L'amputazione degli arti inferiori può verificarsi anche dopo l'angioplastica dei vasi ostruite nell'ischemia degli arti critici (CLI). Le cellule progenitrici mononucleari (MPC) riflettono la riparazione vascolare. Il presente protocollo descrive la quantificazione degli MPC dalla circolazione vicina all'angioplastica e la sua relazione con la disfunzione endoteliale e la previsione dell'amputazione degli arti inferiori.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Previsione dell'amputazione mediante cellule progenitrici mononucleari circolanti locali in pazienti trattati con angioplastica con ischemia degli arti critici
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ischemia degli arti critici (CLI) rappresenta uno stadio avanzato della malattia arteriosa periferica. L'angioplastica migliora il flusso sanguigno all'arto inferiore; tuttavia, alcuni pazienti progrediscono irreversibilmente verso l'amputazione degli arti. L'entità del danno vascolare e i meccanismi di riparazione vascolare sono fattori che influenzano l'esito post-angioplastica. Le cellule progenitrici mononucleari (MPC) sono reattive ai danni vascolari e alla riparazione, con la capacità di riflettere le malattie vascolari. Il presente protocollo descrive la quantificazione degli MPC ottenuti dalla circolazione sanguigna dal vaso vicino al sito di angioplastica, così come la sua relazione con la disfunzione endoteliale e la sua capacità predittiva per l'amputazione degli arti nei prossimi 30 giorni dopo l'angioplastica nei pazienti con CLI.
Introduzione
La malattia arteriosa periferica (PAD) è caratterizzata da un'ostruzione vascolare cronica e progressiva con limitazione dell'apporto disangue 1. Su scala globale, il PAD degli arti inferiori colpisce circa il 10% della popolazione anziana, mentre fino al 7% di questi casi sono sottoposti all'amputazione degliarti 2,3.
Critical Limb Ischemia (CLI) rappresenta la presentazione più seria di PAD1. I pazienti di solito provano dolore a riposo, ulcere o cancrena attribuibili a arterie occluse; mentre la prognosi clinica è sfavorevole e caratterizzata da un rischio del 30% di amputazione e mortalità degli arti durante 1anno 3,4,5.
L'angioplastica è una procedura endovascolare mininvasiva in grado di ripristinare il flusso sanguigno all'arto inferiore nei pazienti con CLI; tuttavia, alcuni pazienti richiederanno inevitabilmente un'amputazione degli arti maggiore, anche dopo la terapia con angioplastica1,5. L'identificazione precoce di esiti sfavorevoli dopo l'angioplastica è piuttosto preziosa, a causa della possibilità di applicazione della terapia.
I fattori di rischio tradizionali possono fornire una capacità predittiva limitata per l'amputazione degli arti principali in pazienti con CLI sottoposti ad angioplastica6. I biomarcatori orientati alla fisiopatologia rappresentano nuovi metodi con potenziali applicazioni cliniche, che possono risultare specificamente utili nelle malattie legate alla lesione vascolare7. Al giorno d'oggi, la partecipazione delle popolazioni cellulari proprietarie di proprietà di riparazione endoteliale, nel sito della placca aterosclerotica, è statasempre più riconosciuta 8,9.
Le cellule progenitrici mononucleari (MPC) derivano dal midollo osseo e possiedono caratteristiche strutturali e funzionali delle cellule staminali con capacità rigenerative vascolari. Grazie alla capacità di MPC di proliferare, migrare e mostrare aderenza vascolare; queste cellule sono diventate buoni candidati per riflettere la riparazione endoteliale in risposta all'ischemia10,11,12. Inoltre, il continuo interesse per i meccanismi alla base della lesione vascolare ha motivato l'esplorazione del ruolo prognostico dei biomarcatori locali, poiché sono considerati come fattori di assicurazione eriparazione 7,13,14.
Lo scopo del presente studio è quello di descrivere come determinare la quantità di MPC che circolano vicino all'ostruzione vascolare nei pazienti con CLI sottoposti ad angioplastica; e come valutare la relazione tra MPC con indicatori di disfunzione endoteliale e amputazione degli arti.
Rispetto alla prognosi basata su comorbilità e caratteristiche vascolari intrinseche, la quantità di MPC locali mostra una capacità specifica di prevedere l'esito clinico per quanto riguarda la disfunzione endoteliale e l'amputazione degli arti. Coerentemente, alcuni studi hanno descritto il ruolo prognostico di biomarcatori simili durante la valutazione dei pazienti con PAD15,16.
Sulla base dei risultatiprecedenti 7, il metodo qui descritto può essere utile per un'identificazione precoce della popolazione a rischio di esiti vascolari avversi in diversi contesti clinici, come ischemia degli arti inferiori e coronarica, ictus, vascolari, trombosi venosa e altri che comportano lesioni vascolari e riparazione.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Il comitato etico di ricerca istituzionale del Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE ha approvato questo protocollo prospettico, tutti i pazienti iscritti hanno fornito il consenso informato scritto.
1. Valutazione del blocco vascolare dell'arto inferiore, prelievo del sangue e angioplastica del palloncino
NOTA: Il campione di studio utilizzato per questo esperimento comprendeva 20 pazienti diabetici, di età compresa tra 68 e 10 su 20 erano maschi. Metà del campione erano fumatori e le comorbilità più diffuse erano diabete mellito di tipo 2, ipertensione arteriosa sistemica e/o dislipidemia. Il campione doveva essere standardizzato per l'età, il sesso e le comorbilità. Non è stato possibile escludere possibili distorsioni dovute all'influenza clinico-demografica sulla relazione tra MPC e CLI.
- Valutate la gravità clinica dell'ischemia degli arti secondo la classificazione di Rutherford13 (cfr. tabella complementare 1).
- Eseguire angiografia degli arti inferiori, prelievo del sangue e angioplastica a palloncino.
- Utilizzare farmaci anticoagulanti e anestetici prima dell'intervento chirurgico.
- Posizionare un ago da 18 G nel vaso sanguigno nel sito dell'inguine selezionato.
- Posizionare un introno e far avanzare un filo guida flessibile. Quindi, la guida iniziale viene ulteriormente modificata per un introno da 6 Fr.
- Utilizzare l'iniezione periodica di mezzi di contrasto o CO2 sotto guida fluoroscopica per identificare la traiettoria dell'arteria e i siti vascolarmente bloccati (Figura 1).
NOTA: Utilizzare supporti di contrasto 40 cc, diluiti 1:1 nello 0,9% di salina o CO2 a 10-20 mL per colpo a una pressione di 12 psi. - Introdurre due fili guida di navigazione 0.014 Fr e due fili guida di supporto 0.014 Fr nella nave e farli avanzare fino al sito bloccato.
NOTA: Due fili guida da 0,014 Fr (lunghi 260 cm) vengono utilizzati per la navigazione e due fili guida da 0,014 Fr (lunghi 260 cm) vengono utilizzati per il supporto, durante un'unica procedura. - Introdurre cateteri 5 Fr e 3 Fr in sequenza e raccogliere 10 mL di sangue dal sito più vicino all'ostruzione vascolare. Mantenere campioni di sangue sul ghiaccio.
NOTA: Le dimensioni dei cateteri possono essere di 5 Fr e 3 Fr e vengono modificate durante la procedura. - Far avanzare di nuovo un filo guida. Quindi, introdurre un catetere a palloncino di angioplastica, che contiene un palloncino gonfiabile situato alla fine del catetere. Far avanzare il catetere a palloncino angioplastica e posizionare il palloncino proprio sul sito della lesione. Eseguire l'angioplastica gonfiando il palloncino contro la placca di blocco situata sulla parete vascolare. Verificare il ripristino del flusso sanguigno.
NOTA: Uno stent può essere posizionato nell'area bloccata per aiutare a mantenere l'arteria aperta dopo la procedura. - Introdurre un catetere e avanzare fino al sito più vicino al blocco vascolare. Raccogliere 10 mL di sangue a intervalli di tempo di 30 minuti dopo l'angioplastica. Mantenere campioni di sangue sul ghiaccio.
NOTA: Si raccomanda la raccolta di campioni di sangue prima e dopo l'angioplastica per valutare ulteriormente l'influenza dell'angioplastica sul numero di MPC. - Rimuovere tutti i fili sotto guida fluoroscopica.
- Fornire procedure di cura post-operatoria, compresa la terapia antico coagulazione con enoxaparina a 1 mg/kg sottocutaneo ogni 12 ore, aspirina 100 mg, statina e analgesia. Comprimere nel sito di puntura vascolare per 24 ore.
2. Quantificazione delle cellule progenitrici mononucleari circolanti (MPC)(figura 2)
- In un tubo conico fresco da 15 ml, trasferire 6 ml del sangue raccolto e diluire 1:1 (v/v) con PBS.
NOTA: Elaborare il sangue entro 1 h dalla raccolta. - Prepararsi per la separazione del gradiente di densità, aggiungendo 2 ml del mezzo gradiente di densità a 3 provette ciascuna. Quindi, aggiungere 3 aliquote di volume uguale del sangue diluito in ogni provetta.
NOTA: Non superare i tre quarti della capacità massima della provetta. - Centrifuga a 1.800 x g per 30 min a 4 °C. Raccogliere il livello di interfaccia presente come anello utilizzando una pipetta e trasferirlo in un nuovo tubo. Aggiungere 2 mL di PBS e girare a 1.800 x g per 6 min a 4 °C. Salvare il pellet in quanto conterrà MPC.
- Lavare il pellet contenente MPC con PBS mediante centrifugazione come descritto al passaggio 2.3. Utilizzare PBS fresco per ogni lavaggio e rotazione a 1.800 x g per 2 min a 4 °C. Ripetere il processo per 6 volte.
- Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare 1 mL di PBS per rimospendare il pellet cellulare. Diluire 20 μL della sospensione cellulare con 20 μL di 0,4% di trypan blu, 1:1 (v/v). Utilizzare 10 μL di questa sospensione cellulare per il conteggio delle cellule utilizzando emocitometro e un microscopio leggero.
- Aliquota 1 x 106 MPC in tubi di citometria a flusso da 5 ml precedentemente etichettati.
NOTA: Preparare gli anticorpi di controllo corrispondenti abbinati all'isotipo. - Centrifugare i tubi a 1.800 x g per 6 min a 4 °C. Aspirare e scartare il supernatante.
- Diluire l'anticorpo primario in 100 μL di soluzione di incubazione di anticorpi [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%] e aggiungere al tubo. Resuspend per 10 s e incubare per 20 min a 4 °C, al buio.
NOTA: Le concentrazioni finali di anticorpi primari utilizzati nel presente protocollo sono state CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Il protocollo può essere interrotto in questa fase fissando i linfociti in paraformaldeide al 4% nel PBS e immagazzinando campioni fino a 24 ore a 4 °C. - Centrifugare a 1.800 x g per 2 min a 4 °C e scartare il supernatante. Resuspend in 500 μL di 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM.
- Eseguire l'analisi della citometria del flusso.
- Impostare lo sfondo con anticorpi di controllo abbinati all'isotipo. Quindi, nella trama FSC / SSC selezionare la diffusione dei linfociti, cercando di escludere detriti cellulari, granulociti residui e altre particelle. Tale distribuzione è considerata al 100%.
NOTA: I linfociti di solito si diffondono nella regione in basso a sinistra della trama. - Utilizzare un gate con immunofenotipo comune contenente un numero elevato di cellule CD45+ e CD34+. Quindi, selezionare per i doppi immunofenotipi positivi utilizzando gate che in precedenza identificava CD45+, CD34+e aggiungendo KDR (VEGFR-2)+, CD133+ o CD184+. Identificare le sottopopolazioni degli MPC in base ai marcatori di superficie cellulare specifici. Segnalare come percentuale di eventi gated.
- Impostare lo sfondo con anticorpi di controllo abbinati all'isotipo. Quindi, nella trama FSC / SSC selezionare la diffusione dei linfociti, cercando di escludere detriti cellulari, granulociti residui e altre particelle. Tale distribuzione è considerata al 100%.
- Identificare le principali sottopopolazioni di MPC. Nel presente studio gli immunofenotipi analizzati sono stati CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+; CD45+CD34+CD133+CD184+; CD45+CD34+KDR+; CD45+CD34+KDR+CD133+ e CD45+CD34+KDR+CD1847,17.
NOTA: Questi marcatori di superficie cellulare sono stati utilizzati per lo studio: CD45 (linfociti), CD34 (cellule endoteliali e/o vascolari), KDR (VEGFR-2) (marcatore di membrana delle cellule endoteliali), CD133 (cellule progenitrici endoteliali) e CD184 (cellule staminali ematopoietiche e cellule endoteliali).
3. Relazione degli MPC con modifica della funzione endoteliale e del test emodinamico (FMD)
- Determinare la dilatazione mediata dal flusso (AFTA epizootica), la pre e la post-angioplastica.
- Utilizzare un trasduttore lineare vascolare per misurare il diametro dell'arteria brachiale.
- Posizionare il polsino dello sphygmomanometro sopra il sito di misurazione nell'avambraccio e insufflato a 50 mmHg sopra la pressione sanguigna sistolica per 5 minuti e sgonfiare.
- Determinare nuovamente il diametro dell'arteria brachiale entro i prossimi 60 s. Utilizzare l'equazione seguente per stimare l'afta epizootica.
NOTA: Calcolare il grado di dilatazione usando l'equazione (%) = (diametro massimo dopo ischemia transitoria - diametro basale) × 100 / diametro basale.
- Correlare il numero di MPC con il valore fmd di base e il delta post-angioplastica dell'afta epizootica.
4. Capacità prognostica degli MPC per l'amputazione degli arti
- Programmare appuntamenti medici periodici dopo l'angioplastica del palloncino e la dimissione del paziente, per valutare la qualità del flusso sanguigno all'arto inferiore.
- Valutare la gravità clinica dell'ischemia degli arti a 2 settimane dall'angioplastica. Valuta la risoluzione del dolore di riposo, l'ischemia inferiore e la conservazione di un piede funzionale, secondo la classificazione di Rutherford13.
- Confrontare la gravità clinica dell'ischemia degli arti, al basale rispetto al follow-up. Identificare i casi che richiedono un'amputazione maggiore a causa di un risultato sfavorevole.
- Correlare il numero di MPC con la proporzione di pazienti che richiedono un'amputazione maggiore dell'arto inferiore.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Campioni di sangue provenienti da arterie bloccate, nel sito indirizzato per l'angioplastica, sono stati raccolti da 20 pazienti diabetici, di 68 anni e 10 su 20 erano maschi. Metà della popolazione campione era fumatore. Le lesioni vascolari sono state principalmente segnate come Classe VI di Rutherford; che i pazienti hanno mostrato una prevalenza più elevata di diabete mellito di tipo 2 (100%), ipertensione (70%) e dislipidemia (55%).
Un follow-up clinico di 30 giorni dopo l'angioplastica d...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La raccolta del sangue nel sito preciso del blocco vascolare può mostrare difficoltà tecniche; pertanto, abbiamo eseguito la raccolta del sangue in prossimità del blocco vascolare. Allo stesso modo, la quantità di MPC vicino alla placca vascolare sembra essere altamente dinamica e può originare variazioni prima e dopo l'angioplastica. Secondo le nostre osservazioni, si raccomanda di valutare i cambiamenti di basale e 30 minuti dopo l'angioplastica nel numero di MPC, poiché possono riflettere diversi processi fisiopatolog...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il supporto del Programma Istituzionale E015 per il progetto ID 356.2015.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BSA | Roche | 10735086001 | l'albumina sierica bovina (BSA) come agente tampone, stabilizzante, standard e per miscelazione. |
| Perle di calibrazione | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | Le perle di calibrazione MACQuant sono fornite in soluzione acquosa contenente lo 0,05% di azide di sodio. 3,5 ml per un massimo di 100 test |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Anticorpo coniugato a R-Ficoeritrina in tampone PBS/EDTA |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonale, isotipo ricombinante umano IgG1, coniugato |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Anticorpo coniugato a R-Ficoeritrina in tampone PBS/EDTA |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | Il clone di anticorpo monoclonale AC136 rileva un epitopo di classe III del CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Anticorpo monoclonale CD45, |
| provette coniugate | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | Provette coniche da centrifuga da 15 ml |
| Provette per citometria | FALCON Corning Brand | #352052 | mL Provetta a fondo tondo in polistirene. Stile 12x75. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Metalli pesanti, (come Pb) < 10 ppm, Fe< 0,01%, As< 1ppm, Insolubili< 0,005% |
| Neubauer migliorato | Senza marca | Senza numero di catalogo | Emocitometro per il conteggio delle cellule. (intervallo 0,1000 mm, 0,0025 mm2) |
| Provette per la raccolta del sangue K2 EDTA BD | Vacutainer | #367863 | Provetta vacutainer in plastica lilla (K2E) 10,8 mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile e controllato sulla presenza di endotossine. Densità: 1,077± 0,001g/mL |
| Paraformaldeide | SIGMA-ALDRICH | Fissazione di campioni biologici, (polvere, 95%)Trasferimento di | |
| pipette 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | La pipetta di trasferimento è uno strumento che facilita il trasferimento di liquidi con maggiore precisione. |
| Provette | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Provette resistenti al calore. DIMENSIONI/TAPPO 13 x 100 mm |
Riferimenti
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford's vascular surgery (8th ed.). , Saunders Elsevier. Philadelphia, PA. (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O'Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790(2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
