Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

Sommario

L'isolamento dei nuclei singoli si basa sulla dissociazione e sulla permeabilizzazione a base di detersivo della membrana cellulare, passaggi che necessitano di ottimizzazione e soggetti a introdurre artefatti tecnici. Dimostriamo un protocollo detergente e privo di enzimi per un rapido isolamento dei nuclei intatti direttamente dall'intero tessuto, producendo nuclei adatti per singolo nucleo RNA-seq (snRNA-seq) o ATAC-seq.

Abstract

Il trascrittoma ad alto contenuto di velocità e la profilazione dell'epigenoma richiedono la preparazione di una sospensione a singola cellula o a singolo nuclei. La preparazione della sospensione con cellule o nuclei intatti comporta la dissociazione e la permeabilizzazione, passaggi che possono introdurre rumore indesiderato e danni indesiderati. In particolare, alcuni tipi di cellule come i neuroni sono difficili da dissociare in singole cellule. Inoltre, la permeabilizzazione della membrana cellulare per rilasciare i nuclei richiede l'ottimizzazione da prova-ed-errore, che può richiedere tempo, lavoro intensivo e finanziariamente non vitale. Per migliorare la robustezza e la riproducibilità della preparazione dei campioni per il sequenziamento ad alto consumo, viene descritto un metodo di isolamento dei nuclei basati su colonne a colonne rapido e senza enzimi e detergenti. Il protocollo consente un efficiente isolamento dei nuclei dall'intero cervello del pesce zebra entro 20 minuti. I nuclei isolati mostrano una morfologia nucleare intatta e una bassa propensione all'aggregazione. Inoltre, la citometria di flusso consente l'arricchimento e l'autorizzazione dei nuclei dei detriti cellulari per l'applicazione a valle. Il protocollo, che dovrebbe funzionare su tessuti molli e cellule coltivate, fornisce un metodo semplice e accessibile per la preparazione dei campioni che può essere utilizzato per la profilazione ad alta velocità, semplificando le fasi necessarie per il successo di esperimenti di RNA-seq e ATAC-seq mono-nuclei.

Introduzione

RNA-seq unicellulare (scRNA-Seq) e ATAC-seq sono strumenti versatili per studiare sistemi biologici complessi a risoluzione cellulare singola. Sono ampiamente utilizzati per definire sottotipi e stati cellulari, reti geniche e per valutare l'eterogeneità cellulare. Un prerequisito per l'esecuzione di scRNA-seq è la preparazione di una sospensione a singola cellula mediante dissociazione tissutale. A causa della variazione nella composizione della matrice extracellulare e nelle proprietà meccaniche, i singoli tessuti richiedono l'ottimizzazione del protocollo di dissociazione per la preparazione della sospensione a cella singola.

La dissociazione dei tessuti in singole cellule prevede in genere il trattamento con enzimi digestivi, tra cui collagenasi, dispasi o trypsin, a 37 C^1,2^,2,4.⁴ Poiché le macchine trascrizionali rimangono attive a 37 gradi centigradi, la dissociazione enzimatica può introdurre artefatti di espressione mRNA e rumore^5,6. In particolare, l'incubazione prolungata può indurre geni che rispondono allo stress e risposta agli shock termici in modo non uniforme, portando alla variabilità tecnica nell'esperimento⁷.

Un altro inconveniente di generare una sospensione a una singola cella è la difficoltà di ottenere tipi di cellule vitali e intatti con morfologie complesse. In particolare, neuroni, adipociti e podociti sono difficili da isolare^8,9,10,11. Per esempio, Wu e colleghi hanno dimostrato l'assenza di podociti glomeriul nei profili scRNA da un rene di topo adulto¹². Simili osservazioni non ottimali sono state fatte per quanto riguarda il recupero di neuroni interconnessi dal tessuto cerebrale^8,13,14. In sintesi, i protocolli di dissociazione possono introdurre una distorsione di rilevamento verso più facile dissociare i tipi di cellule, portando a una falsa rappresentazione dell'architettura cellulare dell'organo.

Per superare il rumore tecnico e la distorsione introdotti durante la preparazione del campione in scRNA-Seq., l'isolamento e la profilazione del nucleo forniscono un'alternativa interessante. Poiché la morfologia nucleare è simile tra i diversi tipi di cellule, l'isolamento dei nuclei elude il problema dell'isolamento delle cellule intatte e vitali con morfologie complesse. Per esempio, Wu e colleghi hanno dimostrato di successo la profilazione dei podociti glomeriul con l'RNA-Seq. mononucleo (snRNA-Seq.) di un rene adulto di topo, che mancava da scRNA-Seq¹². Intrigantemente, studi comparativi tra RNA-seq a cellula singola e nucleo singolo hanno suggerito una diminuzione dell'induzione di stress e geni di risposta agli shock termici con snRNA-Seq¹². Gli studi suggeriscono inoltre un'elevata correlazione tra i geni rilevati dai due metodi. Tuttavia, un recente studio sulla microglia umana non è riuscito a rilevare l'attivazione genetica nella malattia di Alzheimer¹⁵. Così, in alcuni contesti, snRNA-Seq è un'alternativa adatta per scRNA-Seq^16,17. Inoltre, l'isolamento nucleare può essere utilizzato per ATAC-Seq. a cella singola, fornendo informazioni sulle regioni della cromatina aperta all'interno delle singole cellule.

Il protocollo per l'isolamento dei nuclei prevede tre fasi principali: i) lisi a base di detergente della membrana cellulare per rilasciare il nucleo; ii) omogeneizzazione dei tessuti utilizzando un omogeneizzatore Dounce; e iii) arricchimento dei nuclei e la rimozione dei detriti cellulari utilizzando la centrifugazione sfumata o la citometria di flusso^{18,19,20,21,22}. Tra questi, i primi due passaggi dipendono dal tipo di tessuto e devono essere ottimizzati empiricamente. Detergente delicato porta alla rottura parziale della membrana cellulare e recupero inefficiente dei nuclei dal tessuto²³. D'altra parte, l'alto livello di detersivo e l'omogenesi dura porta alla rottura della membrana nucleare e la loro perdita^24,25. I nuclei rotti tendono ulteriormente a raggrupparsi e a formare aggregati, che se non rimossi possono portare a artefatti nell'esperimento di profilazione a valle.

Per aggirare i problemi legati all'ottimizzazione del detersivo per l'isolamento dei nuclei, introduciamo un protocollo per isolare i nuclei intatti da campioni freschi utilizzando un metodo senza detersivo e basato su spin. Il protocollo fornisce nuclei da intero organo entro 20 minuti, limitando l'induzione della trascrizione artifactuali. I nuclei isolati possono essere arricchiti con FACS per singolo nuclei RNA-Seq. e ATAC-seq, fornendo un metodo semplice e universale che consente una profilazione robusta e riproducibile ad alta produttività.

Protocollo

Tutte le procedure presentate di seguito sono state eseguite in conformità con le linee guida e regolamentari nazionali in materia di etiche e di benessere degli animali, approvate dal comitato etico per il benessere degli animali (CEBEA) dell'Université Libre de Bruxelles (protocolli 578N-579N).

1. Preparazione prima della dissezione tissutale

1. Preparare la soluzione di Tricaina allo 0,2% in PBS per l'eutanasia del pesce zebra. Raffreddare la soluzione sul ghiaccio.
2. Preparare una piastra Petri da 30 mm per la maciacquatura del tessuto.
3. Preparare ghiaccio freddo 1x PBS (10 mL per campione di tessuto).
4. Raffreddare la centrifuga fino a 4 gradi centigradi.
5. Per l'isolamento dei nuclei, utilizzare un kit di isolamento nuclei privo di detersivo (Tabella dei materiali).
6. Prima di iniziare il protocollo, pre-freddo tampone A e B fornito nel kit mettendoli sul ghiaccio per almeno 30 minuti prima dell'isolamento.
7. Per la movimentazione dei nuclei isolati, rivestire i reagenti di plastica come tubi e punte di pipetta con una soluzione BSA del 5%. A tale scopo, preparare la soluzione sciogliendo 2 g di BSA in 40 mL di PBS. Il rivestimento di oggetti di plastica con il 5% di BSA riduce i nuclei che si attaccano alla plastica. Questo passo migliora il recupero dei nuclei isolati.
8. Coprire le punte della pipetta con la convogliatura del 5% della soluzione BSA 2-3 volte. Asciugare all'aria le punte per 2 ore. Preparare 10 punte di plastica per campione.
9. Rivestire i tubi per la raccolta dei nuclei riempiendoli del 5% di BSA. Invertire i tubi 3 volte per garantire un rivestimento efficiente. Rimuovere la soluzione e asciugare all'aria i tubi a testa in giù su una carta velina pulita per 2 ore. Per campione, rivestire un tubo di raccolta fornito nel kit. Inoltre, preparare tubi rivestiti da 1,5 mL per la raccolta dei nuclei dopo FACS.
   NOTA: Le punte di vetro sono altamente raccomandate alternativa alle punte delle pipette di plastica per ridurre al minimo l'attaccamento.

2. Dissezione del cervello del pesce zebra

1. Per l'eutanasia del pesce zebra, preparare un piatto Petri da 90 mm con 25 mL di soluzione Tricaine ghiacciata.
2. Con attenzione, prendere il pesce zebra dal serbatoio utilizzando una rete da pesca e metterlo nel piatto Petri.
3. Eutanasia il pesce lasciandolo in Tricaine per 5 min.
4. Decapitare l'animale con una lama affilata.
5. Usando le pinze, rompere delicatamente il cranio e rimuovere i tessuti molli, la pelle e le ossa dal lato ventrale e dorsale del cranio.
6. Trasferire delicatamente il cervello in un piatto fresco da 30 mm contenente PBS ghiacciato.
7. Mitolare il cervello in piccoli pezzi utilizzando una lama di rasoio per facilitare il caricamento del campione sulla colonna di spin.

3. Isolamento di singoli nuclei

1. Trasferire il tessuto macinato nella cartuccia del filtro fornita nel kit di isolamento dei nuclei e aggiungere 200 - L di tampone freddo A per sensibilizzare il tessuto. Macinare il tessuto utilizzando l'asta di plastica fornita dal kit per 2 min.
2. Aggiungere 300 l di tampone freddo A e incubare la cartuccia del filtro sul ghiaccio con il tappo aperto per 10 min.
3. Capovolsci la cartuccia e risospendi di nuovo il tessuto invertendo il tubo 5 volte.
4. Centrifuga a 16.000 x g per 30 s. In questa fase, le cellule vengono rotte quando passano attraverso il filtro e viene applicata la forza centrifuga ad alta velocità. Il flusso attraverso contiene nuclei intatti, che pellet nella parte inferiore del tubo.
5. Scartare il filtro e risospendere il pellet vortice vigorosamente per 10 s.
6. Pellet i nuclei centrifugando la soluzione a 500 x g per 3 min. Scartare il supernatante con attenzione come il pellet nuclei è incolore.
7. Risospendere il pellet in 0,8 mL di tampone freddo B e centrifugare a 600 x g per 10 min. In questa fase, i nuclei sono separati dai detriti della membrana. Il pellet incolore ottenuto contiene nuclei isolati.
8. Risospendere i nuclei isolati in 500 - L di PBS con 5% BSA. Mantenere le sospensioni dei nuclei sul ghiaccio per eseguire FACS dopo la quantificazione.

4. Visualizzazione della morfologia dei nuclei

1. Confermare la morfologia nucleare di colorazione Hoechst. Per questo, rimuovere 100 l di sospensioni mononuclei in un nuovo tubo utilizzando punte rivestite BSA. Per macchiare i nuclei, aggiungere 0,1 - L di Hoechst (1 mg/mL). Vorticare delicatamente il tubo.
2. Trasferire le sospensioni dei nuclei sul piatto inferiore in vetro per l'imaging.
3. Immaginare i nuclei utilizzando un microscopio a fluorescenza con impostazioni di eccitazione laser di lunghezza d'onda di 405 nm (Viola).

5. Arricchimento dei nuclei basato su FACS

1. Prima di eseguire FACS, filtrare i nuclei utilizzando un colino a cellule da 40 m in tubo rivestito BSA.
2. Diluire le sospensioni filtrate aggiungendo PBS con 5% BSA a un volume finale di 1.000 l.
3. Etichettare due tubi FACS con fondo rotondo come "controllo" e "macchiato". Il tubo di 'controllo' conterrà nuclei non macchiati, mentre il tubo "macchiato" avrà nuclei macchiati di Hoechst.
4. Trasferire 250 -L delle sospensioni dei nuclei nel tubo di 'controllo' utilizzando la punta di pipetta rivestita BSA.
5. Trasferire la soluzione restante di 750 l nel tubo FACS etichettato come "macchiato" e aggiungere 1-L di tosina Hoechst per macchiare i nuclei. Mescolare con vortice lento.
6. Caricare il campione di controllo non colorato nella selezionatrice di celle. Registra 5000 eventi.
7. Caricare i campioni macchiati e registrare 5000 eventi.
8. Disegnare porte FACS che consentono l'identificazione di singoli nuclei. I nuclei possono essere selezionati confrontando il segnale di fluorescenza Hoechst tra il controllo e il campione macchiato.
9. Smistare i nuclei Hoechst-positivi dal tubo colorato in nuovo tubo da 1,5 mL contenente 50 -L di PBS con 5% di BSA.
   NOTA: I nuclei isolati possono essere raccolti in un mezzo desiderato in base ai requisiti dell'applicazione a valle.

Risultati

--Il protocollo descritto sopra è stato utilizzato per generare sospensioni a singolo nucleo direttamente dal tessuto cerebrale del pesce zebra. L'isolamento richiede in genere 20 minuti ed evitare l'uso di detergente o enzima digestivo. Nella Figura 1,che può essere stampata per essere utilizzata per la guida, viene fornito uno schema che riepiloga i singoli passaggi del protocollo.

Figura 1: Schematico del metodo basato su spin-colonna senza detersivo per l'isolamento dei nuclei.
Rappresentazione grafica dei singoli passi eseguiti durante l'estrazione dei nuclei dal tessuto cerebrale del pesce zebra fresco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Visualizzazione della morfologia nucleare

Per la conferma qualitativa della morfologia nucleare, i nuclei isolati sono stati macchiati con Hoechst e visualizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza. I nuclei sono apparsi intatti, rotondi e ben separati (Figura 2). È importante sottolineare che l'aggregazione nucleare, segno di rottura della membrana nucleare, era assente.

Figura 2: Isolamento dei nuclei singoli dal cervello del pesce zebra.
Immagine di microscopia a fluorescenza dei nuclei macchiati di Hoechst che dimostrano la loro morfologia intatta. Barra della scala: 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Arricchimento basato su FACS dei nuclei intatti

L'arricchimento dei nuclei isolati e la rimozione dei detriti cellulari è stato eseguito dalla citometria di flusso attuando sulla presenza di un segnale di fluorescenza Di echst. Il segnale Hoechst è stato rilevato al momento dell'eccitazione con viola, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). Nuclei non statuati visualizzati fluorescenza di fondo (Figura 3A, Figura supplementare 1A), mentre i nuclei macchiati hanno mostrato forte segnale fluorescente (Figura 3B, Figura supplementare 1B). Come illustrato nella Figura 3C, i nuclei macchiati incontaminati e Hoechst erano ben segregati nel canale viola.

Figura 3: Nuclei isolati mostrano segnale fluorescente Hoechst forte e specifico nella citometria di flusso.
Grafici di istogramma per sospensioni singole nuclei che mostrano la distribuzione della colorazione Hoechst. Hoechst è entusiasta di viola, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). Il campione incontaminato (A) visualizza il segnale nell'intervallo di 10⁰-10^3,mentre i nuclei macchiati di Hoechst (B) emettono segnale nell'intervallo 10³-10^5. Una sovrapposizione dell'intensità della fluorescenza emessa da campioni incontaminati (grigi) e macchiati (blu) (C) dimostra una netta separazione tra le due popolazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare Figura 1: Strategia di gating della citometria di flusso per nuclei isolati. Trame di flusso rappresentative per sospensioni nuclei isolati. Nuclei isolati sono stati analizzati utilizzando scatter in avanti e Viola laser BV421 che eccita Hoechst a 405 nm. Il campione incontaminato (A) ha visualizzato il segnale BV421 nell'intervallo 10⁰-10^3. Su 13130 eventi, 141 eventi sono stati rilevati come singoli nuclei basati su FSC-A (1,07% del totale) e 0 eventi per nuclei non statuati basati sul segnale BV421 (0% del totale). I nuclei macchiati di Hoechst (B) visualizzavano il segnale BV421 nell'intervallo 10³-10^5. Su 50000 eventi, 2418 eventi sono stati rilevati come singoli nuclei basati su FSC-A (4,84% del totale) e 2414 eventi per i nuclei positivi di Hoechst sulla base del segnale BV421 (4,83% del totale). Clicca qui per scaricare questa figura.

Discussione

La profilazione del trascrittoma e dell'epigenoma a una risoluzione unicellulare ha rivoluzionato lo studio dei sistemi biologici. Gli studi sulla risoluzione di una singola cellula per un tessuto solido dipendono dalla dissociazione dell'organo in singole cellule o nuclei. La dissociazione è una procedura distruttiva che può introdurre artefatti tecnici, che possono impedire lo sviluppo di una rappresentazione accurata del sistema^5,6. Per esempio, la dissociazione enzimatica può danneggiare le cellule con morfologie complesse, come neuroni o podociti, e può indurre l'espressione di geni di stress e di risposta agli shock termici^7,12. Inoltre, l'uso di detersivo durante la dissociazione può rompersi la membrana nucleare e portare^{all'aggregazione 23,25}. Pertanto, ottimizzare la dissociazione per ottenere una singola cellula o la sospensione nucleiconda di altissima qualità è fondamentale per il successo degli esperimenti di profilazione ad alta produttività.

Qui, dimostriamo un metodo di isolamento dei nuclei detergenti e senza enzimi che consente l'estrazione di nuclei intatti dal cervello del pesce zebra in meno di 20 minuti. Il protocollo produce nuclei con morfologia tipica e robusta integrità (Figura 2). Da un singolo cervello di pesce zebra del peso di 6 mg, il protocollo produce un totale di 60.000 nuclei determinati da un conteggio di emocitometri. I nuclei isolati possono essere utilizzati per molteplici applicazioni a valle, tra cui snRNA-seq, ATAC-seq e immunostaining. I nuclei isolati possono includere la contaminazione incrociata da frazioni citoplasmiche, in particolare da componenti di reticolo endoplasmico e mitocondri. Per gli esperimenti di profilazione ad alto throughput, è fortemente raccomandata la distanza dei detriti cellulari, in particolare dei mitocondri. La citometria di flusso (Figura 3) fornisce un'opzione praticabile per la purificazione dei nuclei. In alternativa, il gradiente di saccarosio può essere utilizzato anche per la rimozione dei detriti.

Il protocollo è stato testato sulla ghiandola tiroidea del topo (dati non mostrati) e fornisce risultati simili al tessuto cerebrale del pesce zebra. Nel complesso, il protocollo fornisce un metodo robusto, riproducibile e universale per la preparazione di sospensioni a nucleo singolo, contribuendo a semplificare la logistica per esperimenti di profilazione ad alta produttività.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina sierica bovina (BSA)	Carl Roth	90604-29-8	Frazione di albumina V
Selezionatore cellulare	BD Biosciences		FACSAria III
Centrifuga	Sartorius	A-14C
Provette Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	22363204
Falcon (15 mL)	Corning	352096	Provette
Falcon (5 mL )	Corning	352052	Provette in polistirene a fondo tondo
Pinze fini	Strumenti di scienza fine	11295-10
Filtro cellulare Flowmi (40 μ m)	Sigma	BAH136800040
		B
Flacone in vetro (250 mL)	VWR	215-1593
Piatto con fondo in vetro	World Precision Instruments	FD3510-100	Piatto in fluoro 35 mm
Pipette Pasteur in vetro	VWR	612-1701
Portapipette in vetro	Carl Roth	388.1	Aiuto per il pipettaggio pi-pump 2500
Soluzione colorante per coloranti Hoechst		Abcam ab228551	Hoechst 33342
Kit di isolamento dei nuclei senza detergenti minuti	Invent Biotechnologies	NI-024
PBS (10X)	ThermoFisher	70011069
Petri dish (30 mm)	FisherScientific	11333704	Pyrex
Petri dish (90 mm)	Corning	758-10178-CS	Gosselin
Puntali per pipette	VWR	89079	10 μ L, 200 μ L, 1000 μ L
Pipette	Gilson	F167380	Pipetman
Lama di rasoio	Swann-Morton	7981809
Tricaina metano solfonato	Sigma	E10521
Macchina a vortice	Scientific Industries	SI-0236	Vortex-Genie 2