almeno 3 diversi campi di visione (200-400 celle).

2. Analisi dell'immagine

NOTA: le macro fornite funzionano in modo ottimale su ImageJ versione 1.50f o successiva. Utilizzare per la quantificazione solo di immagini con un elevato rapporto segnale-rumore e senza pixel sotto o sovrasatura. I metodi descritti includono passaggi che richiedono la regolazione manuale dei parametri. Pertanto, si consiglia un'analisi cieca/impostazione di esperimento cieco. Per crittografare i nomi dei file di immagine, è possibile utilizzare plugin ImageJ come "Blind Analysis Tool" (disponibile all'indirizzo: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools).

1. Analisi dell'adesione focale
   NOTA: i file di input consigliati per i seguenti metodi sono: immagini di FU rappresentate in scala di grigi a 8 bit salvate in formato .tiff.
   1. Aprire l'immagine utilizzando ImageJ.
   2. Impostare la scala di un'immagine su pixel (Analyze Imposta scala; Rimuovi Scala e controlla Globale opzione).
   3. Includere il nome del file e l'area del ROI nelle opzioni di misurazione (Analyze Imposta misure...); selezionare Opzioni area e Visualizza etichette.
   4. Sottrarre lo sfondo (Processo Sottrai sfondo; impostare il parametro Raggio della palla rotante su 50 pixel; controllare l'opzione paraboloide scorrevole). Nel caso di immagini RGB pseudocolorate: dividi canali RGB, lascia il canale con le FA aperte, chiudi i canali rimanenti (Immagine Proprietà Color (Colore) Dividi canali).
   5. Determinare l'area dell'area di interesse più piccola (ROI). L'utilizzo di selezioni a mano libera o poligono delinea la più piccola adesione focale singola e ne misura l'area(Analyze Misura). Ripetere questo passaggio per diverse ROI (FU) da alcune immagini scelte casualmente (per un totale di 20 ROI). Calcolare e salvare la media dei risultati ottenuti.
      NOTA: questo passaggio è necessario solo quando un determinato set di immagini viene analizzato per la prima volta (linea cellulare specifica, rivestimento diapositive con specifici componenti di matrice extracellulare, diverse condizioni di coltura).
   6. Convertire l'immagine in binario utilizzando uno dei seguenti metodi:
      1. Impostare la soglia globale (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Soglia; selezionare Le opzioni Predefinito, B&W e Sfondo scuro, regolare la soglia manualmente o impostarla automaticamente).
      2. Impostare la soglia locale (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Soglia locale automatica...; set Metodo su Phansalkar e controllare gli oggetti bianchi su sfondo nero opzione. Successivamente, invertire l'immagine (Modifica Inverti).
   7. Misurare il numero e l'area dei ROI. Selezionare Analizza . Analizzare le particelle; Selezionare Unità pixel, Visualizza risultati, Cancella risultati e Opzioni riepiloga ,impostare Parametro dimensione, come limite inferiore, utilizzare la media dei ROI più piccoli del passaggio 2.1.5. Il limite superiore può essere impostato al 25% di un'area cellulare tipica.
   8. Trasferire i dati (che includono il nome dell'immagine, il numero di FA, l'area totale e media di FA; rispettivamente Slice, Count, Total Area, Average Size) dalla finestra Riepilogo al programma di gestione dei dati scelto.
   9. Determinare il numero di cellule per immagine contando i nuclei macchiati DAPI. Il conteggio può essere fatto manualmente (Plugins Proprietà Analyze . Cell Counter) o come nei protocolli disponibili come: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
   10. In alternativa, per facilitare il conteggio delle fu, utilizzare la macro ImageJ associata (FAs.ijm).
       1. Spostare il file .ijm con la macro in plugin o nella cartella macro che si trova nelle cartelle dei file di origine di ImageJ.
       2. Determinare un'area del ROI più piccolo come descritto nel passaggio 2.1.4.
       3. Aprire il file di macro(Plugins Macros Modifica...).
       4. Prima di eseguire la macro impostare il valore di tre variabili: valore di riempimento di area_of_the_smallest_region_of_interest con un numero acquisito durante il passaggio 2.1.4. Impostare threshold_type valore su manuale o automatico.
       5. Salvare le modifiche (la macro deve essere pronta per l'uso).
       6. Chiamare la macro dal pannello ImageJ o creare una scorciatoia ad esso. La macro inizia con la finestra di dialogo aperta standard. Selezionare l'immagine da elaborare.
          NOTA: in caso di regolazione manuale della soglia, sarà necessaria la conferma manuale del valore di soglia (evitando di accettare le modifiche utilizzando il pulsante Applica nella finestra di dialogo Soglia, utilizzare invece la finestra di dialogo personalizzata Azione richiesta). I risultati ottenuti utilizzando la macro sono gli stessi descritti nel passaggio 2.1.8 (incluso nella finestra di dialogo Riepilogo). Inoltre, nel caso di regolazione manuale della soglia Livello soglia inferiore viene visualizzato in una finestra di dialogo Registro, come questo valore consente di riprodurre i risultati ottenuti in futuro, se necessario. Le figure supplementari S1 e S2 sono state incluse come set di dati di training per la macro FAs.ijm.
2. Analisi della forma delle celle
   1. Manuale
      1. Aprire un'immagine in ImageJ o in un altro software di elaborazione delle immagini con un set di funzioni simile (ulteriori istruzioni riguardano ImageJ). Scegliere i parametri da misurare selezionando dal menu Analisi . Impostare Misure e deselezionando i descrittori Forma nella casella visualizzata.
      2. Delinea manualmente i bordi delle cellule, contrassegnati da proteine di giunzione scelte, utilizzando l'icona Selezioni a mano libera. I parametri scelti vengono calcolati automaticamente per ogni cella. Memorizzare i risultati dopo aver delineato ogni cella facendo clic su Modifica Proprietà Selection . Aggiungi al gestore. Devono essere conteggiate solo celle complete interamente visibili, con bordi ininterrotti.
      3. Una volta delineate tutte le celle del campo visivo, effettuare la misurazione contrassegnando tutti i numeri visualizzati nella casella di sinistra di Gestione ROI (corrispondente alle celle) e facendo clic su Misura I risultati vengono visualizzati nella casella Risultati e possono essere trasferiti al foglio di calcolo preferito.
   2. Automatizzato
      NOTA: Per facilitare la quantificazione dei descrittori di forma cellulare (CSI, proporzioni, rotondità, solidità) è stata preparata e allegata una macro ImageJ (CSI.ijm). La macro si basa principalmente sul plugin ImageJ chiamato MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)⁵. La macro esegue i seguenti passaggi: 1) Estensione di ogni bordo dell'immagine di 10 pixel neri [MorpholibJ]; 2) Cicli di dilatazioni ed erosioni - filtro morfologico [MorpholibJ]; 3) Generazione di immagine binaria dei confini delle cellule per segmentazione morfologica [MorpholibJ]; 4) Dilatazione dei confini cellulari; 5) Inversione del valore dei pixel; 6) Generazione di selezioni e misurazione dell'area e del perimetro delle celle sull'immagine; e 7) Salvare l'immagine con le celle delineate e le selezioni del ROI ImageJ in un nuovo file.
      1. Spostare il file .ijm con la macro nella cartella plugins o macro che si trova nelle cartelle dei file di origine ImageJ. Chiamate la macro dal pannello ImmagineJ o fatevi una scorciatoia.
      2. Prima della quantificazione di un nuovo set di dati, determinare i valori delle aree più piccole e più grandi di interesse. Contorno (selezione a mano libera o poligono) alcuni (3-10) esempi delle celle più piccole e più grandi dell'immagine e quindi misurare la loro area (Analisi Misura).
      3. In alternativa, eseguire la macro con le impostazioni predefinite (il limite di dimensione inferiore è impostato su 0 e il limite superiore è impostato su infinito), attendere il completamento della macro e selezionare l'opzione Imposta i limiti delle dimensioni delle celle. Misurare l'area delle celle più piccole e più grandi facendo clic sulla relativa etichetta e quindi premere Misura in ImageJ ROI Manager. Impostare il valore delle variabili the_smallest_cell e the_biggest_cell. Salvare le modifiche, chiudere tutte le finestre di dialogo della macro ed eseguire nuovamente la macro.
         NOTA: la macro può essere utilizzata senza impostare i limiti delle dimensioni del ROI, ma non è consigliata perché aumenta in modo significativo la possibilità di misurare frammenti di cellule o cluster di cellule inappropriati.
      4. Avviare la macro con la finestra di dialogo Apri standard. Selezionare l'immagine da elaborare (gradazioni di grigio).
      5. Analizzare i risultati. L'output fornito dalla macro è costituito da: tabella dei risultati (etichetta della cella, etichetta immagine, area della cella [pixel^2],perimetro della cella [pixel^2],circolarità [CSI], proporzioni, rotondità, solidità), immagine con celle contornate e elenco selezioni del ROI (che verrà salvato anche nel nuovo file nella sottocartella Risultati). La tabella dei risultati verrà copiata automaticamente negli Appunti dell'utente.
         NOTA: le figure supplementari S3 e S4 sono state incluse come set di dati di training per la macro CSI.ijm.

3. Quantificazione

1. Quantificazione delle FA
   1. Calcolare il numero medio di cespiti e la dimensione media fa per cellula/nuclei.
      NOTA: per alcune linee cellulari è possibile contare le FU separatamente in celle distinte. Per le linee cellulari che hanno forti contatti cellulari e crescono come monostrati come MCF7, il numero e le dimensioni delle FA per cella possono essere calcolati dividendo i valori ottenuti da FA contando per il numero di nuclei nell'intera immagine.
   2. Valutare il significato statistico delle potenziali differenze tra le popolazioni (gruppi sperimentali). A seconda della distribuzione e della varianza dei dati, per il confronto dei due diversi gruppi utilizzare Student t-test (distribuzione normale) o non-parametrico U-test (Mann-Whitney). Per il confronto di più gruppi utilizzare unidirezionale ANOVA o Kruskal-Wallis in combinazione con i test post-hoc appropriati.
2. Analisi della forma delle celle
   1. Calcolo dei descrittori di forma
      1. Analisi manuale: Calcolare l'indice della forma della cella (CSI, chiamata anche circolarità o forma cellulare) nel foglio di calcolo di scelta per ogni cella misurata dall'area e dal perimetro appropriati utilizzando la formula:
         
         NOTA: CSI assume valori compresi tra 1 (circolare) e 0 (allungato). Gli esempi di varie forme di cella (con la stessa area) e le rispettive CSI sono presentati nella Figura 2. Nell'analisi automatizzata i valori dei descrittori di forma (inclusi e definiti di seguito) vengono calcolati automaticamente e visualizzati nella casella dei risultati:
         (1) CSI - 4om/area/perimetro)²
         (2) AR - Asse maggiore/asse minore
         (3) Rotondità - 4oarea / z (asse principale)²
         (4) Solidità : area/area convessa
   2. Istogrammi della distribuzione delle forme cellulari
      1. Tracciare la distribuzione della forma della cella come istogramma di circolarità (CSI). Classificare le celle in base al loro valore CSI (calcolato per un minimo di 200-400 celle), a uno dei dieci intervalli uniformi (intervallo: 0-1, larghezza del contenitore: 0,1). L'istogramma visualizza il numero di celle in ogni categoria.
         NOTA: l'istogramma che mostra la distribuzione della forma del tipico livello di cella MCF7 mostra un picco di circa 0,7-0,8 CSI. Se la forma delle cellule è distorta da qualche fattore (ad esempio il trattamento paclitaxel, che causa l'arresto di fase G2/M e in conseguenza più cellule sono rotonde) dovrebbe essere riflessa sull'istogramma.
   3. Grafici di distribuzione cumulativi
      1. Confrontare le distribuzioni CSI cumulative per ogni linea cellulare, perché è il modo migliore per valutare le differenze statisticamente importanti nei cambiamenti di forma delle cellule (o qualsiasi altro cambiamento nella distribuzione. Ad esempio, può essere applicato per tenere traccia della distribuzione mutevole delle FA.
      2. Calcolare la funzione di distribuzione cumulativa (CDF) per confrontare le distribuzioni. CDF assegna per un determinato valore CSI (stampato sull'asse X) la percentuale (o conteggio relativo) per la quale tutti i valori sono minori o uguali a questo valore CSI (stampato sull'asse Y). Pertanto, man mano che il valore CSI aumenta, anche la percentuale del set di valori minori o uguali a questo valore diventa più alta. CDF può essere calcolato dal software statistico di scelta, o manualmente.
      3. Per l'analisi statistica, utilizzare Kolgomorov-Smirnov test non parametrico.

Results

Analisi dell'adesione focale
L'abbattimenti del gene HAX1 è stato precedentemente dimostrato che influisce sulle aderene focali⁶. Le cellule sono state coltivate sulla superficie rivestita di collagene I per 48 h. Le immagini delle cellule di controllo MCF7 e MCF7 con un knockdown HAX1 (HAX1 KD) da tre esperimenti indipendenti macchiati con la colossione della proteina aderente paxillin sono stati ottenuti utilizzando un microscopio confocale (immagin...

Discussion

L'adesione cellulare e substrato cellulare costituiscono attributi intrinseci delle cellule epiteliali e svolgono il ruolo critico nella morfogenesi dei tessuti e nell'embriogenesi. Nei tessuti adulti la corretta regolazione delle proprietà meccaniche dello strato cellulare è cruciale per mantenere l'omeostasi e prevenire le risposte patologiche come la progressione del tumore e la metastasi. La dimensione e il numero di adere focali dipendono dalla forza dell'adesione delle cellule-substrato, mentre la forma cellulare d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	capra anti-coniglio, 1:500
Cloruro di ammonio	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Collagene da pelle di vitello	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), acido nucleico colorazione
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-glucosio, piruvato	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
cellulare di	placoglobina a giunzione	2309S	coniglio, 1:400
Armadio a flusso laminare classe 2	Equipaggiamento standard	Alpina
Linea cellulare >HAX1KD basata su MCF7	Linea cellulare stabilita nell'Istituto Nazionale di Oncologia, Varsavia, descritta in Balcerak et al., 2019		Linea cellulare MCF7 conHAX1knockdown
Linea cellulare MCF7 (CONTROLLO)	ATCC	ATCC HTB-22	epiteliale, linea cellulare aderente per carcinoma mammario
Microscopio ottico Olympus CK2	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	coniglio, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Coniugato falloidina-TRITC	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), marcatura dell'actina
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST ... NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Microscopio confocale	Zeiss