Previsione dell'amputazione mediante cellule progenitrici mononucleari circolanti locali in pazienti trattati con angioplastica con ischemia degli arti critici

La malattia arteriosa periferica (PAD) è caratterizzata da un'ostruzione vascolare cronica e progressiva con limitazione dell'apporto di^{sangue 1}. Su scala globale, il PAD degli arti inferiori colpisce circa il 10% della popolazione anziana, mentre fino al 7% di questi casi sono sottoposti all'amputazione degli^{arti 2,3}.

Critical Limb Ischemia (CLI) rappresenta la presentazione più seria di PAD¹. I pazienti di solito provano dolore a riposo, ulcere o cancrena attribuibili a arterie occluse; mentre la prognosi clinica è sfavorevole e caratterizzata da un rischio del 30% di amputazione e mortalità degli arti durante 1^{anno 3,4,5}.

L'angioplastica è una procedura endovascolare mininvasiva in grado di ripristinare il flusso sanguigno all'arto inferiore nei pazienti con CLI; tuttavia, alcuni pazienti richiederanno inevitabilmente un'amputazione degli arti maggiore, anche dopo la terapia con angioplastica^1,5. L'identificazione precoce di esiti sfavorevoli dopo l'angioplastica è piuttosto preziosa, a causa della possibilità di applicazione della terapia.

I fattori di rischio tradizionali possono fornire una capacità predittiva limitata per l'amputazione degli arti principali in pazienti con CLI sottoposti ad angioplastica⁶. I biomarcatori orientati alla fisiopatologia rappresentano nuovi metodi con potenziali applicazioni cliniche, che possono risultare specificamente utili nelle malattie legate alla lesione vascolare⁷. Al giorno d'oggi, la partecipazione delle popolazioni cellulari proprietarie di proprietà di riparazione endoteliale, nel sito della placca aterosclerotica, è stata^{sempre più riconosciuta 8,9}.

Le cellule progenitrici mononucleari (MPC) derivano dal midollo osseo e possiedono caratteristiche strutturali e funzionali delle cellule staminali con capacità rigenerative vascolari. Grazie alla capacità di MPC di proliferare, migrare e mostrare aderenza vascolare; queste cellule sono diventate buoni candidati per riflettere la riparazione endoteliale in risposta all'ischemia^10,11,12. Inoltre, il continuo interesse per i meccanismi alla base della lesione vascolare ha motivato l'esplorazione del ruolo prognostico dei biomarcatori locali, poiché sono considerati come fattori di assicurazione e^{riparazione 7,13,14}.

Lo scopo del presente studio è quello di descrivere come determinare la quantità di MPC che circolano vicino all'ostruzione vascolare nei pazienti con CLI sottoposti ad angioplastica; e come valutare la relazione tra MPC con indicatori di disfunzione endoteliale e amputazione degli arti.

Rispetto alla prognosi basata su comorbilità e caratteristiche vascolari intrinseche, la quantità di MPC locali mostra una capacità specifica di prevedere l'esito clinico per quanto riguarda la disfunzione endoteliale e l'amputazione degli arti. Coerentemente, alcuni studi hanno descritto il ruolo prognostico di biomarcatori simili durante la valutazione dei pazienti con PAD^15,16.

Sulla base dei risultati^{precedenti 7}, il metodo qui descritto può essere utile per un'identificazione precoce della popolazione a rischio di esiti vascolari avversi in diversi contesti clinici, come ischemia degli arti inferiori e coronarica, ictus, vascolari, trombosi venosa e altri che comportano lesioni vascolari e riparazione.

Il comitato etico di ricerca istituzionale del Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE ha approvato questo protocollo prospettico, tutti i pazienti iscritti hanno fornito il consenso informato scritto.

1. Valutazione del blocco vascolare dell'arto inferiore, prelievo del sangue e angioplastica del palloncino

NOTA: Il campione di studio utilizzato per questo esperimento comprendeva 20 pazienti diabetici, di età compresa tra 68 e 10 su 20 erano maschi. Metà del campione erano fumatori e le comorbilità più diffuse erano diabete mellito di tipo 2, ipertensione arteriosa sistemica e/o dislipidemia. Il campione doveva essere standardizzato per l'età, il sesso e le comorbilità. Non è stato possibile escludere possibili distorsioni dovute all'influenza clinico-demografica sulla relazione tra MPC e CLI.

1. Valutate la gravità clinica dell'ischemia degli arti secondo la classificazione di Rutherford¹³ (cfr. tabella complementare 1).
2. Eseguire angiografia degli arti inferiori, prelievo del sangue e angioplastica a palloncino.
   1. Utilizzare farmaci anticoagulanti e anestetici prima dell'intervento chirurgico.
   2. Posizionare un ago da 18 G nel vaso sanguigno nel sito dell'inguine selezionato.
   3. Posizionare un introno e far avanzare un filo guida flessibile. Quindi, la guida iniziale viene ulteriormente modificata per un introno da 6 Fr.
   4. Utilizzare l'iniezione periodica di mezzi di contrasto o CO₂ sotto guida fluoroscopica per identificare la traiettoria dell'arteria e i siti vascolarmente bloccati (Figura 1).
      NOTA: Utilizzare supporti di contrasto 40 cc, diluiti 1:1 nello 0,9% di salina o CO₂ a 10-20 mL per colpo a una pressione di 12 psi.
   5. Introdurre due fili guida di navigazione 0.014 Fr e due fili guida di supporto 0.014 Fr nella nave e farli avanzare fino al sito bloccato.
      NOTA: Due fili guida da 0,014 Fr (lunghi 260 cm) vengono utilizzati per la navigazione e due fili guida da 0,014 Fr (lunghi 260 cm) vengono utilizzati per il supporto, durante un'unica procedura.
   6. Introdurre cateteri 5 Fr e 3 Fr in sequenza e raccogliere 10 mL di sangue dal sito più vicino all'ostruzione vascolare. Mantenere campioni di sangue sul ghiaccio.
      NOTA: Le dimensioni dei cateteri possono essere di 5 Fr e 3 Fr e vengono modificate durante la procedura.
   7. Far avanzare di nuovo un filo guida. Quindi, introdurre un catetere a palloncino di angioplastica, che contiene un palloncino gonfiabile situato alla fine del catetere. Far avanzare il catetere a palloncino angioplastica e posizionare il palloncino proprio sul sito della lesione. Eseguire l'angioplastica gonfiando il palloncino contro la placca di blocco situata sulla parete vascolare. Verificare il ripristino del flusso sanguigno.
      NOTA: Uno stent può essere posizionato nell'area bloccata per aiutare a mantenere l'arteria aperta dopo la procedura.
   8. Introdurre un catetere e avanzare fino al sito più vicino al blocco vascolare. Raccogliere 10 mL di sangue a intervalli di tempo di 30 minuti dopo l'angioplastica. Mantenere campioni di sangue sul ghiaccio.
      NOTA: Si raccomanda la raccolta di campioni di sangue prima e dopo l'angioplastica per valutare ulteriormente l'influenza dell'angioplastica sul numero di MPC.
   9. Rimuovere tutti i fili sotto guida fluoroscopica.
   10. Fornire procedure di cura post-operatoria, compresa la terapia antico coagulazione con enoxaparina a 1 mg/kg sottocutaneo ogni 12 ore, aspirina 100 mg, statina e analgesia. Comprimere nel sito di puntura vascolare per 24 ore.

2. Quantificazione delle cellule progenitrici mononucleari circolanti (MPC)(figura 2)

1. In un tubo conico fresco da 15 ml, trasferire 6 ml del sangue raccolto e diluire 1:1 (v/v) con PBS.
   NOTA: Elaborare il sangue entro 1 h dalla raccolta.
2. Prepararsi per la separazione del gradiente di densità, aggiungendo 2 ml del mezzo gradiente di densità a 3 provette ciascuna. Quindi, aggiungere 3 aliquote di volume uguale del sangue diluito in ogni provetta.
   NOTA: Non superare i tre quarti della capacità massima della provetta.
3. Centrifuga a 1.800 x g per 30 min a 4 °C. Raccogliere il livello di interfaccia presente come anello utilizzando una pipetta e trasferirlo in un nuovo tubo. Aggiungere 2 mL di PBS e girare a 1.800 x g per 6 min a 4 °C. Salvare il pellet in quanto conterrà MPC.
4. Lavare il pellet contenente MPC con PBS mediante centrifugazione come descritto al passaggio 2.3. Utilizzare PBS fresco per ogni lavaggio e rotazione a 1.800 x g per 2 min a 4 °C. Ripetere il processo per 6 volte.
5. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare 1 mL di PBS per rimospendare il pellet cellulare. Diluire 20 μL della sospensione cellulare con 20 μL di 0,4% di trypan blu, 1:1 (v/v). Utilizzare 10 μL di questa sospensione cellulare per il conteggio delle cellule utilizzando emocitometro e un microscopio leggero.
6. Aliquota 1 x 10⁶ MPC in tubi di citometria a flusso da 5 ml precedentemente etichettati.
   NOTA: Preparare gli anticorpi di controllo corrispondenti abbinati all'isotipo.
7. Centrifugare i tubi a 1.800 x g per 6 min a 4 °C. Aspirare e scartare il supernatante.
8. Diluire l'anticorpo primario in 100 μL di soluzione di incubazione di anticorpi [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%] e aggiungere al tubo. Resuspend per 10 s e incubare per 20 min a 4 °C, al buio.
   NOTA: Le concentrazioni finali di anticorpi primari utilizzati nel presente protocollo sono state CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Il protocollo può essere interrotto in questa fase fissando i linfociti in paraformaldeide al 4% nel PBS e immagazzinando campioni fino a 24 ore a 4 °C.
9. Centrifugare a 1.800 x g per 2 min a 4 °C e scartare il supernatante. Resuspend in 500 μL di 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM.
10. Eseguire l'analisi della citometria del flusso.
    1. Impostare lo sfondo con anticorpi di controllo abbinati all'isotipo. Quindi, nella trama FSC / SSC selezionare la diffusione dei linfociti, cercando di escludere detriti cellulari, granulociti residui e altre particelle. Tale distribuzione è considerata al 100%.
       NOTA: I linfociti di solito si diffondono nella regione in basso a sinistra della trama.
    2. Utilizzare un gate con immunofenotipo comune contenente un numero elevato di cellule CD45⁺ e CD34⁺. Quindi, selezionare per i doppi immunofenotipi positivi utilizzando gate che in precedenza identificava CD45⁺, CD34⁺e aggiungendo KDR (VEGFR-2)⁺, CD133⁺ o CD184⁺. Identificare le sottopopolazioni degli MPC in base ai marcatori di superficie cellulare specifici. Segnalare come percentuale di eventi gated.
11. Identificare le principali sottopopolazioni di MPC. Nel presente studio gli immunofenotipi analizzati sono stati CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133^{+ e} CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17.
    NOTA: Questi marcatori di superficie cellulare sono stati utilizzati per lo studio: CD45 (linfociti), CD34 (cellule endoteliali e/o vascolari), KDR (VEGFR-2) (marcatore di membrana delle cellule endoteliali), CD133 (cellule progenitrici endoteliali) e CD184 (cellule staminali ematopoietiche e cellule endoteliali).

3. Relazione degli MPC con modifica della funzione endoteliale e del test emodinamico (FMD)

1. Determinare la dilatazione mediata dal flusso (AFTA epizootica), la pre e la post-angioplastica.
   1. Utilizzare un trasduttore lineare vascolare per misurare il diametro dell'arteria brachiale.
   2. Posizionare il polsino dello sphygmomanometro sopra il sito di misurazione nell'avambraccio e insufflato a 50 mmHg sopra la pressione sanguigna sistolica per 5 minuti e sgonfiare.
   3. Determinare nuovamente il diametro dell'arteria brachiale entro i prossimi 60 s. Utilizzare l'equazione seguente per stimare l'afta epizootica.
      NOTA: Calcolare il grado di dilatazione usando l'equazione (%) = (diametro massimo dopo ischemia transitoria - diametro basale) × 100 / diametro basale.
2. Correlare il numero di MPC con il valore fmd di base e il delta post-angioplastica dell'afta epizootica.

4. Capacità prognostica degli MPC per l'amputazione degli arti

1. Programmare appuntamenti medici periodici dopo l'angioplastica del palloncino e la dimissione del paziente, per valutare la qualità del flusso sanguigno all'arto inferiore.
2. Valutare la gravità clinica dell'ischemia degli arti a 2 settimane dall'angioplastica. Valuta la risoluzione del dolore di riposo, l'ischemia inferiore e la conservazione di un piede funzionale, secondo la classificazione di Rutherford¹³.
3. Confrontare la gravità clinica dell'ischemia degli arti, al basale rispetto al follow-up. Identificare i casi che richiedono un'amputazione maggiore a causa di un risultato sfavorevole.
4. Correlare il numero di MPC con la proporzione di pazienti che richiedono un'amputazione maggiore dell'arto inferiore.

Campioni di sangue provenienti da arterie bloccate, nel sito indirizzato per l'angioplastica, sono stati raccolti da 20 pazienti diabetici, di 68 anni e 10 su 20 erano maschi. Metà della popolazione campione era fumatore. Le lesioni vascolari sono state principalmente segnate come Classe VI di Rutherford; che i pazienti hanno mostrato una prevalenza più elevata di diabete mellito di tipo 2 (100%), ipertensione (70%) e dislipidemia (55%).

Un follow-up clinico di 30 giorni dopo l'angioplastica degli arti inferiori è stato effettuato. La percentuale di sottopopolazioni MPC al basale o alla dinamica dopo l'angioplastica è stata correlata (analisi spearman) con il grado di disfunzione endoteliale, come valutato dall'afta epizootica; e il numero di P MPC di base è stato confrontato tra i pazienti sottoposti o meno all'amputazione degli arti dopo l'angioplastica (U-Mann Whitney). Lo studio ha dimostrato che gli MPC di base sottopopolano CD45+CD34+KDR+ negativamente correlati con l'aftaepizootica (Figura 3A,a sinistra), mentre la variazione degli MPC CD45+CD34+CD133+CD184 + dopo l'angioplasticaè stata significativamente correlata con il miglioramento dell'afta epizootica(figura 3B, a destra). Inoltre, in quei pazienti che si sono evoluti fino all'amputazione degli arti è stato osservato un aumento del numero di PFC sottopopolazione CD45+CD34+KDR+ (Figura4A,B,a sinistra); così come la riduzione post-angioplastica dei MPC sottopopolazione CD45+CD34+CD133+CD184+ (Figura 4A,C, destra).

Figura 1: Angiografia degli arti inferiori e raccolta del sangue. (A) Traiettoria vascolare evidenziata da mezzi di contrasto sotto fluoroscopia. (B) Ostruzione vascolare prima dell'angioplastica. (C) Ostruzione vascolare dopo angioplastica. (D) Il chirurgo vascolare utilizza un catetere per raccogliere il sangue dal luogo più vicino all'ostruzione vascolare e alla placca dell'ateroma, e il ricercatore di laboratorio è pronto per ottenere il campione di sangue. Le frecce indicano il sito di ostruzioni vascolari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Preparazione del campione di sangue e determinazione delle cellule progenitrici mononucleari (MPC). (A) Preparazione del gradiente di densità. (B) Separazione dell'anello dei linfociti dopo centrifugazione del sangue. (C) Raccolta della fase linfocitaria. (D)Centrifugazione. (E) Formazione di pellet nella parte inferiore della provetta. (F) Numero di sospensioni cellulari. (G) Preparazione di linfociti per la citometria a flusso. (H) Determinazione delle sottopopolazioni cellulari mediante citometria del flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Relazione degli MPC con indicatori emodinamici. (A) Posizione dell'ecografia per acquisire fmd e risultati rappresentativi. (B) Relazione tra le sottopopolazioni di base %MPC (sinistra, CD45+CD34+KDR+; destra, CD45+CD34+CD133+CD184 + )ei valori FMD di base; nonché la relazione di ( C )%MPCdopo l'angioplastica con miglioramento dell'afta epizootica dopo l'angioplastica. Abbreviature: MPC, Cellule Progenitrici Mononucleari; Afta epizootica, dilatazione mediata dal flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: MPC e prognosi dell'amputazione degli arti inferiori dopo l'angioplastica. (A) Immagini rappresentative della citometria a flusso delle sottopopolazioni di MPC. (B) L'associazione delle sottopopolazioni di %MPC di base (sinistra, CD45+CD34+KDR+; destra, CD45+CD34+CD133+CD184 +) o(C) %MPC dopo l'angioplastica, con amputazione degli arti inferiori dopo l'angioplastica, durante un follow-up di 30 giorni. Abbreviature: MPC, Cellule Progenitrici Mononucleari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Classificazione di Rutherford della gravità dell'ischemia degli arti. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.