Monitoraggio simultaneo dell'elettrofisiologia wireless e del test comportamentale della memoria come strumento per studiare la neurogenesi ippocampale

Il test comportamentale è cruciale nella ricerca neuroscientifica per una grande quantità di informazioni generate in un contesto in vivo. A questo proposito, i ricercatori hanno ampiamente utilizzato diversi test comportamentali per analizzare la funzione sensoriale-motoria, le interazioni sociali, il comportamento ansioso e depressivo, la dipendenza da sostanze e varie forme di funzioni cognitive¹. La registrazione manuale dei test comportamentali potrebbe essere difficile, estenuante e imprecisa anche per gli osservatori più esperti. Anche se sono stati fatti alcuni sforzi per sviluppare software libero e open source per la registrazione del comportamento (ad esempio, l'app sexrat male² per il comportamento sessuale), diverse alternative consentono la registrazione comportamentale automatica e in tempo reale di diverse specie animali dal pesce³ ai roditori 4,5,6. Il tracciamento video è un metodo prezioso per la registrazione rapida e accurata del comportamento utilizzato in un'ampia varietà di applicazioni⁷. Una caratteristica più potenziale nell'area di registrazione comportamentale è quella di esplorare l'attività neurale durante la manifestazione comportamentale. La registrazione simultanea dell'attività neuronale (dalle singole cellule alle principali aree cerebrali) e dei compiti comportamentali potrebbe mostrarci come il cervello genera specifici modelli comportamentali⁸. I comportamenti sono una sequenza di componenti minori che potrebbero rivelare correlati tra l'attività neurale e i movimenti o le azioni. Se l'attività neuronale e i modelli comportamentali potessero essere registrati simultaneamente attraverso più scale temporali, potrebbero spiegare come ogni stato cerebrale sia correlato a ciascun particolare comportamento (per un esame più approfondito della registrazione comportamentale, vedi Datta et al., 2019 review⁸). Pertanto, la registrazione sincronizzata dell'attività comportamentale e neuronale alla scala desiderata (dai neuroni a vaste aree del cervello) è considerata uno strumento estremamente utile. Esistono diversi sistemi destinati a integrare le registrazioni comportamentali con altre misurazioni come l'attività neurale ^4,5.

Sebbene l'elettroencefalografia sia considerata una delle tecniche più utilizzate nel campo delle neuroscienze cliniche e di ricerca, la mobilità relativamente elevata, così come le dimensioni del dispositivo di registrazione EEG, rendono questa tecnica unica e impegnativa per il rilevamento in caso di modelli in vivo⁹. Alcune soluzioni a questo problema sono state sviluppate, ad esempio, l'uso di cavi e dispositivi girevoli che consentono agli animali di muoversi liberamente nell'arena. Tuttavia, i sistemi basati su cavi spesso impongono problemi per condurre studi, ad esempio, durante il trasferimento di un animale da una gabbia all'altra, si osserva un ostacolo o un impigliamento dell'animale con i cavi. Sono stati sviluppati dispositivi telemetrici per registrazioni elettrofisiologiche senza fili per aumentare la flessibilità della situazione di registrazione^10,11. Tuttavia, tali sistemi hanno mostrato notevoli limitazioni a causa del loro basso numero di canali di registrazione e delle basse frequenze di campionamento¹¹. In questo studio, abbiamo utilizzato un sistema wireless disponibile in commercio che invia segnali EEG dall'animale attraverso una connessione Wi-Fi con un sistema di roditori in movimento libero¹². L'apparecchio pesa 6 grammi e può sopportare fino a 16 canali registrati a 1 kSps. Questo sistema consente la registrazione EEG o spike nell'ambiente animale, con un disturbo ridotto, fungendo da soluzione economica rispetto ai tradizionali sistemi elettrofisiologici presenti sul mercato. Inoltre, abbiamo sincronizzato questi dati utilizzando un software di tracciamento video per fornire correlazione tra EEG e modelli comportamentali. Questa sincronizzazione avviene offline mediante allineamento e interpolazione di dati ed eventi in base ai timestamp generati da entrambi i sistemi e viene elaborata su MATLAB.

La neurogenesi adulta è definita come la proliferazione, la sopravvivenza e la differenziazione nei neuroni delle cellule appena generate nel giro dentato degli animali^13,14. Questo processo è noto per essere associato al miglioramento della memoria e dell'apprendimento che aumenta la neurogenesi adulta nei roditori attraverso condizioni di ambiente arricchito (EE)¹⁵. L'EE consiste nell'ospitare i roditori in piccoli gruppi all'interno di una grande gabbia dotata di giocattoli e tubi, dove gli animali hanno una rilevanza biologica nuova e complessa¹⁵. Sebbene l'EE stimoli la neurogenesi ippocampale, varia anche in molti fattori come l'età, il ceppo animale, le condizioni di stimolazione specifiche o la procedura di rilevamento della neurogenesi. Nei topi di mezza età esposti all'alloggiamento EE per sette giorni, è stata riportata la nascita di nuove cellule granulari (GC) nel giro dentato dell'ippocampo (DG)¹⁶. Studi che tentano di ablare selettivamente la neurogenesi adulta in ratti adulti hanno suggerito che sono necessarie nuove cellule granulari di circa 1 - 2 settimane di età nella risposta appresa¹⁷. Circa 2 o 3 settimane dopo la nascita dei GC negli adulti DG, iniziano a comparire diversi segni caratteristici come le spine dendritiche, che sono essenziali per la trasmissione sinaptica eccitatoria¹⁸. Zhao et al. hanno eseguito un'analisi quantitativa per dimostrare che il picco di crescita della colonna vertebrale si verifica durante le prime 3 - 4 settimane¹⁹. Diversi studi elettrofisiologici in vivo suggeriscono che solo tre settimane di condizioni abitative EE producono alterazioni nella trasmissione sinaptica della DG e aumentano l'eccitabilità cellulare²⁰. Inoltre, è stato riportato che l'esposizione a un ambiente arricchito a 1-4 settimane dopo le iniezioni di BrdU ha aumentato significativamente la densità delle cellule BrdU / NeuN nello strato granulare DG nei topi²¹. Questi autori suggeriscono che esiste un periodo critico tra una e tre settimane dopo l'esposizione all'EE poiché è stato osservato un sostanziale aumento del numero di nuovi neuroni²¹. Gli studi sulla neurogenesi ippocampale adulta (AHN) negli esseri umani sono stati controversi poiché non vi erano prove dirette. Tuttavia, un recente rapporto ha descritto le fasi di sviluppo dell'AHN nel cervello adulto umano, identificando migliaia di neuroni immaturi nella DG e dimostrando così l'importanza dell'AHN durante l'invecchiamento negli esseri umani²². Sulla base delle prove menzionate in precedenza, lo studio dell'AHN nei modelli animali è più importante che mai (per un esame più approfondito dell'AHN, vedi Leal-Galicia et al., 2019 review¹⁵).

Come accennato in precedenza, l'ippocampo è stato collegato a una funzione fondamentale nelle capacità di apprendimento e memoria. La formazione delle memorie passa attraverso tre processi distinti: codifica (acquisizione della memoria), consolidamento (memorizzazione della memoria) e recupero (riconoscimento della memoria)²³. La memoria di riconoscimento negli esseri umani viene testata utilizzando l'attività di confronto visivo accoppiato²⁴. I fondamenti dei modelli umani e animali di memoria e amnesia sono i test comportamentali che valutano la capacità di riconoscere uno stimolo precedentemente presentato^25,26, come fa il compito di confronto visivo accoppiato negli esseri umani. Pertanto, uno dei test comportamentali più utilizzati per valutare la capacità di un roditore di riconoscere uno stimolo precedentemente presentato, vale a dire la capacità di apprendimento e memoria è il compito spontaneo di riconoscimento di nuovi oggetti (NORT)^23,27. Il protocollo NORT consiste in due nuovi oggetti identici in un'arena familiare per 10 minuti nella prova di acquisizione. Dopo un tempo specifico compreso tra 0 28 e⁴⁸ ore²⁹ (tempo variabile secondo ciascun protocollo), l'animale viene riportato nella stessa arena contenente uno degli stessi oggetti familiari e un oggetto nuovo. L'animale esplora spontaneamente il nuovo oggetto se l'oggetto familiare è stato memorizzato²⁶. Il rapporto di preferenza è comunemente usato nella valutazione delle prestazioni di esplorazione. È determinato dividendo il tempo totale di esplorazione dell'oggetto dal tempo di esplorazione del nuovo o dell'oggetto familiare. Il NORT presenta alcuni vantaggi rispetto ad altri test di memoria di riconoscimento. Soprattutto, non richiede alcuna motivazione esterna, ricompensa o punizione. Non genera condizioni stressanti. Infine, non è necessario alcun addestramento per evocare il comportamento dell'esplorazione degli oggetti (per un esame più approfondito del NORT, vedi ^ref.23).

Pertanto, la registrazione simultanea di più modalità di dati e la loro integrazione nello studio dell'apprendimento e della memoria, come effetto della neurogenesi ippocampale adulta, è molto attraente e fornisce una soluzione convincente per i ricercatori del settore. Il presente lavoro esporrà tutti i processi coinvolti nella valutazione simultanea del video-tracking comportamentale (nuovo compito di riconoscimento degli oggetti) e nella registrazione elettroencefalografica wireless. Qui abbiamo esaminato il processo di produzione degli elettrodi, la chirurgia di impianto degli elettrodi epidurali (vite cranica), il protocollo di arricchimento ambientale (per l'induzione della neurogenesi ippocampale), seguendo il protocollo NORT, la configurazione BTS, l'accoppiamento EEG - BTS per il monitoraggio simultaneo in tempo reale e l'analisi dei dati EEG e comportamentali eseguita sull'ambiente informatico MATLAB.

Tutte le procedure seguono la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (NIH Publications N°. 8023, rivista nel 1978) implementata dalle istituzioni sanitarie nazionali e dalle leggi locali messicane per ridurre il numero di animali utilizzati per il benessere degli animali e proibire la sofferenza degli animali. Il Comitato Etico dell'Universidad Iberoamericana ha approvato i protocolli sperimentali per l'uso di animali in questo studio.

1. Configurazione generale

1. Installare il software di monitoraggio comportamentale su un computer in base alle istruzioni di produzione.
2. Montare la fotocamera direttamente sopra il dispositivo, in modo che sia rivolta verso il basso. La fotocamera deve essere collegata al computer.
3. Installare il software del driver richiesto dalla fotocamera (seguendo le istruzioni di produzione).
4. Se la fotocamera include un obiettivo zoom, regolarli per adattarli perfettamente al display della fotocamera.
5. Disattivare la modalità di messa a fuoco automatica (AF) della fotocamera seguendo il software di produzione.
6. Assicurarsi che la fotocamera funzioni correttamente in tempo reale e testare la modalità di acquisizione video fino a quando non è pronta per l'uso.

2. Protocollo di arricchimento ambientale (vedi figura 1)

NOTA: Per questo esperimento sono stati utilizzati ratti Wistar maschi di tre mesi e sono stati mantenuti in condizioni naturali di luce scura.

1. Posizionare la lettiera di segatura in un'arena quadrata acrilica trasparente (500 x 500 x 500 mm).
2. Metti tre diversi tipi di giocattoli nell'arena con cui i roditori possono interagire (ad esempio, ruote di attività, doppio ponte, scale, ecc.).
3. Aggiungi quattro tubi in PVC opaco grigio da 2 pollici e quattro curvi.
4. Fornire ai distributori di cibo e acqua l'accesso ad libitum agli animali.
5. Posizionare tre roditori per gabbia all'interno della stanza del vivaio in condizioni regolari.
6. Lasciare gli animali in questa arena per il tempo richiesto secondo il protocollo corrispondente. In questo esperimento, gli animali dovrebbero rimanere all'interno dell'arena per 20 giorni.
   NOTA: Dopo l'intervento chirurgico di impianto dell'elettrodo, gli animali non tornano al trattamento di arricchimento ambientale. Invece, sono stati messi in gabbie singole fino al completamento del nuovo test di riconoscimento degli oggetti.

3. Processo di produzione degli elettrodi

1. Tagliare un pezzo di filo di rame a circa 2 cm e utilizzare una carta vetrata per strofinare circa 0,5 cm da ciascuna estremità.
2. Arrotolare un'estremità del filo di rame sulla testa di una vite di piccole dimensioni (elettrodi) e assicurarsi che sia saldamente fissata poiché questo è un passaggio cruciale. Il corretto contatto tra i due materiali deve essere garantito per evitare artefatti nei segnali EEG.
3. Inserire l'altra estremità sulla punta terminale del connettore e assicurarsi che sia fissata correttamente rinforzando con una pinza fine. Questa punta dovrebbe essere collegata con un cavo amplificatore.
4. Misurare la conduttività adatta dalla punta alla vite utilizzando un multimetro. Questo processo garantisce che la connessione dell'elettrodo sia installata correttamente.

4. Chirurgia di impianto di elettrodi epidurale (vite cranica)

NOTA: Dopo 20 giorni di trattamento di arricchimento ambientale, gli animali saranno sottoposti ad intervento chirurgico seguendo la procedura descritta di seguito:

1. Iniettare un cocktail di Ketamina/Xilazina (90/10 mg/kg, i.p.) all'animale.
   NOTA: Per evitare l'ostruzione delle vie aeree, attendere che il ratto smetta di muoversi, quindi estrarlo dalla gabbia dell'alloggiamento e posizionare l'animale su una superficie piana. Iniettare un antinfiammatorio non steroideo (meloxicam 1 mg/kg, s.c.) e un antibiotico (enrofloxacina 2,5 mg/kg, p.o.) come analgesia preventiva.
2. Una volta che il ratto è completamente anestetizzato, radere l'area della testa del ratto.
   NOTA: Assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato prima di continuare con l'intervento. Pizzicare con attenzione una delle gambe o la coda. Se l'animale reagisce allo stimolo, aspetta ancora qualche minuto e pizzicalo di nuovo. Se l'animale non reagisce al pizzico, vai al passaggio successivo. Se l'attrezzatura richiesta è disponibile, l'uso dell'anestesia gassosa (come l'isoflurano) è altamente raccomandato, in quanto è più facilmente titolato per sicurezza.
3. Posizionare l'animale sull'apparato stereotassico fissando prima entrambe le orecchie con le barre auricolari (fare attenzione a non ferire l'orecchio interno dell'animale). Infine, posizionare i denti anteriori sopra la barra del morso e fissare la barra del naso.
   NOTA: Fornire all'animale una piastra riscaldante per tutto l'intervento chirurgico poiché l'anestesia utilizzata in questa procedura di solito causa ipotermia e problemi respiratori.
4. Pulire la parte superiore della zona della testa utilizzando tre cicli alternati di clorexidina o scrub a base di iodio seguiti da risciacquo salino o alcool.
5. Somministrare lidocaina per via sottocutanea (20 mg/ml) sotto la cute della zona della testa (0,5 ml).
6. Instillare una goccia di soluzione oftalmica o salina agli occhi di ogni animale ogni 5-10 minuti per aiutarli a non seccarsi.
7. Usando un bisturi, praticare un'incisione di circa 2 cm dalla direzione anteriore a quella posteriore per esporre correttamente la regione superiore del cranio.
8. Ritrarre la pelle usando morsetti bulldog e raschiare il tessuto sovrastante il cranio.
9. Identificare e registrare le coordinate bregma ottenute.
10. Partendo da Bregma, utilizzando gli stereotassici Paxinos e Watson Atlas³⁰, individuare e segnare la posizione di ciascuno dei sette punti (coordinate) in cui verranno fissati gli elettrodi.
    NOTA: In questo esperimento, viti F3, F4 (+2,0 mm da Bregma, 2,25 mm lateralmente dalla linea mediana); Viti C3, C4 (−3,0 mm da Bregma, 2,75 mm lateralmente dalla linea mediana); e sono state installate viti P3, P4 (-7,0 mm da Bregma, 2,75 mm lateralmente dalla linea mediana). Una settima vite era situata posteriormente all'osso nasale (NZ), come riferimento di terra (vedi Figura 2).
11. Utilizzando uno strumento trapano a velocità variabile, praticare un foro con una punta di dimensioni 2 (lunghezza 44,5 mm) su ciascuno dei segni, fare attenzione a non penetrare completamente nel cranio.
12. Inserire l'elettrodo nel foro e avvitarlo nel cranio con attenzione.
13. Ripetere i punti 4.10 e 4.11 fino a quando tutte e sette le viti sono fissate correttamente.
14. Fissare tutte e 7 le viti con un primo strato di cemento dentale. Inserire ciascun elettrodo in un connettore. Coprire interamente i fili con un secondo strato di cemento dentale (impedirà all'animale di staccare le viti) e il fondo del connettore. Se necessario, coprire con un terzo strato di cemento dentale, lasciando pulito il connettore EEG per una corretta connessione, in modo che il dispositivo EEG possa essere collegato in modo appropriato (vedere Figura 3).
    NOTA: Dopo aver posizionato ogni coppia di viti bilaterali, queste potrebbero essere fissate con cemento dentale (passaggio opzionale).
15. Lasciare il ratto in cura post-operatoria durante la notte. Osservare l'animale e fornire all'animale una piastra elettrica per 1-2 ore dopo l'intervento chirurgico poiché l'anestesia utilizzata in questa procedura di solito causa ipotermia e problemi respiratori.
16. Somministrare 50mL/kg/24h (dose di mantenimento) di soluzione salina per via sottocutanea per prevenire la disidratazione. Iniettare un antinfiammatorio non steroideo (meloxicam 2 mg/kg, s.c.) e un antibiotico (enrofloxacina 5 mg/kg, p.o.) dopo l'intervento chirurgico e per le successive 24 ore.
17. Dopo l'intervento chirurgico, tenere i ratti in gabbie singole per il pieno recupero durante sette giorni prima di condurre i test comportamentali.
18. Manipolare delicatamente l'animale su base periodica (almeno una volta al giorno) per aiutare a ridurre lo stress nelle manipolazioni future. Mentre si tiene il topo con una mano, la pressione delle dita viene applicata delicatamente alla parte posteriore dell'animale, facendo scorrere le dita attraverso la pelliccia. Controllare la ferita alla testa, le condizioni di salute, il comportamento in generale e il peso corporeo per un periodo di una settimana dopo l'intervento.
    NOTA: Se nell'animale si riscontrano anomalie o segni di malattia/stress, informare il medico veterinario responsabile. Dopo questo periodo, eseguire il test di riconoscimento degli oggetti Novel e la tecnica di registrazione EEG.

5. Nuovo test di riconoscimento degli oggetti (NORT)

NOTA: Sette giorni dopo l'intervento chirurgico, procedere ai test comportamentali. Tutte le procedure comportamentali, nell'esperimento presentato, sono state eseguite tra le 14 h 00 min e le 16 h 00 min, che corrisponde al ciclo di luce del ratto.

1. Posizionare un giubbotto in tessuto morbido (a cui verrebbe posizionato il dispositivo EEG durante il test comportamentale) sul ratto. Consentire l'assuefazione per 2-3 giorni prima di condurre il test comportamentale.
2. Posiziona un'arena quadrata acrilica nera (500 x 500 x 500 mm) in una sala di registrazione illuminata con luce fioca.
3. Fissa due nuovi oggetti identici al centro del pavimento dell'arena usando del nastro biadesivo (per impedirne lo spostamento da parte degli animali). Gli oggetti devono essere equidistanti l'uno dall'altro e dalle pareti dell'arena.
4. Pulire accuratamente ogni oggetto in anticipo con etanolo al 50%, così come il pavimento dell'arena dopo ogni prova (per evitare segnali olfattivi).
   NOTA: Trasferire sempre gli animali nelle stanze di alloggio (dalla sala del vivaio alla sala sperimentale) almeno mezz'ora prima di iniziare ogni sessione. Dopo aver completato la sessione di registrazione, lasciare gli animali nella stanza sperimentale per un'altra ora. Questo per evitare lo stress che potrebbe influire sull'esecuzione di questo test.
5. Collegare il dispositivo EEG, prima di iniziare ogni test. Trattenere delicatamente l'animale e inserire saldamente il cavo al connettore sulla testa dell'animale con il kit EEG collegato alla schiena dell'animale (vedere Figura 4). È consentita una sola posizione.
   NOTA: Una delicata manipolazione precedente dell'animale potrebbe aiutare a ridurre lo stress negli animali durante la procedura di connessione. In caso contrario, aumenta il rischio di danni al dispositivo o agli animali. Precaricare completamente la batteria del dispositivo utilizzando una porta USB.
6. Nuove fasi dei test di riconoscimento degli oggetti
   1. Assuefazione: maneggiare l'animale a intervalli di 5 minuti per due giorni consecutivi e, subito dopo, posizionare l'animale sull'arena (senza oggetti) e consentire loro di esplorare per 10 minuti liberamente.
      NOTA: Prima di eseguire qualsiasi sessione di test di acquisizione e memoria, i ratti sono stati maneggiati con cura e collegati al dispositivo EEG corrispondente, che è stato correttamente fissato prima di iniziare il test.
   2. Sessione di acquisizione: posiziona l'animale sull'arena di fronte a una delle pareti opposte agli oggetti. Consenti agli animali di esplorare liberamente per 10 minuti. Vai al passaggio 6.13 per la registrazione di prova utilizzando il software di tracciamento comportamentale.
      NOTA: Assicurarsi che il dispositivo EEG tenga correttamente il giubbotto attaccato alla parte posteriore del ratto (per garantire il corretto monitoraggio dell'animale). Per un ulteriore rinforzo, utilizzare il nastro adesivo.
   3. Test di memoria a breve termine (SMT): sostituire uno degli oggetti con qualsiasi altro completamente diverso per forma, colore e consistenza. Posizionare l'animale, 2 ore dopo la sessione di acquisizione, nell'arena di fronte a una delle pareti opposte agli oggetti. Lascia che l'animale esploda liberamente per 10 minuti. Vai al passaggio 6.13 per la registrazione di prova utilizzando il software di tracciamento comportamentale.
   4. Test della memoria a lungo termine (LMT): sostituire l'oggetto utilizzato con qualsiasi altro completamente diverso per forma, colore e consistenza dal test della memoria a breve termine. Posiziona l'animale 24 ore dopo la sessione di acquisizione, nell'arena di fronte a una delle pareti opposte agli oggetti. Consenti all'animale di esplorare liberamente per 10 minuti Vai al passaggio 6.13 per la registrazione del test utilizzando il software di tracciamento comportamentale.

6. Configurazione del software di monitoraggio comportamentale

1. Apri il software di monitoraggio comportamentale.
2. Accedi all'account utilizzando l'utente e la password dell'istituto.
3. Apri il rubinetto "Nuovo esperimento vuoto" e scegli un nome per il protocollo (ad esempio, "NORT").
4. Seleziona "Modalità di tracciamento video".
   NOTA: in questo esperimento, la videocamera è configurata per trasmettere in streaming il tracciamento video in diretta. Tuttavia, c'è un'opzione aggiuntiva per selezionare i video preregistrati.
5. Vai su "Apparato." Definisci l'area dell'arena regolando il rettangolo arancione ai limiti dell'arena proiettata. Determina la regione dell'oggetto, adattando i cerchi arancioni al bordo degli oggetti all'interno dell'arena proiettati dalla telecamera sullo schermo.
6. Impostate la linea del righello in movimento della scala in una posizione lungo la lunghezza nota dell'immagine (l'arena). Immettete la lunghezza dell'oggetto in millimetri nell'opzione "La lunghezza della riga del righello è" nel pannello Impostazioni. In questo caso, l'arena misura 500 x 500 mm.
7. Vai a "Monitoraggio e comportamento". Continua con "Zone". Fare clic sul menu "Aggiungi elemento" e selezionare "Nuova zona". Seleziona l'area dell'arena e assegna un nome alla nuova zona (ad esempio, "Campo").
8. Ripetere il passaggio precedente con l'area degli oggetti e assegnare un nome alla nuova zona (ad esempio, "Oggetti").
9. Vai su "Colore animale" e seleziona l'opzione "Gli animali sono più chiari dello sfondo dell'apparato".
   NOTA: per questo esperimento sono stati utilizzati ratti bianchi (Wistar). Tuttavia, il software ha opzioni aggiuntive per i ricercatori che usano ratti neri e maculati. Entrambe le razze di animali possono essere utilizzate nello stesso esperimento.
10. Vai su "Monitoraggio della testa e della coda dell'animale" e seleziona "Sì, voglio che la testa e la coda dell'animale vengano monitorate".
11. Vai a "Test" | "Fasi" e dal menu "Aggiungi elemento", seleziona "Nuova fase". Assegna alla nuova fase il nome "Acquisizione". Definire la durata della fase (ad esempio, 600 s).
12. Ripetere il passaggio precedente delle fasi "Test della memoria a breve termine" e "Test della memoria a lungo termine".
    NOTA: In questo protocollo, tutte le fasi hanno la stessa durata (10 min).
13. Vai a "Procedure". Definire gli eventi da tenere traccia per ogni fase (acquisizione, test della memoria a breve termine e test della memoria a lungo termine).
14. Inizia il test (con ogni animale). Vai su "Test" (nella barra dei menu in alto) e seleziona "Aggiungi un test (+)". Assegnare un numero per l'animale da testare (ad esempio, "1").
15. Seleziona "Registra" e assegna un nome agli animali e alla sessione (ad esempio, "M1 Acq").
16. Prima di posizionare l'animale nell'arena, fai clic una volta sul pulsante "Riproduci". Verrà visualizzato il messaggio "in attesa di iniziare".
17. Dopo aver posizionato l'animale nell'arena, fai clic una seconda volta sul pulsante "Riproduci". Il test inizierà e terminerà automaticamente.
18. Ripetere i passaggi 6.13-6.16 per il test della memoria a breve termine (2 ore dopo la sessione di acquisizione) e il test della memoria a lungo termine (24 ore dopo la sessione di acquisizione).

7. Configurazione del dispositivo di elettrofisiologia wireless

1. Collegare il modem a un host del PC e accenderlo. Spegnere qualsiasi altro dispositivo di rete sul PC. Preferibilmente, silenziare qualsiasi altra comunicazione wireless nella sala di registrazione come Bluetooth, telefoni cellulari, altri modem o persino telefoni wireless.
2. Collegare l'amplificatore alla schiena del ratto, come indicato al punto 5.5.
3. Accendere il dispositivo EEG collegando la batteria.
   NOTA: 2 s dopo aver collegato il dispositivo, un led rosso sull'amplificatore EEG lampeggerà, indicando che la comunicazione con il modem è attiva, quindi il led verde verrà acceso. Se la comunicazione ha esito positivo, i LED sul modem inizieranno a lampeggiare continuamente. L'amplificatore è ora pronto per inviare informazioni al modem.
4. Avviare il software EEG e configurarlo in base alle istruzioni del produttore per integrarlo nel dispositivo di acquisizione EEG wireless
5. Premere il pulsante "Start Display". Il software EEG visualizzerà l'effettiva acquisizione del segnale.
   NOTA: utilizzare "Task Manager di Windows" per assegnare la modalità di priorità "In tempo reale" per evitare di perdere informazioni durante la sperimentazione.

8. Registrazione del segnale elettroencefalografico (EEG)

1. Dopo aver verificato che il software EEG stia acquisendo dati, avviare il software di tracciamento comportamentale e impostare il protocollo sperimentale per verificare che l'animale si trovi nella zona di osservazione e che il set-up funzioni correttamente.
2. A questo punto, avvia la registrazione del software EEG premendo il pulsante "Start Record". Dopo aver verificato che il segnale di acquisizione sia in esecuzione, avviare la sperimentazione nel BTS.
3. Al termine dell'esperimento, tornare al software EEG e interrompere il processo di registrazione. La registrazione verrà salvata utilizzando un nome predefinito costituito dalla data di registrazione utilizzando il seguente formato: "aaaa-mmgg-hhmm_SubjectID_Ephys.plx". Per impostazione predefinita, tutte le registrazioni vengono salvate nella cartella del software EEG (NeurophysData).
4. Verificare che entrambi i file di dati siano stati creati. Registrare il log dell'esperimento o modificare il nome per evitare confusione.

9. Compito comportamentale e sincronizzazione del segnale EEG

1. Apri MATLAB ed esegui il comando: convert_plx2mat. Tale funzione aprirà una casella del browser. Le funzioni di conversione sono fornite dal produttore e devono essere aggiunte al percorso di MATLAB.
2. Seleziona *.plx da convertire e premi "Invio" sulla riga di comando di MATLAB per convertirlo nei parametri predefiniti.
3. Apri il file di sperimentazione BTS e vai su "Protocollo". Fare clic sull'opzione "Risultati, report e dati" selezionare tutti gli eventi di entrambi gli oggetti e fare clic su "Scegli il formato orario per il rapporto", selezionare la terza opzione: "Mostra gli orari degli eventi in tempo reale in HH:MM:SS.sss - ad esempio 13:20:14.791."
4. Ora vai su "File" e fai clic su "Esporta" e "Esporta esperimento come XML", seleziona "Data e ora del test", infine fai clic su "Crea XML".
5. Vai su "Esporta dati di test" e fai clic su "Salva dati". Verrà creato un file .csv con gli orari degli eventi.
6. Ripetere i passaggi da 9.1 a 9.5 per ogni file. Nel nostro caso, i tre esperimenti erano: ACQ, STM e LTM.
7. Una volta convertiti i file EEG e di comportamento, raccoglieteli in una singola cartella. La cartella deve contenere rispettivamente sei file, i tre file mat e tre .csv. Nel nostro caso, i file sono stati chiamati: PID_01_ACQ_N.mat, PID_02_STM_N.mat, PID_03_LTM_N.mat, PID_01_ACQ_M.csv, PID_02_STM_M.csv e PID_03_LTM_M.csv. ID si riferisce al numero di identificazione di un animale.
8. Apri la funzione "procesa_sujeto.m" usando MATLAB e regola la seconda riga sull'ID dell'animale.
9. Ora sposta MATLAB in tale cartella ed esegui: "procesa_sujeto" per creare figure di banda alfa e beta relativa alla potenza associata al riconoscimento di oggetti su stadi ACQ, STM e LTM.
   NOTA: "procesa_sujeto" è una funzione che esegue diverse analisi di elaborazione del segnale. Queste analisi sono riassunte come segue nei punti da 9.10 a 9.15.
10. Filtrare ogni segnale EEG con un filtro passa-banda Butterworth di 4° ordine a [5-40] Hz, utilizzando la correzione di fase.
11. Ispezionare visivamente i segnali prima della successiva analisi, e quei canali con artefatti derivati dal posizionamento difettoso degli elettrodi o dalla regolazione errata da parte dei movimenti degli animali sono stati esclusi da ulteriori analisi.
12. Segnali di riferimento alla media comune per alleviare gli artefatti di movimento.
13. Segmenta i segnali EEG per formare epoche di lunghezza di 4 s sincronizzate da timestamp derivati da BTS. Gli eventi bersaglio erano l'esplorazione dell'oggetto segnato dalla distanza del confine tra animali e oggetti. Questi eventi sono contrassegnati sui timestamp BTS e sono stati utilizzati come identificatori per fissare le posizioni delle finestre. Quindi, le epoche EEG sono delimitate da 1 s prima che l'esplorazione inizi a 3 s dopo. A questo punto, non è stata utilizzata alcuna convalida sulla lunghezza dell'esplorazione, ma sarà presa in considerazione per ricerche future.
14. Stimare la densità di potenza spettrale su quelle epoche usando il metodo del parogramma di Welch usando la lunghezza della finestra di 1 s, una sovrapposizione del 90%, finestra di Hanning prima della stima della trasformata di Fourier, con questi parametri è stata raggiunta una risoluzione di 1 Hz.
15. Valutare lo spettro di potenza su ciascuna banda valutando l'area sotto il periodogramma, e i valori presentati corrispondono all'energia relativa, significa che l'energia di ogni banda EEG è stata divisa per l'energia totale dell'epoca. Questa procedura riduce anche le stime errate dovute agli artefatti sui segnali EEG.

I metodi sopra descritti sono stati applicati per registrare simultaneamente l'EEG e l'attività del ratto dopo il trattamento di arricchimento ambientale. I ratti Wistar maschi di tre mesi sono stati sottoposti a un protocollo di trattamento di arricchimento ambientale a medio termine per 20 giorni e sono stati operati per fissare sei elettrodi a vite cranica accoppiati su regioni frontali, centrali e parietali riferite a un settimo elettrodo situato in Nuova Zelanda. Gli animali sono stati mantenuti in condizioni naturali di luce oscura, con accesso ad libitum al cibo e all'acqua. Questo lavoro mostra l'integrazione tra il sistema EEG e il software di tracciamento comportamentale per una registrazione live simultanea. Abbiamo utilizzato solo animali trattati secondo il protocollo EE poiché non pretendiamo di confrontare l'efficacia del trattamento, ma esemplificano solo i vantaggi dell'attrezzatura. Come prova che il protocollo di alloggiamento di arricchimento ambientale di 20 giorni utilizzato stimola la neurogenesi adulta, presentiamo dati di conteggio delle cellule BrdU positivi da animali sotto EE e animali ospitati in condizioni standard da dati non pubblicati dal nostro laboratorio. Sono stati utilizzati ratti Wistar maschi di tre mesi. Sono stati iniettati tre volte con BrdU con 12 ore tra loro. Gli animali sono stati anestetizzati (pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) ed eutanasizzati, mediante perfusione transcardica (vedi Figura 5). Per garantire che il giubbotto collegato al dispositivo EEG non limiti i movimenti degli animali, abbiamo eseguito il test in campo aperto (OFT) in due gruppi, un gruppo è stato sottoposto a intervento chirurgico mentre indossava l'apparecchiatura (giubbotto e amplificatore EEG) e l'altro gruppo di animali è rimasto intatto senza indossare l'hardware. Non abbiamo trovato differenze significative nella distanza percorsa dagli animali in 10 minuti di test (vedi Figura 5). Il tipico protocollo NORT consiste nella presentazione di due oggetti e nella sostituzione di uno di essi con un nuovo oggetto. Il software di tracciamento comportamentale ha monitorato il tempo di esplorazione.

Il software di monitoraggio comportamentale ha registrato un gruppo di animali per valutare i loro parametri chiave di prestazione. Pertanto, abbiamo utilizzato tre parametri per valutare le prestazioni di esplorazione. Il rapporto di preferenza è stato calcolato utilizzando il tempo della testa degli animali trascorso nella zona dell'oggetto, che riporta la quantità totale di tempo che la testa degli animali ha trascorso in ciascun oggetto. Inoltre, abbiamo calcolato un rapporto di preferenza per il tempo trascorso a muoversi verso gli oggetti, che mostra la quantità totale di tempo trascorso su ogni animale che si muoveva verso ciascuna zona dell'oggetto. Inoltre, è stato calcolato il tempo trascorso per visita a ciascun oggetto. La figura 6 mostra i risultati a tre parametri sopra menzionati. Nella prova di acquisizione, non ci sono state distinzioni tra gli oggetti nei tre parametri valutati: tempo di testa nella zona dell'oggetto per le tre prove, tempo di spostamento verso gli oggetti per le tre prove e tempo per visita in ciascun oggetto. Non ci sono state differenze nello studio STM. Nel frattempo, nello studio LTM, è stato osservato un rapporto preferenziale di esplorazione significativamente più alto per il nuovo oggetto. Inoltre, nello studio LTM, è stata osservata anche una preferenza per il nuovo oggetto nel tempo trascorso per visita (pannello C). Il video 1 mostra un esempio rappresentativo di un ratto registrato nell'esperimento, mentre il video 2 mostra un esempio rappresentativo di EEG simultaneo e registrazione comportamentale.

È stato possibile abbinare gli eventi temporali tracciati con il Behavioral Tracking e la registrazione del software EEG utilizzando l'orologio del computer. La Figura 7 e la Figura 8 mostrano i cambiamenti nella potenza relativa dell'EEG sulle bande alfa e beta. Questi sono legati al controllo motorio, alla concentrazione e alla memoria, suggerendo che l'esplorazione è solo correlata a queste funzioni. I risultati di animal 3 mostrano che il potere alfa tende a ridursi su STM per quanto riguarda ACQ e LTM, suggerendo una desincronizzazione correlata all'esplorazione o al recupero della memoria. Il numero di oggetti di riconoscimento (epoche elaborate) era basso. A questo punto, non è possibile determinare se un test statistico convaliderebbe se tale differenza è reale o se un artefatto è stato in grado di produrre tali condizioni sperimentali. Tuttavia, la segmentazione, l'etichettatura e l'analisi delle epoche sono diventate possibili da una sequenza temporale di eventi di marcatura simultanei negli animali e risultati EEG prodotti per futuri progetti di ricerca. La combinazione di questi sistemi impedisce un'errata identificazione degli eventi da parte di un processo di marcatura manuale, che è diventato un problema significativo ai fini della sperimentazione animale. La combinazione del BTS e dell'attività elettrofisiologica (EP) potrebbe essere accuratamente associata al comportamento animale; Tuttavia, le condizioni sperimentali richiedono l'uso di tecniche avanzate di elaborazione del segnale per eliminare gli artefatti di movimento e apportare miglioramenti alla configurazione sperimentale in modo efficace.

Figura 1: Esempi di gabbie in condizioni ambientali arricchite (EE). L'alloggio è stato fornito con giocattoli e tubi, in cui gli animali trovano nuovi e complessi ma nessuna rilevanza biologica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Posizioni degli elettrodi epidurali nel cranio del ratto. Le viti sono state utilizzate contemporaneamente come ancoraggio per la cuffia e come elettrodi. F = frontale; C = frontoparietale; P = parietale; 3 = sinistra; 4 = diritto; NZ = come riferimento di base. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative di un intervento chirurgico di impianto di elettrodi epidurali (vite cranica). Immagine che mostra viti di elettrodi intracranici impiantati nei ratti in diverse fasi dell'intervento. Assicurarsi che le tecniche asettiche siano seguite durante l'esecuzione di questa procedura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Immagini rappresentative di un ratto insieme alla configurazione sperimentale. Al ratto è stato fatto indossare il giubbotto attaccato al dispositivo EEG con una batteria incorporata, all'interno dell'arena utilizzata per il protocollo NORT. L'immagine mostra l'auricolare e il connettore del cavo installati sul ratto della testa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Evidenza della capacità di movimento e della stimolazione della neurogenesi adulta mediante protocollo EE. (A) Immagini rappresentative dell'attività animale per 10 minuti nel test in campo aperto (OFT) e la distanza media percorsa dagli animali che indossano l'attrezzatura/intervento chirurgico e dagli animali senza l'attrezzatura/nessun intervento chirurgico. (B-E) Sezione DG rappresentativa con celle marcate BrdU (buio intenso) per EE e gruppi abitativi standard. I pannelli B e D mostrano un basso ingrandimento del DG, mentre i pannelli C ed E mostrano l'area della scatola a un ingrandimento maggiore. I pannelli B e C sono tessuti del gruppo di alloggiamento EE, i pannelli D ed E provengono dal gruppo di alloggiamenti standard. Il riquadro illustra il numero medio di celle marcate in entrambi i gruppi. ML - strato molecolare; GCL – strato cellulare granulare; SGZ – zona subgranulare; frecce - celle BrdU+. I grafici mostrano la media ± SEM. Il test T-student è stato utilizzato per confrontare i gruppi. * p≤0.05. Non sono state riscontrate differenze significative tra i gruppi nel test in campo aperto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Prestazioni di esplorazione nella valutazione NORT. (A) Tempo di testa nella zona oggetto per le tre prove. (B) Il tempo si muove verso gli oggetti per le tre prove. (C) Tempo per visita in ciascun oggetto. I grafici mostrano la media ± SEM. In tutti i parametri è stato utilizzato ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Sidak. * p≤0.05, ** p≤0.01 tra gli oggetti nella rispettiva prova. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Cambiamenti rispetto alla potenza della banda EEG alfa associati all'esplorazione. Questa figura mostra i cambiamenti nella potenza alfa relativa, da mezzo secondo a 2,5 dopo che l'animale inizia l'esplorazione degli oggetti. I sei grafici corrispondevano agli elettrodi frontali, centrali e parietali (dall'alto verso il basso) e ai lati sinistro e destro. I boxplot mostrano la distribuzione di tali serie temporali per ogni combinazione di condizioni di un oggetto: "Familiare" e "Romanzo" e stadio: "ACQ", "STM" e "LTM". Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Cambiamenti rispetto alla potenza della banda EEG beta associati all'esplorazione. Questa figura mostra i cambiamenti sulla potenza beta relativa, da mezzo secondo a 2,5 dopo che l'animale inizia l'esplorazione degli oggetti. I sei grafici corrispondevano agli elettrodi frontali, centrali e parietali (dall'alto verso il basso) e ai lati sinistro e destro. I boxplot mostrano la distribuzione di tali serie temporali per ogni combinazione di condizioni di un oggetto: "Familiare" e "Romanzo" e stadio: "ACQ", "STM" e "LTM". Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Video 1: Video rappresentativo che mostra un ratto registrato nell'esperimento. Il ratto era all'interno dell'arena utilizzata per il protocollo NORT. Il topo indossava il giubbotto attaccato al dispositivo EEG con una batteria incorporata. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Video rappresentativo che mostra la registrazione simultanea di EEG e comportamentale. Il segnale EEG è stato visualizzato sul lato sinistro mentre il test comportamentale (NORT) è stato visualizzato sul lato destro del video. Clicca qui per scaricare questo video.

La dott.ssa Sylvia Ortega-Martinez lavora come dipendente di Stoelting Co., una società che ha fornito e sponsorizzato la produzione e l'accesso aperto a questo articolo.