Rilevamento ad occhio nudo di rare mutazioni puntiformi nel DNA

Sommario

Questo protocollo consente l'identificazione ad occhio nudo di DNA puntiforme mutato in un eccesso di 200 volte di molecole di DNA wild type, sfruttando nanoparticelle d'oro e microparticelle paramagnetiche.

Abstract

Il protocollo descrive un test colorimetrico ad occhio nudo per la rilevazione di mutazioni puntiformi somatiche in un eccesso di DNA wild type. L'applicazione futura prevista del metodo è l'identificazione di mutazioni rare nel DNA libero da cellule circolanti da biopsie liquide, con una rilevanza nella diagnostica del cancro e nella stratificazione dei pazienti oncologici per la terapia personalizzata. Come prova di concetto, il test è stato progettato per rilevare la mutazione BRAF^V600E nel gene BRAF, che è importante per identificare il sottogruppo di pazienti con melanoma che possono beneficiare di terapie mirate con inibitori di BRAF. Tuttavia, questo test colorimetrico può essere facilmente generalizzato ad altre mutazioni somatiche di rilevanza clinica grazie all'uso di sonde di rilevamento universali, fornendo così un forte potenziale nella diagnostica oncologica.

Il test rileva lo 0,5% di BRAF^V600E in un eccesso di BRAF^WT DNA, che corrisponde alla sensibilità di alcuni test strumentali commerciali. Tale sensibilità è clinicamente rilevante per scopi diagnostici, consentendo l'identificazione precoce dei pazienti sensibili ai farmaci. A differenza dei test commerciali basati sulla PCR in tempo reale, questo test richiede una strumentazione e un'elaborazione minime, in quanto può essere eseguito su DNA amplificato con una PCR standard (o tecniche isotermiche) e fornisce una lettura ad occhio nudo con una reazione in una provetta di pochi passaggi in una sola ora. Attualmente, il test è stato utilizzato solo su campioni di DNA sintetico. Tuttavia, questi ultimi sono stati progettati per imitare un campione reale amplificato dal DNA libero circolante, per favorire la traduzione del test in diagnostica clinica.

Introduzione

Lo scopo del metodo è quello di rilevare mutazioni puntiformi sottorappresentate in un campione di DNA con una metodologia minimamente strumentata e una lettura ad occhio nudo. L'obiettivo finale è quello di disporre di un test proof-of-principle, adatto per future applicazioni in test rapidi per la rilevazione di mutazioni somatiche nel DNA libero da cellule circolanti (ccf-DNA) (ad esempio, da campioni di biopsia del sangue) per la diagnosi precoce e il monitoraggio del cancro¹. Le mutazioni somatiche correlate al cancro rappresentano un importante biomarcatore tumorale² e sono present....

Protocollo

1. Sintesi di sonde di nanoparticelle d'oro

1. Sintetizzare nanoparticelle d'oro ricoperte di citrato da 40 nm, utilizzando il metodo di crescita della semina standard in due fasi come descritto di seguito.
   1. Sintetizzare nanoparticelle d'oro ricoperte di citrato da 15 nm (semi di AuNPs) utilizzando il classico metodo Turkevich-Frens^13,14.
      1. Lavare tutta la vetreria con acqua regia (HCl:HNO₃ in rapporto 3:1 v/v).
      2. Scaldare 250 ml di 0,25 mM di HAuCl₄ per far bollire mescolando uniformemente.
         ATTENZIONE: HAuCl_4<....

Risultati

Questo metodo è stato utilizzato per la rilevazione della mutazione BRAF^V600E in un eccesso di DNA sintetico BRAF^wt. Nella Figura 1 vengono illustrati i dettagli della strategia di rilevamento. Il test dà un risultato colorimetrico SI/NO^17,18 dove il rosso corrisponde a un risultato positivo (YES) e il giallo a uno negativo (NO).

In breve, le microparticelle paramagnetiche streptavidi.......

Discussione

L'aspetto centrale del metodo è la capacità di discriminare un DNA bersaglio nel contesto di un eccesso di DNA non bersaglio interferente, dove il DNA bersaglio e non bersaglio differiscono solo per un singolo nucleotide. Pertanto, la progettazione delle sonde e le condizioni di ibridazione sono fondamentali per ottenere una discriminazione sensibile. Il test è progettato per utilizzare sonde colorimetriche universali per essere adattato alla rilevazione di eventuali mutazioni puntiformi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Centrifuga da banco - Allegra X 30	Beckman Coulter	A99473
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germania	D0632-25G
Dynabeads M-280 streptavidina microparticelle paramagnetiche	Invitrogen	11205D
Idrossilammina solfato	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germania	379913-25G
KDS 100 Legacy Pompa a siringa	kdScientific	789100
NanoDrop OneC spettrofotometro	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germania	806552-500ML
Pierce™ TCEP-HCl, No-Weigh™	Formato Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)	A35349
Polietilenglicole 600	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germania	202401
PTFE 0,22 &; m filtri, Fluoropore	Millipore	FGLP04700
Quant-iT™ OliGreen&commercio; Kit per il dosaggio del DNA ssD	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)	O11492
Citrato di sodio diidrato	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germania	W302600
Oligonucleotidi sintetici	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Acido tetracloroaurico(III)	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germania	520918
Sonde DNA polyT tiolato Integrated	DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)	Microscopio
Zetasizer Nano S - Sistema di diffusione dinamica della luce	Malvern Panalytical

JEOL JEM 1011